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结核分枝杆菌Rv2626c蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

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中国热带医学 2024年第4期24卷 472-477页

作者：张光磊孙田华吴智远张婷婷胡丽娜王婷李会蒋保余李朋伟焦磊兰州生物制品研究所有限责任公司第三研究室甘肃省疫苗工程技术研究中心甘肃兰州730046

目的构建结核分枝杆菌Rv2626c蛋白的重组表达载体,在大肠埃希菌(Escherichia coli,***)中表达、纯化后研究Rv2626c重组蛋白的抗原性。方法将GenBank公布的结核分枝杆菌H37Rv株Rv2626c蛋白的氨基酸序列(登录号:CCP45424.1)按***密码子偏... 详细信息

目的构建结核分枝杆菌Rv2626c蛋白的重组表达载体,在大肠埃希菌(Escherichia coli,***)中表达、纯化后研究Rv2626c重组蛋白的抗原性。方法将GenBank公布的结核分枝杆菌H37Rv株Rv2626c蛋白的氨基酸序列(登录号:CCP45424.1)按***密码子偏好转换为对应的DNA序列,合成该DNA序列并克隆至pET24a(+)质粒上,构建pET24a(+)-Rv2626c重组质粒,转化至*** BL21(DE3)中,以不同的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactopyranoside,IPTG)浓度、温度和时间条件下诱导表达Rv2626c蛋白,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹法(Western Blot)对Rv2626c重组蛋白进行鉴定。利用镍螯合亲和层析法纯化Rv2626c重组蛋白并将其免疫青紫蓝兔,制备抗Rv2626c抗血清,采用Western Blot和酶联免疫吸附法分别检测抗血清的特异性和效价。结果pET24a(+)-Rv2626c重组质粒构建成功。SDS-PAGE检测显示:转入该重组质粒的***经IPTG诱导后表达Rv2626c重组蛋白,分子量约14500,大小与预期相符;Rv2626c重组蛋白的最佳诱导表达条件为31℃1.0 mmol/L IPTG诱导表达6 h,目的蛋白主要以可溶性形式存在,与Western Blot检测结果一致。Rv2626c重组蛋白免疫青紫蓝兔获得的高免血清特异性良好,经酶联免疫吸附法测定该血清效价为1∶256000。结论在***中成功表达结核分枝杆菌Rv2626c蛋白,且纯化的Rv2626c重组蛋白具有较好的纯度和抗原活性,为进一步揭示其生物学功能奠定基础。

关键词：结核分枝杆菌 Rv2626c重组蛋白抗原活性鉴定

二代测序技术在Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Vero细胞)生产质量控制中的应用

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中国生物制品学杂志 2024年第9期37卷 1109-1114,1121页

作者：李丰茂罗志宇邹江龙喻刚武汉生物制品研究所有限责任公司湖北武汉430207

目的将二代测序(next generation sequencing,NGS)技术应用至Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Vero细胞)(Sabin strain inactivated poliomyelitis vaccine,sIPV)生产质量监控中,以期确保疫苗的安全性和批间一致性。方法将脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)Sabin株Ⅰ型、Ⅱ型和Pfizer株Ⅲ型工作种子批分别接种至生物反应器微载体培养的单层Vero细胞上,33℃培养3~4 d,获得疫苗代次病毒液,每个型别制备3批。提取各型别工作种子批毒种和疫苗代次病毒液RNA,用NGS技术分析基因突变频率、神经毒力决定位点、突变热点及批间一致性。结果3种型别PV工作种子批毒种经培养后,Sabin株Ⅱ型和Pfizer株Ⅲ型比Sabin株Ⅰ型更易发生突变,非编码区神经毒力决定位点突变频率明显上升(t=3.21~5.83,P均0.05)或明显下降(t=6.01~9.62,P均<0.05);Sabin株Ⅱ型毒株的nt869位点及Pfizer株Ⅲ型毒株的nt2493位点各发生1个突变热点,突变方式均为C→T,其中nt2493既是神经毒力决定位点,也是突变热点。3种型别各3批疫苗代次病毒液均具有良好的批间一致性,基因组VP1区域各核酸位点突变频率批间拟合R2为0.947~0.995。结论NGS技术可高效检测sIPV生产过程中PV基因组的突变,且稳定可靠,可用于该疫苗的质量控制。

关键词：二代测序 Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗质量控制突变频率

动态浊度法与热原检查法检测A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗的比较

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中国科技期刊数据库医药 2024年第3期 0165-0170页

作者：陈鑫朱海王晶祁茗雪冯德杰兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃兰州730046

研究A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗生产过程中热原安全性问题,对动态浊度法与热原检查法检测A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗进行比较。方法根据《中华人民共和国药典》2020版(三部) 规定的方法,随机抽取10批次A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗为研究样... 详细信息

研究A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗生产过程中热原安全性问题,对动态浊度法与热原检查法检测A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗进行比较。方法根据《中华人民共和国药典》2020版(三部) 规定的方法,随机抽取10批次A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗为研究样品,分别采用细菌内毒素动态浊度法和热原检查家兔法进行检定。结果 10批A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗热原检查法热原检查均符合规定,动态浊度法能定量检测A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗中细菌内毒素定量检测结果与热原检查家兔法一致。结论细菌内毒素动态浊度法能定量检测A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗中细菌内毒素的含量,在快速检测中优于热原检查法,基于上述的比较研究,表明动态浊度法可作为A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗生产过程控制中热原检查的补充方法,更好地控制产品质量。

关键词： A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗动态浊度法细菌内毒素家兔法热原

SARS-CoV-2 mRNA疫苗通用体外生物学活性检测方法的建立及验证

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中国生物制品学杂志 2024年第3期37卷 322-328页

作者：王新竹赵丹华苏歧刘欣玉姜崴叶强中国食品药品检定研究院北京102629 长春生物制品研究所有限责任公司吉林长春130012

目的建立通用稳定的SARS-CoV-2 mRNA疫苗的体外生物学活性检测方法,并对方法进行验证,以期用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗的质量控制。方法筛选能够对SARS-CoV-2各变异株S蛋白均能较好结合的ELISA试剂盒及转染细胞、细胞铺板浓度、转染剂量,建... 详细信息

目的建立通用稳定的SARS-CoV-2 mRNA疫苗的体外生物学活性检测方法,并对方法进行验证,以期用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗的质量控制。方法筛选能够对SARS-CoV-2各变异株S蛋白均能较好结合的ELISA试剂盒及转染细胞、细胞铺板浓度、转染剂量,建立SARS-CoV-2 mRNA疫苗体外生物学活性检测方法,并进行验证。结果筛选到1种对各变异株S蛋白均能良好结合的试剂盒,并确定了转染细胞为HEK293T、细胞铺板浓度为2.5×10^(5)个/mL、转染剂量为6孔板4μg/孔,建立了通用稳定的SARS-CoV-2 mRNA疫苗体外生物学活性检测方法。验证结果显示,该方法能满足检定需求。结论建立的SARS-CoV-2 mRNA疫苗体外生物学活性检测方法相对准确度、线性、中间精密度、范围良好,可用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗的质量控制。

关键词： SARS-CoV-2 mRNA疫苗体外生物学活性酶联免疫吸附测定

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响应面法优化鼠细小病毒悬液制备及滴度测定

生物技术 2024年第5期 548-554+581页

作者：郭慧是翡史云凤王闽佳吴玮李冬梅上海生物制品研究所有限责任公司研发部

[目的]研究鼠细小病毒（MMV）感染性滴度测定方法，同时制备高滴度的MMV。[方法]通过Box-Behnken设计-响应面法优化A9细胞制备MMV及MMV感染性滴度测定工艺。[结果]A9细胞的最佳接种浓度、病毒培养时间及病毒吸附时间分别为9×10～3个/孔... 详细信息

[目的]研究鼠细小病毒（MMV）感染性滴度测定方法，同时制备高滴度的MMV。[方法]通过Box-Behnken设计-响应面法优化A9细胞制备MMV及MMV感染性滴度测定工艺。[结果]A9细胞的最佳接种浓度、病毒培养时间及病毒吸附时间分别为9×10～3个/孔、12 d及0 h,所建立的检测方法精密性较好；A9细胞沉淀中病毒滴度高于上清，且随病毒MOI值的升高而逐渐增加，在MOI为0.5时，感染后72 h收获，病毒滴度最高。[结论]Box-Behnken设计-响应面法适用于A9细胞制备MMV及MMV感染性滴度测定工艺。制备的病毒液的平均滴度为6.35TCID50/0.1 mL。

关键词：鼠细小病毒 A9细胞感染复数感染性滴度响应面法病毒悬液上清沉淀

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登革热疫苗研究进展与挑战

中华微生物学和免疫学杂志 2024年第7期44卷 635-640页

作者：孙益明杨会强葛永红中国药科大学生命科学与技术学院南京210000 成都生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究室成都610023

登革热是世界范围内流行最为广泛的虫媒病毒感染性疾病之一,由登革病毒(dengue virus,DENV)感染引起。每年约有3.9亿人感染DENV,其中大约有9600万人会出现临床症状,且每20例患者中就有1例患者可能出现严重的登革热并导致休克、内脏出血... 详细信息

登革热是世界范围内流行最为广泛的虫媒病毒感染性疾病之一,由登革病毒(dengue virus,DENV)感染引起。每年约有3.9亿人感染DENV,其中大约有9600万人会出现临床症状,且每20例患者中就有1例患者可能出现严重的登革热并导致休克、内脏出血和死亡。DENV包括4种血清型(1~4),均可以引起不同程度的疾病。目前,没有特定的针对登革热的治疗药物,只有2种疫苗在一些国家获批使用:CYD-TDV和TAK-003。其中适用于9~45岁人群的疫苗CYD-TDV受到抗体依赖性增强(antibody-dependent enhancement,ADE)效应的影响,可能导致更严重的感染。因此,如何减缓或消除ADE的影响成为当前登革热疫苗研究的一个重要问题。除此之外,DENV非结构蛋白对免疫系统的影响也不可忽视。目前,至少有7种登革热疫苗处于不同的研发和临床试验阶段。本综述将主要介绍3种取得重大进展的候选疫苗,并总结规避ADE效应的方法和以非结构蛋白为免疫原的登革热疫苗研发进展。

关键词：登革病毒登革热疫苗抗体依赖性增强作用非结构蛋白

WHO对我国疫苗生产企业现场检查中变更控制缺陷分析

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中国医药工业杂志 2024年第5期55卷 725-730页

作者：张磊高易娥王凌武汉生物制品研究所有限责任公司湖北武汉430207

文章通过查阅WHO网站公开的检查信息及中国生物共享共治交流的检查信息,整理、汇总了变更管理中的相关缺陷比例、严重程度及来源,分析WHO对我国疫苗生产企业现场检查变更管理相关缺陷及缺陷产生的原因,针对已识别的问题提出应对策略。... 详细信息

文章通过查阅WHO网站公开的检查信息及中国生物共享共治交流的检查信息,整理、汇总了变更管理中的相关缺陷比例、严重程度及来源,分析WHO对我国疫苗生产企业现场检查变更管理相关缺陷及缺陷产生的原因,针对已识别的问题提出应对策略。期望为我国药品生产企业申请WHO药品预认证和紧急使用、完善变更控制体系提供借鉴。

关键词： WHO 现场检查变更控制

国产球状微载体在肠道病毒71型疫苗培养中的应用

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国际生物制品学杂志 2024年第1期47卷 11-14页

作者：张豆郭长福明平刚解庭波喻刚乔建陈金华张义锋宰家敏陈筱亚任彬李月影胡超唐革谷怿恒袁波陈晓琦武汉生物制品研究所有限责任公司肠道病毒疫苗室武汉430207 武汉生物制品研究所有限责任公司新发传染病疫苗室武汉430207 武汉生物制品研究所有限责任公司分包装室武汉430207 武汉生物制品研究所有限责任公司武汉430207

目的研究国产细胞培养用球状微载体应用于肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗生产的可行性.方法采用进口与国产2种微载体于40 L反应器中培养Vero细胞并接种EV71,对比2种微载体的细胞贴壁效率、细胞生长状况、培养病毒的抗原含... 详细信息

目的研究国产细胞培养用球状微载体应用于肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗生产的可行性.方法采用进口与国产2种微载体于40 L反应器中培养Vero细胞并接种EV71,对比2种微载体的细胞贴壁效率、细胞生长状况、培养病毒的抗原含量及病毒滴度的差异.结果在40 L反应器培养阶段,2种微载体中细胞密度(t=1.05,P=0.354)、细胞贴壁效率(t=1.65,P=0.173)以及种毒后96 h病毒滴度(t=0.39,P=0.732)间差异均无统计学意义.在120 h时,国产·微载体上的细胞数量为进口微载体的90.11%.种毒后96 h,国产微载体的抗原含量为进口微载体的89.41%.结论综合对比结果及制造、运输成本,国产微载体具有应用于EV71灭活疫苗生产的可行性.

关键词：球状微载体细胞培养肠道病毒71型灭活疫苗

利用实验设计筛选并优化SARS-CoV-2单抗F61亲和层析阶段工艺参数

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中国生物制品学杂志 2024年第6期37卷 731-738页

作者：孙文泽陈莹詹珊珊邓小杰黄嘉欣王炯宋刚刘建邦桂芳潘勇兵武汉生物制品研究所有限责任公司湖北武汉430074

目的利用实验设计(Design of Experiment,DoE)筛选及优化实验对SARS-CoV-2单抗F61亲和层析工艺参数进行筛选及优化,获得最佳工艺条件。方法选择8个可能在亲和层析中影响实验响应结果的工艺参数并制定其水平范围,利用DoE筛选实验对选择... 详细信息

目的利用实验设计(Design of Experiment,DoE)筛选及优化实验对SARS-CoV-2单抗F61亲和层析工艺参数进行筛选及优化,获得最佳工艺条件。方法选择8个可能在亲和层析中影响实验响应结果的工艺参数并制定其水平范围,利用DoE筛选实验对选择的工艺参数进行8因子2水平筛选实验,通过检测响应值,用统计学软件拟合数学模型,经帕累托图分析获得3个显著影响关键质量属性的关键工艺参数(P<0.05),再选择DoE响应曲面法对关键工艺参数进行优化实验。首先完成全析因实验设计部分,检测响应结果拟合数学模型,分析弯曲项P值判断显著因子的工艺参数范围处于最佳范围内(弯曲P<0.05)后,再根据实验的序贯性补齐中心复合表面设计(central composite face-centered design,CCF)实验,通过检测响应结果拟合响应曲面模型,获得工艺最佳条件范围,最终通过重复试验验证最佳参数值的稳定性。结果在筛选实验中获得在亲和层析阶段影响F61的显著因子为洗脱缓冲液pH、洗脱缓冲液盐浓度、中间淋洗缓冲液盐浓度、平衡缓冲液盐浓度。通过CCF实验最终获得亲和层析中关键工艺参数的最佳条件,当洗脱缓冲液pH为3.2、洗脱缓冲液盐浓度为0.07 mol/L NaCl、中间淋洗缓冲液盐浓度为0.31 mol/L NaCl,F61在亲和层析阶段收率达95.25%,宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量为97.33 ppm,样品单体纯度达98.51%。结论用不同类型DoE方法进行了F61亲和层析阶段工艺参数的筛选和优化,获得了最佳工艺条件,为F61纯化工艺的建立奠定了基础。

关键词：实验设计亲和层析 SARS-CoV-2单抗筛选实验优化实验中心复合表面设计