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中华按蚊气味结合蛋白AsinOBP62基因的克隆、表达及与人体挥发物的结合特性

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应用与环境生物学报 2021年第6期27卷 1601-1608页

作者：何兴菲张嘉俊乔梁陈斌何正波重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所媒介昆虫重庆市重点实验室昆虫与分子生物学研究所重庆401331

嗅觉系统在蚊虫追寻宿主、寻找配偶、选择产卵场所等行为中起着重要的作用,气味结合蛋白与气味分子结合是昆虫嗅觉识别的第一步生化反应.为研究中华按蚊气味结合蛋白在追寻宿主中的作用,通过反转录PCR(RT-PCR)克隆气味结合蛋白62(odoran... 详细信息

嗅觉系统在蚊虫追寻宿主、寻找配偶、选择产卵场所等行为中起着重要的作用,气味结合蛋白与气味分子结合是昆虫嗅觉识别的第一步生化反应.为研究中华按蚊气味结合蛋白在追寻宿主中的作用,通过反转录PCR(RT-PCR)克隆气味结合蛋白62(odorant binding protein 62,AsinOBP62)基因,利用定量PCR分析AsinOBP62在不同组织(触角、喙、下颚须及头胸腹部)、不同发育时期(蛹期、羽化1 d、3 d)和吸血前后的表达水平,通过荧光竞争结合实验测定AsinOBP62蛋白与16种人体气味物质和2种趋避剂的结合能力.结果显示,AsinOBP62基因开放阅读框长507 bp,编码168个氨基酸,具有气味结合蛋白典型的6个保守半胱氨酸残基,属于Classic亚家族成员.定量PCR结果显示,AsinOBP62主要在成蚊触角中表达,羽化后AsinOBP62的表达水平逐渐增强.吸食血液后,AsinOBP62的表达水平显著下降.荧光竞争结合实验显示,在测定的18种气味物质中,AsinOBP62与12种化合物具有结合活性,表明AsinOBP62对人体挥发物具有明显的选择性.其中,与2-甲基吡啶结合能力最强,解离常数K_(i)=34.34μmol/L.根据AsinOBP62基因的表达特点和重组蛋白的结合特性,推断AsinOBP62基因可能在雌蚊追寻宿主的过程中起着重要的作用.

关键词：中华按蚊气味结合蛋白62 基因克隆原核表达人体挥发物结合特性

东亚飞蝗prolixicin基因的克隆与表达分析

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应用与环境生物学报 2013年第2期19卷 236-240页

作者：时红陈斌何正波重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所重庆市动物生物学重点实验室重庆401331

猎蝽素(Prolixicin)是最先发现于长红猎蝽Rhodnius prolixus中的一种抗菌肽.本研究通过分析东亚飞蝗[Locusta migratoria manilensis(Meyen)]转录组数据库,获得东亚飞蝗prolixicin基因的cDNA序列,命名为***全长394 bp,包含一个282 bp的完整开放阅读框,编码93个氨基酸,理论分子量(Mr)为9.97×103.氨基酸序列的N端有一个信号肽,C端有一个富含甘氨酸的G结构域.同源性分析表明LmProx与长红猎蝽的prolixicin同源性最高,一致性为48%,相似性为60%.进化关系分析表明,LmProx与长红猎蝽prolixicin的亲缘关系最近.基因定量分析显示,大肠杆菌刺激后2 h,LmProx的表达明显上调,至8 h表达量达到最高,随后开始缓慢下降,但仍然维持较高的表达水平,直到72 h还显著高于对照.在未经大肠杆菌诱导的东亚飞蝗中,LmProx在脂肪体中的表达水平最高,其次是中肠,在头部和体壁中的表达水平较低;在诱导后的东亚飞蝗中,脂肪体和中肠中的LmProx表达显著增高,而头部和体壁中的表达水平没有变化.研究结果显示LmProx基因在大肠杆菌侵染后,迅速表达,且能持续较长时间的高水平表达,说明LmProx基因在东亚飞蝗的免疫防御过程中起着重要作用;脂肪体和中肠是LmProx基因主要诱导表达的器官.

关键词：东亚飞蝗抗菌肽 prolixicin 实时定量PCR 表达分析

林氏按蚊线粒体全基因组序列的测定及基于线粒体基因组的按蚊属系统发育分析（英文）

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昆虫学报 2019年第1期62卷 101-116页

作者：毛启萌李廷景付文博闫振天陈斌重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所重庆市媒介昆虫重点实验室重庆401331

【目的】对林氏按蚊Anopheles lindesayi完整的线粒体基因组进行测序及分析,依据已知的线粒体基因组构建并讨论按蚊属蚊虫的分子系统发育关系。【方法】对林氏按蚊线粒体基因组进行测序、注释,并对其基本特征和基本组成进行分析。基于... 详细信息

【目的】对林氏按蚊Anopheles lindesayi完整的线粒体基因组进行测序及分析,依据已知的线粒体基因组构建并讨论按蚊属蚊虫的分子系统发育关系。【方法】对林氏按蚊线粒体基因组进行测序、注释,并对其基本特征和基本组成进行分析。基于串联的13个蛋白质编码基因的核苷酸序列和氨基酸序列,用ML法和贝叶斯法构建林氏按蚊和按蚊属其他32种蚊虫的系统发育树,据此探讨按蚊属蚊虫的系统发育关系和系统分类。【结果】林氏按蚊线粒体基因组全长为15 366 bp,包含13个蛋白质编码基因,22个tR NA基因,2个rR NA基因和一段控制区。林氏按蚊线粒体基因组呈现明显的AT偏斜和GC偏斜,AT偏斜为正,GC偏斜为负。除了COX1使用TCG和ND5使用GTG作为起始密码子以外,其他蛋白质编码基因的起始密码子均遵循ATN原则;终止密码子为TAA或者T。除了tR NASer(AGN)以外,其他的tR NA基因均呈现典型的三叶草二级结构。控制区AT含量最高,为94. 54%。滑窗分析显示蛋白质编码基因是用于构建亚属或属水平系统发育关系的最佳分子标记。系统发育树强烈支持塞蚊亚属Cellia、按蚊亚属Anopheles、徕蚊亚属Nyssorhynchus和柯特蚊亚属Kerteszia均为单系群。小五斑按蚊An. atroparvus和四斑按蚊An. quadrimaculatus A这两个种聚到一起,从传统的形态分类上讲,它们和林氏按蚊均属于按蚊亚属按蚊系蚊虫。但本研究构建的4个系统发育树均显示,(小五斑按蚊An. atroparvus+四斑按蚊An. quadrimaculatus A)和林氏按蚊被属于迈蚊系的中华按蚊分开,这为两个系的分类提供了新的论点。【结论】本研究获得了林氏按蚊的完整的线粒体基因组,探析了按蚊属的线粒体基因组特征和系统发育关系,为进一步研究蚊科线粒体基因组和系统发育关系提供了依据。

关键词：蚊科按蚊属林氏按蚊线粒体基因组核苷酸组成系统发育

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中华按蚊CCE家族基因的表达模式分析

昆虫学报 2024年第3期67卷 318-326页

作者：辜昕尧司风玲陈斌重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所媒介昆虫重庆市重点实验室重庆401331

【目的】羧酸酯酶(carboxylesterases,CCEs)是一类重要的水解酶超家族,参与昆虫体内各种外源物质的代谢过程。本研究利用不同发育阶段、不同组织和吸血前后中华按蚊Anopheles sinensis的转录组数据分析CCE基因表达模式,为进一步研究CCE... 详细信息

【目的】羧酸酯酶(carboxylesterases,CCEs)是一类重要的水解酶超家族,参与昆虫体内各种外源物质的代谢过程。本研究利用不同发育阶段、不同组织和吸血前后中华按蚊Anopheles sinensis的转录组数据分析CCE基因表达模式,为进一步研究CCEs在不同生理过程中的潜在功能奠定基础。【方法】以前期从中华按蚊实验室品系转录组数据库中筛选出的50个CCE基因,利用生物信息学分析其在中华按蚊不同发育阶段(卵、1-4龄幼虫、雄蛹、雌蛹、雄成蚊和雌成蚊)、成蚊不同组织(触角、唾液腺、中肠、马氏管、精巢、卵巢、表皮和脂肪体)中以及雌成蚊吸血前和吸血后不同时间(1,3,6,12,24和48 h)的表达模式。【结果】CCE基因主要在幼虫或成蚊阶段高表达或特异性表达;AsAe12,AsAe4和AsBe4在所有发育阶段均高表达。CCE基因的表达具有组织特异性,主要集中在成蚊触角、表皮和精巢中表达;此外,5个CCE基因(AsAe13,AsAe12,AsAe6,AsAe4和AsBe4)在成蚊中肠、马氏管和脂肪体中均高表达,可能与这些解毒器官代谢异生物有关。在雌成蚊吸血后,大多数CCE基因的表达量发生了变化,它们的表达模式也存在差异,这表明血液消化是一个复杂的过程。【结论】本研究结果丰富了中华按蚊CCE基因的知识,为深入探究CCE家族基因在中华按蚊生长发育中的的潜在功能提供有价值的参考。

关键词：中华按蚊羧酸酯酶表达模式发育阶段组织吸血

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蚊科昆虫分类及区系研究历史和现状概述

昆虫学报 2018年第1期61卷 122-138页

作者：付文博陈斌重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所媒介昆虫重庆市重点实验室重庆401331

蚊科昆虫是最重要的医学昆虫类群,是人类最致命的动物杀手。准确的蚊虫分类鉴定是媒介蚊虫基础研究和控制的基础。蚊科现代分类学研究起自于林奈1758年对库蚊属Culex种类的记述,200多年来,已定名的种类日渐增多,分类系统已基本成形。本... 详细信息

蚊科昆虫是最重要的医学昆虫类群,是人类最致命的动物杀手。准确的蚊虫分类鉴定是媒介蚊虫基础研究和控制的基础。蚊科现代分类学研究起自于林奈1758年对库蚊属Culex种类的记述,200多年来,已定名的种类日渐增多,分类系统已基本成形。本文在系统地编制了蚊科昆虫的世界名录和地理分布记录的基础上,概述了世界范围内蚊科昆虫的分类研究历史,属级及以上类群的分类系统、种类及其生物学研究现状,并作了初步讨论和展望。目前,全球已知蚊虫41属201亚属3 573种,其中我国已知20属63亚属419种。按蚊亚科(Anophelinae)被认为是蚊科内单系类群,包括按蚊属Anopheles、白蚊属Bironella和沙蚊属Chagasia 3属11亚属489种。其中,按蚊属已知476种,占按蚊亚科已知种97%,是疟疾的单一传播媒介。库蚊亚科(Culicinae)被认为是一个复系类群,共计11族38属190亚属3 084种,系统发育关系尚未解决。伊蚊族(Aedini)、库蚊族(Culicini)、煞蚊族(Sabethini)和蓝带蚊族(Uranotaeniini)是其中的较大族,分别拥有1 262,800,432和270种。特别是库蚊属Culex、伊蚊属Aedes和曼蚊属Mansonia的许多种类是非常重要的医学媒介昆虫。在所有这些蚊虫种中,东洋区的种类最多,达1 075种;其次为新热带区(951种),非洲区(798种),澳洲区(542种),古北区(251种);新北区分布种类最少,有196种,不少种类跨区分布。这些信息有助于对世界范围内蚊科昆虫分类和分布现状的整体了解。由于隐存种(cryptic species)广泛存在,实际种数应是已定名种数的3~5倍。蚊科昆虫的系统分类对于蚊科昆虫的准确鉴定、基础生物学及蚊媒病传播机制研究、媒介蚊虫及蚊媒病控制都具有非常重要的理论和应用价值,蚊科昆虫的分类、系统发育和区系仍是急需要研究的重要课题。

关键词：蚊科系统分类学支序系统学系统发育区系分布媒介昆虫

中华按蚊含LY结构域的胰蛋白酶基因的分子特征及表达模式分析

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昆虫学报 2021年第9期64卷 1050-1060页

作者：张肖肖雷丹李香盈陈斌重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所媒介昆虫重庆市重点实验室重庆401331

【目的】在全基因组鉴定中华按蚊Anopheles sinensis含LY结构域的胰蛋白酶(LY-trypsin)基因,探究其分子特征、表达模式以及系统发育关系。【方法】以NCBI数据库中冈比亚按蚊***、埃及伊蚊Aedes aegypti、黑腹果蝇Drosophila melanogaste... 详细信息

【目的】在全基因组鉴定中华按蚊Anopheles sinensis含LY结构域的胰蛋白酶(LY-trypsin)基因,探究其分子特征、表达模式以及系统发育关系。【方法】以NCBI数据库中冈比亚按蚊***、埃及伊蚊Aedes aegypti、黑腹果蝇Drosophila melanogaster和致倦库蚊Culex quinquefasciatus胰蛋白酶家族基因的氨基酸序列为询问序列,通过本地Blast搜索鉴定中华按蚊基因组中胰蛋白酶基因,将中华按蚊LY-trypsin基因依据其结构域特征及系统发生关系进行命名LY-trypsin。运用生物信息学方法预测中华按蚊LY-trypsin基因的结构、在scaffold的定位、结构域、系统发育关系,及其在中华按蚊不同发育时期、成蚊不同组织和吸血前后雌成蚊中的表达模式。【结果】在中华按蚊全基因组上共鉴定得到27个中华按蚊LY-trypsin基因;在黑腹果蝇、冈比亚按蚊、致倦库蚊和埃及伊蚊基因组中未鉴定到LY-trypsin基因。中华按蚊27个LY-trypsin基因分别编码329~1125个氨基酸,分子量在36.8~125.5 kD之间,等电点在4.73~8.94间。其中,20个LY-trypsin具有信号肽,信号肽长度在10~62个氨基酸之间。这27个中华按蚊LY-trypsin基因的外显子数为1~5个,内含子长62~20093 bp。这27个中华按蚊LY-trypsin基因被定位在11个scaffold上,其编码蛋白均有YWTD保守基序(LY基序);其中16个LY-trypsin基因所编码的氨基酸序列具有含丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸催化三联体的活性位点。系统发育结果表明,27个中华按蚊LY-trypsin基因聚类为4个分支。在不同发育阶段,半数以上的中华按蚊LY-trypsin基因显示出相似的表达模式,在幼虫阶段均高水平表达;在中华按蚊不同成蚊组织中,LY-trypsin基因均有不同程度的表达;吸血前后雌蚊中仅有个别基因表达,并未发现表达特异性。【结论】本研究在中华按蚊基因组中首次鉴定出LY-trypsin基因,并揭示了这些LY-trypsin基因的分子特征和表达模式,为LY-trypsin基因的进一步研究提供了信息框架。

关键词：中华按蚊胰蛋白酶基因 LY结构域基因组表达模式系统发育

中华按蚊谷胱甘肽-S-转移酶E6(AsGSTE6)的表达纯化与结晶

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昆虫学报 2018年第1期61卷 59-67页

作者：苗娅张甜甜许柏英陈斌重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所媒介昆虫重庆市重点实验室重庆401331

【目的】对中华按蚊Anopheles sinensis谷胱甘肽-S-转移酶E6(As GSTE6)进行初步晶体学研究,为深入研究其空间结构奠定基础。【方法】利用生物信息学软件,首先对中华按蚊As GSTE6进行生物信息学预测和分析;然后进行分子克隆,构建重组子p ... 详细信息

【目的】对中华按蚊Anopheles sinensis谷胱甘肽-S-转移酶E6(As GSTE6)进行初步晶体学研究,为深入研究其空间结构奠定基础。【方法】利用生物信息学软件,首先对中华按蚊As GSTE6进行生物信息学预测和分析;然后进行分子克隆,构建重组子p ET28a-As GSTe6;利用大肠杆菌Escherichia coli原核表达系统进行诱导表达;采用Ni-NTA金属螯合层析和葡聚糖凝胶层析的方法对重组蛋白进行纯化;通过葡聚糖凝胶层析和化学交联的结果分析蛋白的聚合状态;运用坐滴蒸气扩散法对重组蛋白进行结晶筛选。【结果】生物信息学分析结果表明,As GSTE6分子量为25.28 k D,无信号肽和跨膜区,是亲水性蛋白;三级结构预测结果显示,As GSTE6主要由一个小的βαβαββα折叠模式的N端结构域和一个大的全螺旋的C端结构域组成。多重序列比对结果表明,在不同昆虫中GSTE6具有高度保守性。分子克隆得到中华按蚊As GSTE6的编码基因As GSTe6序列,大小为672 bp。在大肠杆菌中As GSTE6主要在上清中有大量表达,为可溶性表达;通过镍柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化出了高纯度且稳定的As GSTE6重组蛋白;凝胶过滤层析结合化学交联的结果证实体外纯化的融合蛋白As GSTE6主要呈二聚体状态;通过晶体筛选获得了As GSTE6的晶体。【结论】运用结晶学的方法获得了As GSTE6的晶体,这为后续解析As GSTE6的三维结构奠定了基础。

关键词：中华按蚊谷胱甘肽-S-转移酶 AsGSTE6 原核表达纯化结晶

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土蜂科线粒体基因组序列测定和分析

昆虫学报 2023年第1期66卷 99-107页

作者：姚余江陈斌李廷景重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所媒介昆虫重庆市重点实验室重庆401331

【目的】本研究旨在通过针尾部(Aculeata)昆虫线粒体基因组系统发育分析认知土蜂科(Scoliidae)的单系性及系统发育位置。【方法】利用Illumina Hiseq2500二代测序技术测序土蜂科3属5种的线粒体基因组,并进行注释和分析;基于针尾部昆虫3... 详细信息

【目的】本研究旨在通过针尾部(Aculeata)昆虫线粒体基因组系统发育分析认知土蜂科(Scoliidae)的单系性及系统发育位置。【方法】利用Illumina Hiseq2500二代测序技术测序土蜂科3属5种的线粒体基因组,并进行注释和分析;基于针尾部昆虫36个线粒体基因组13个蛋白质编码基因(protein-coding genes,PCGs)和2个rRNA基因序列采用最大似然法(maximum likelihood,ML)和贝叶斯法(Bayesian inference,BI)法构建系统发育树。【结果】新测序的土蜂科5个线粒体基因组为五带波壁土蜂Colpa quinquecincta线粒体基因组(GenBank登录号:OM103696),齿石波壁土蜂Colpa tartara线粒体基因组(GenBank登录号:OM103697),厚大长腹土蜂Megacampsomeris grossa线粒体基因组(GenBank登录号:OM103796),台湾大长腹土蜂Megacampsomeris formosensis线粒体基因组(GenBank登录号:OM142776)和斯式土蜂Scolia schrenkii线粒体基因组(GenBank登录号:OM103797),其长度范围为15367~20649 bp,包含37~39个基因[13个PCGs、2个rRNA基因(rrnL和rrnS)和22~24个tRNA基因],AT含量均在75%以上;13个PCGs的起始密码子均为ATN,终止密码子为TAA或T--;与推测的祖先序列不同,新测序的土蜂科5个线粒体基因组出现了复杂的基因重排事件,其主要是基因区trnS1-trnE-trnF-nad5-trnH中一些基因位置的改变和基因区trnI-trnQ-trnM-nad2-trnW-trnC-trnY-cox1-trnL2-cox2-trnK发生的异位倒置,此外,trnF,trnS1,trnE,trnH和nad5基因的位置也发生了改变;13个PCGs的Ka/Ks和核苷酸多样性π均表明cox1是最保守的基因;ML树和BI树的结果均显示土蜂科为单系群,土蜂科与蛛蜂科(Pompilidae)互为姐妹群关系,土蜂科中Colpa属和Scolia属以及Megacampsomeris属和Camposmeris属都表现出了较近的亲缘关系。【结论】本研究初步鉴定了土蜂科线粒体基因组的特征,为进一步的研究奠定了基础,基于线粒体基因组的系统发育分析显示土蜂科是一个单系。

关键词：土蜂科线粒体基因组基因重排核苷酸多样性纯化选择系统发育关系

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疟疾媒介中华按蚊触角感器的扫描电镜观察

昆虫学报 2019年第3期62卷 312-322页

作者：张静张晶晶史宗畔闫振天陈斌何正波重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所媒介昆虫重庆市重点实验室重庆401331

【目的】明确中华按蚊Anopheles sinensis雌成虫与幼虫触角感器的类型、形态和分布。【方法】利用光学显微镜观察中华按蚊成虫与幼虫触角的形态结构,利用扫描电镜观察触角上的感器类型、形态和分布。【结果】中华按蚊雌成虫触角由柄节... 详细信息

【目的】明确中华按蚊Anopheles sinensis雌成虫与幼虫触角感器的类型、形态和分布。【方法】利用光学显微镜观察中华按蚊成虫与幼虫触角的形态结构,利用扫描电镜观察触角上的感器类型、形态和分布。【结果】中华按蚊雌成虫触角由柄节、梗节和鞭节组成,鞭节有13个亚节。触角上共发现4种类型的感器,分别为毛形感器(锐型和钝型)、刺形感器(大型和小型)、锥形感器(Ⅰ型和Ⅱ型)和腔锥形感器(大型和小型)。雌成虫触角各类感器总计约1 135.67±86.75个,其中毛形感器数量最多(662.00±6.22个),随后是刺形感器(294.67±33.35个)和锥形感器(146.00±42.39个),腔锥形感器数量最少(36.50±5.90个)。毛形感器、刺形感器和锥形感器在鞭节的每个亚节均有分布,而大型腔锥形感器在第9-11亚节没有分布,小型腔锥形感器仅分布于第13节的顶端。幼虫触角的鞭节不分亚节,呈管状,触角末端有一个感觉锥,鞭节上分布有与成虫锥形感器相似的锥形凸起,初步定名为类锥形感器,其数量和大小随幼虫龄期的增长而显著增加,锥体表面的凹槽越来越明显,其功能还需要通过超微结构和电生理等研究进一步确定。【结论】本研究对中华按蚊幼虫和雌成虫触角感器的形态特征、类型、数量及其分布进行了观察和分析,结果为进一步研究中华按蚊感器的生理功能奠定了基础。

关键词：中华按蚊触角形态感器超微结构扫描电镜