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日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗诱导BALB/c鼠脾细胞增殖、亚群及细胞因子的动态变化

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南方医科大学学报 2015年第2期35卷 202-207页

作者：谭建蓉李文桂覃婷重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所重庆400016

目的观察日本血吸虫重组Bb（p GEX-Sj32）疫苗诱导免疫鼠脾细胞免疫应答的动态变化,探讨该重组疫苗的免疫机制。方法 88只BALB/c鼠随机分为口服组和滴鼻组,口服组小鼠经口服单次接种106克隆形成单位（CFU）重组疫苗,滴鼻组小鼠经滴鼻单... 详细信息

目的观察日本血吸虫重组Bb（p GEX-Sj32）疫苗诱导免疫鼠脾细胞免疫应答的动态变化,探讨该重组疫苗的免疫机制。方法 88只BALB/c鼠随机分为口服组和滴鼻组,口服组小鼠经口服单次接种106克隆形成单位（CFU）重组疫苗,滴鼻组小鼠经滴鼻单次接种105CFU重组疫苗;于免疫后0~20周内间隔2周每组随机剖杀4只小鼠,取脾并制备脾细胞悬液,分别经未刺激（脾细胞悬液）、Sj AWA刺激和Con A刺激培养。MTT法检测脾细胞增殖效率,流式细胞术检测脾CD4＋T细胞和CD8＋T细胞亚群变化,双抗体夹心ELISA法检测培养上清液中TNF-α、IL-10和IL-12表达水平。结果与0周相比,未刺激、Sj AWA刺激和Con A刺激时,口服组和滴鼻组脾细胞均分别在免疫后2~16周和2~18周发生极显著增殖（P〈0.01）;两组CD4＋T细胞亚群均于免疫后2~12周显著升高（P〈0.01）,CD8＋T细胞亚群在观察期间升高不明显;不同培养条件下,口服组脾细胞因子TNF-α、IL-10和IL-12水平均分别在免疫后2~14周、2~18周和2~14周升高,于8周、10周和6周达峰值;滴鼻组3者分别在免疫后2~14周、2~18周和2~18周升高,于8周、10周和8周达峰值。结论日本血吸虫重组Bb（p GEX-32）疫苗可诱导小鼠产生有效的免疫应答。

关键词：日本血吸虫两歧双歧杆菌重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗脾细胞增殖 T细胞亚群细胞因子

细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导小鼠免疫应答的研究

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细胞与分子免疫学杂志 2010年第8期26卷 750-753,757页

作者：叶艳菊李文桂重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所

目的：探讨细粒棘球绦虫（Eg）转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导BALB／c小鼠产生的免疫应答及其对Eg原头节攻击感染的保护性作用。方法：热絮凝法提取转基因苜蓿的叶蛋白，再用无菌双蒸水将叶蛋白提取液的浓度配制成20g／L。分别用100... 详细信息

目的：探讨细粒棘球绦虫（Eg）转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导BALB／c小鼠产生的免疫应答及其对Eg原头节攻击感染的保护性作用。方法：热絮凝法提取转基因苜蓿的叶蛋白，再用无菌双蒸水将叶蛋白提取液的浓度配制成20g／L。分别用100μL灌胃和10灿滴鼻免疫小鼠，每3d免疫1次，连续免疫2个月。同时设转空质粒（pBI121）苜蓿叶蛋白及正常苜蓿叶蛋白对照组。末次免疫后8周，用Eg原头节腹腔注射进行攻击感染（50个Eg原头节／每鼠），感染后24周剖杀小鼠，分离并称重细粒棘球蚴组织，计算囊重减少率；采眼球血，常规ELISA检测血清中IgG及其亚类和IgE水平；取脾，分离脾细胞，流式细胞术（FCM）检测脾CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞亚群的百分比；脾细胞体外经脾细胞悬液或加入殴粗抗原（EgAg）、伴刀豆球蛋白A（ConA）或脂多糖（LPS）刺激培养后，四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测免疫小鼠脾T淋巴细胞增殖情况，AnnexinV—FITC和碘化丙啶（PI）双染色法检测脾细胞的凋亡发生率，常规ELISA法检测脾细胞培养上清液中IL—12、IL-10、IFN—γ和TNF—α水平。结果：与正常蛋白对照组相比，疫苗口服接种组小鼠检获包囊质量明显降低，囊重减少率为64．1％，脾细胞凋亡发生率明显降低，脾T细胞增殖水平、CD4^＋T细胞亚群的百分比和CD4^＋／CD8^＋比值显著升高，血清中IgG、IgG2b和IgE水平显著升高，脾细胞培养上清液中IFN-γ、1L-12和TNF—α水平显著增高，IL-10水平明显降低。结论：细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗口服接种可抑制免疫鼠脾细胞发生凋亡，诱导免疫鼠脾T细胞增殖，产生Th1型细胞免疫应答以对抗瞻原头节的攻击感染，CD4^＋T细胞亚群、IgG、IgG2b和IgE在疫苗诱导的保护力中起重要作用。

关键词：细粒棘球绦虫转基因植物脾细胞凋亡细胞因子

Construction and primary characterization of Echinococcus multilocularis protoscolex cDNA expression library

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Chinese Medical Journal 2001年第2期114卷 12-15,103页

作者：李淑萍陈雅棠重庆医科大学传染病与寄生虫病研究所重庆400016

Objective　To construct a λgt11 cDNA expression library of Echinococcus multilocularis protoscolex isolated in China. Methods　Echinococcus multilocularis protoscolex mRNA was extracted using a Quickprep MicromRNA purification kit based on combining of the disruptive and protective properties of guanidinium thiocyanate (GTC) with the speed and selectivity of oligo (dT)-cellulose chromatography in a spum-column with some modification. Purified mRNA (1.8 μg) was submitted to reverse transcription using random hexamers ［pd(N6)］. The double-strand blunt-ended cDNAs were ligated with an EcoRI/NotI adaptor to form a cohesive EcoRI end. Subsequently the synthesized cDNA was inserted into vector λgt11 EcoRI arms. After being packaged in vitro, λgt11 was put to an infectious bacteria Echinococcus coli (***) strain Y1090; the recombinants were screened by color selection. PCR amplification was performed to evaluate the size of insertion DNA ***　The recombinant ratio was nearly 100% and approximately 1×106 clones could be derived from this λgt11 cDNA library. PCR results indicated that the insertion DNAs were about 1.48 kb. Conclusions　A λgt11 cDNA expression library consisting of a million recombinant clones has been constructed from Echinococcus multicularis protoscolex mRNA. Further studies on this library are deserved.

关键词： echinococcus multicularis · protoscolex λgt11 cDNA library clone

多房棘球绦虫混合重组BCG—EmⅡ／3和BCG-Em14—3—3疫苗免疫小鼠后IgG及其亚类和IgE的动态观察

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中国地方病学杂志 2009年第3期28卷 280-282页

作者：李文桂王鸿朱佑明杨梅重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所寄生虫病研究室 400016

目的动态观察多房棘球绦虫混合重组BCG—EmⅡ／3和BCG—Em14—3—3疫苗免疫小鼠后IgG及其亚类和IgE的变化。方法12～14周龄、体质量20～25g的雌性Balb／c小鼠40只，鼻腔内接种上述疫苗，在0、2、4、6、8、10、12、14、16和18周按体质量... 详细信息

目的动态观察多房棘球绦虫混合重组BCG—EmⅡ／3和BCG—Em14—3—3疫苗免疫小鼠后IgG及其亚类和IgE的变化。方法12～14周龄、体质量20～25g的雌性Balb／c小鼠40只，鼻腔内接种上述疫苗，在0、2、4、6、8、10、12、14、16和18周按体质量随机剖杀4只小鼠，经眼球取血，常规酶联免疫吸附试验法测定血清中IgG及其亚类和IgE水平。结果Balb／c小鼠的血清IgG、IgG2a和IgG2b水平均在免疫后第2～18周升高，并分别在免疫后第10、4和4周达到最高水平，其值分别为0．095±0．033、0．022±0．001和0．023±0．003，与0周（0．030±0．013、0．012．4-0．004和0．013±0．004）比较，差异有统计学意义（q值分别为2．95、4．87和2．81，P〈0．05或〈0．01）；血清IgG1、IgG3和IgE水平均在免疫后2～18周降低，并分别在免疫后4、2和6周达较低水平，其值分别为0．03±1．004、0．136±0．002和0．114±0．002，与0周（0．192±0．007、0．175±0．013和0．024±0．003）比较，差异有统计学意义（q值分别为5．16、4．93和5．32，P〈0．05或〈0．01）。结论多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ／3和BCG--Em14—3—3疫苗在免疫早期即可诱导小鼠产生辅助性T细胞（TH）Ⅰ型保护性免疫反应。

关键词：棘球蚴病肝 BCG—EmⅡ//3疫苗 BCG—Em14—3—3疫苗受体 IgG 受体 IgE

日本血吸虫重组两歧双歧杆菌pGEX-Sj14-3-3疫苗构建及鉴定

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中国地方病学杂志 2011年第4期30卷 357-360页

作者：张宁李文桂重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所寄生虫病研究室 400016

目的构建日本血吸虫重组双歧杆菌属两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum,Bb）pGEx-Sj14-3-3疫苗,并进行鉴定.方法从日本血吸虫成虫中提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj14-3-3抗原编码基因.将Sj14-3-3基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌... 详细信息

目的构建日本血吸虫重组双歧杆菌属两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum,Bb）pGEx-Sj14-3-3疫苗,并进行鉴定.方法从日本血吸虫成虫中提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj14-3-3抗原编码基因.将Sj14-3-3基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-Sj14-3-3.用重组质粒将大肠埃希菌BL21（DE3）转化为感受态细胞,抽提重组质粒进行双酶切,鉴定载体片段和基因片段长度：采用电穿孔法,用重组质粒pGEX-Sj14-3-3转化Bh,构建Bb（pGEX-Sj14-3-3）疫苗,抽提疫苗的质粒进行PCR鉴定,比较重新构建的pGEX-Sj14-3-3基因片段长度与日本血吸虫成虫中Sjl4-3-3基因片段长度是否相同.结果 RT-PCR扩增出的日本血吸虫成虫Sj14-3-3基因片段长度为399 bp;双酶切鉴定,重组质粒pGEX-Sj14-3-3载体片段长度为4947 bp,Sj14-3-3基因片段长度为399 bp;在重组的Bb（pGEX-Sj14-3-3）疫苗中,得到Sj14-3-3基因片段长度为399 bp,与预期的结果一致.结论成功构建了日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj14-3-3）疫苗.

关键词：血吸虫,日本两歧双歧杆菌质粒疫苗

双氢青蒿素对大鼠体内卡氏肺孢子虫作用的超微结构研究

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中国人兽共患病学报 2004年第Z1期21卷 78-79页

作者：李文桂陈雅棠刘成伟余登高重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所重庆重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所重庆重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所重庆重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所重庆

　　双氢青蒿素(dihydroartemisinin;DHA)是用硼氢化钠还原青蒿素而形成的一种衍生物,我们发现DHA对卡氏肺孢子虫肺炎(Pneumocys"s Carin"Pneumonia;PCP)有较好的治疗作用,但尚不清楚其作用机理.因此,我们采用形态学方法研究DHA对PCP大... 详细信息

　　双氢青蒿素(dihydroartemisinin;DHA)是用硼氢化钠还原青蒿素而形成的一种衍生物,我们发现DHA对卡氏肺孢子虫肺炎(Pneumocys"s Carin"Pneumonia;PCP)有较好的治疗作用,但尚不清楚其作用机理.因此,我们采用形态学方法研究DHA对PCP大鼠肺内卡氏肺孢子虫(PneumocystisCarinii;Pc)超微结构的影响,从而为阐明DHA的作用机理提供重要的基础资料.……

关键词：双氢青蒿素大鼠体内卡氏肺孢子虫肺炎作用机理还原青蒿素治疗作用硼氢化钠基础资料方法研究超微结构衍生物形态学肺内

细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗免疫小鼠后脾细胞亚群的动态观察

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中国地方病学杂志 2009年第1期28卷 54-57页

作者：李文桂朱佑明王鸿重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所寄生虫病研究室 400016

目的动态观察细粒棘球绦虫重组BCG—Eg95疫苗免疫小鼠后脾细胞亚群的变化。方法将120只Balb／e小鼠按体质量随机分为3组：鼻腔内接种组、口服灌胃组、对照组。将疫苗分别采用鼻腔内接种和口服灌胃免疫实验组小鼠，对照组单次接种10μ1... 详细信息

目的动态观察细粒棘球绦虫重组BCG—Eg95疫苗免疫小鼠后脾细胞亚群的变化。方法将120只Balb／e小鼠按体质量随机分为3组：鼻腔内接种组、口服灌胃组、对照组。将疫苗分别采用鼻腔内接种和口服灌胃免疫实验组小鼠，对照组单次接种10μ1磷酸盐缓冲液（PBS）于小鼠鼻腔黏膜。在免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18周各剖杀4只小鼠，取脾脏，分离脾细胞，流式细胞仪检测脾CD4＋、CD8＋T淋巴细胞亚群的百分比。结果不同组的小鼠脾细胞CD4＋、CD8＋亚群百分比比较差异有统计学意义（F值分别为21．56、22．08，P〈0．05），不同周数的小鼠脾细胞CD4~,CD8＋亚群百分比比较差异有统计学意义（F值分别为5．75、6．29，P〈0．01）。鼻腔内接种组的脾CD4＋、CD8＋T细胞亚群分别在免疫后6～18、12周升高，在免疫后10、12周达最高水平，其值分别为0．348±0．013、0．090±0．003，与0周（0．230±0．022、0．069±0．015）比较差异有统计学意义（q值分别为7．32、5．32，P〈0．01或〈0．05）；口服灌胃组脾细胞CD4＋、CD8＋T细胞亚群分别在免疫后6～16、8～18周增加．分别在免疫后10、16周达最高水平，其值分别为0．405±0．006、0．096±O．004，与0周（0．230±0．022、0．069±O．015）比较差异有统计学意义（q值分别为7．53、5．35，P〈0．01或〈0．05）。结论CD4＋、CD8＋T细胞亚群在细粒棘球绦虫重组BCG—Eg95疫苗诱导的小鼠免疫应答中起重要作用。

关键词：棘球蚴病疫苗合成脾 T淋巴细胞亚群

细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导小鼠脾细胞亚群的变化

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中国地方病学杂志 2010年第4期29卷 387-390页

作者：叶艳菊李文桂重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所 400016

目的探讨细粒棘球绦虫（Eg）转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠脾CD4＋和CD8＋T淋巴细胞亚群的变化.方法热絮凝法提取转基因苜蓿叶蛋白,用无菌双蒸水将叶蛋白提取液配成20 g/L,同时提取转空质粒（pBI121）苜蓿叶... 详细信息

目的探讨细粒棘球绦虫（Eg）转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠脾CD4＋和CD8＋T淋巴细胞亚群的变化.方法热絮凝法提取转基因苜蓿叶蛋白,用无菌双蒸水将叶蛋白提取液配成20 g/L,同时提取转空质粒（pBI121）苜蓿叶蛋白及正常苜蓿叶蛋白作对照.32只雌性Balb/c小鼠按体质量随机分为4组,每组8只.口服灌胃组：灌胃接种100 μl转基因苜蓿叶蛋白提取液鼻腔黏膜接种组：滴鼻接种10 μl转基因苜蓿叶蛋白提取液空质粒对照组：滴鼻接种10μl转空质粒苜蓿叶蛋白提取液正常蛋白对照组：灌胃接种100μl正常苜蓿叶蛋白提取液.小鼠每3天免疫1次,连续免疫2个月.末次免疫后第8周,各组小鼠用Eg原头节腹腔注射攻击感染（50个/只）,感染后第24周剖杀小鼠,分离脾细胞,用流式细胞仪检测脾CD4＋和CD8＋T淋巴细胞亚群百分比.结果口服灌胃组小鼠脾CD4＋T细胞亚群百分比（0.286±0.009）、CD8＋ T细胞亚群百分比（0.102±0.004）和CD4＋/CD8＋比值（2.814±0.014）均显著高于正常蛋白对照组（0.166±0.018、0.083±0.006、2.019±0.369,P〈0.01或〈0.05）鼻腔黏膜接种组小鼠脾CD4＋T细胞亚群百分比（0.269±0.016）和CD4＋/CD8＋比值（2.955±0.986）与正常蛋白对照组比较明显升高（P均〈0.01）口服灌胃组小鼠脾CD4＋T细胞亚群百分比高于鼻腔黏膜接种组（P〈0.05）空质粒对照组小鼠脾CD4＋、CD8＋T细胞百分比和CD4＋/CD8＋比值（0.169±0.018、0.093±0.019、1.852±0.188）与正常蛋白对照组比较,差异无统计学意义（P均〉0.05）.结论 CD4＋T细胞亚群可能与细粒棘球绦虫转Eg95-Eg31融合基因苜蓿疫苗诱导的小鼠抗Eg原头节攻击感染的保护力有关.疫苗灌胃接种可能是一种较好的免疫途径.

关键词：细粒棘球绦虫植物,基因修饰紫苜蓿淋巴细胞亚群

细粒棘球绦虫转Eg95基因苜蓿疫苗的培育及鉴定

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中国地方病学杂志 2009年第3期28卷 283-287页

作者：叶艳菊李文桂周辉重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所 400016

目的培育并鉴定细粒棘球绦虫转Eg95基因苜蓿疫苗。方法利用转pBI—Eg95质粒的根癌农杆菌LBA440d株介导的苜蓿子叶浸染法，将Eg95基因导入紫花苜蓿基因组，转Eg95基因苜蓿外植体在含有卡那霉素的选择培养基上经愈伤、出芽和生根阶段生长... 详细信息

目的培育并鉴定细粒棘球绦虫转Eg95基因苜蓿疫苗。方法利用转pBI—Eg95质粒的根癌农杆菌LBA440d株介导的苜蓿子叶浸染法，将Eg95基因导入紫花苜蓿基因组，转Eg95基因苜蓿外植体在含有卡那霉素的选择培养基上经愈伤、出芽和生根阶段生长出小苗，最后移栽到装有营养土的花盆中，生长2～3个月，获得完整的转Eg95基因苜蓿疫苗。提取转Eg95基因苜蓿的DNA、RNA及叶蛋白，采用PCR、RT—PCR、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）及Westernblot法进行鉴定。结果PCR、RT—PCR法在471bp处均扩增出目的条带；SDS—PAGE及Westernblot法可见转E驴5基因苜蓿蛋白在相对分子质量约16．5×10^3处出现特异条带，与预期结果相符：Bio—Rad Quantityone系统分析表达效率约占提取总苜蓿叶蛋白的0．06％。结论成功培育出细粒棘球绦虫转Eg95基因苜蓿疫苗。

关键词：细粒棘球绦虫植物基因修饰紫苜蓿疫苗