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PsL5F诱导人未分化甲状腺癌FRO细胞凋亡的机制研究

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四川大学学报（医学版） 2009年第6期40卷 1015-1020页

作者：刘智敏李梨朱小云宋方洲重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室重庆400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心

目的研究半边旗5F(PsL5F)对人未分化甲状腺癌FRO细胞的凋亡诱导及其分子机制。方法用PsL5F处理FRO细胞,MTT法测定其对FRO细胞的生长抑制作用;Annexin V-FITC/PI标记法与流式细胞术联用检测PsL5F对FRO细胞的凋亡诱导;用CM-H2DCFDA和Di OD... 详细信息

目的研究半边旗5F(PsL5F)对人未分化甲状腺癌FRO细胞的凋亡诱导及其分子机制。方法用PsL5F处理FRO细胞,MTT法测定其对FRO细胞的生长抑制作用;Annexin V-FITC/PI标记法与流式细胞术联用检测PsL5F对FRO细胞的凋亡诱导;用CM-H2DCFDA和Di OD6(3)标记在流式细胞仪上分析PsL5F对FRO细胞内活性氧(ROS)水平和线粒体膜电位(MMP)的影响;Western blot方法分析Bax、Cyto C、凋亡诱导因子(AIF)及截断PARP的水平变化;Caspase-3活性用Caspase-3比色分析试剂盒测定。结果PsL5F对FRO细胞具有显著的生长抑制作用,且呈现剂量和时间依赖性;PsL5F可诱导FRO细胞凋亡,表现出在100 mg/L浓度下,磷脂酰丝氨酸(PS)外翻细胞的比例呈时间依赖性逐渐增加;用100 mg/L PsL5F处理FRO细胞,在1 h时细胞内ROS水平即明显升高,ROS抑制剂还原型谷胱甘肽(GSH)可抑制PsL5F诱导的细胞内ROS水平升高和细胞凋亡;100mg/L PsL5F处理可使FRO细胞MMP逐渐降低,GSH可抑制PsL5F诱导的MMP降低;同时,线粒体膜蛋白组分中Bax和细胞液蛋白组分中Cyto C、AIF逐渐增加;PsL5F处理使FRO细胞Caspase-3活性逐渐升高及其作用底物PARP断裂。结论PsL5F对人未分化甲状腺癌FRO细胞的生长抑制作用是通过诱导细胞凋亡进行的。其中,细胞内ROS水平升高起到了非常重要的第二信使作用,线粒体是其作用的重要靶点。细胞凋亡是通过Bax转位到线粒体膜、引起MMP降低、Cyto C和AIF释放到细胞液、激活Caspases级联反应而进行的。

关键词：半边旗5F 未分化甲状腺癌细胞凋亡活性氧线粒体膜电位

肺腺癌A549细胞中TNIK通过Rho/ROCK/LIMK1调控微丝骨架形态

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陆军军医大学学报 2023年第7期45卷 659-666页

作者：孙雪花张莲张春冬陈全重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学免疫学教研室重庆400016 重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室重庆400016

目的探讨肺腺癌A549细胞中TNIK调节微丝骨架形态的分子机制及其联合靶向有丝分裂化疗药物处理对癌细胞增殖与凋亡的影响。方法利用RNA-seq筛选稳定敲减TNIK表达后A549细胞差异表达基因,并分析微丝骨架组装相关基因的表达情况;通过RT-PC... 详细信息

目的探讨肺腺癌A549细胞中TNIK调节微丝骨架形态的分子机制及其联合靶向有丝分裂化疗药物处理对癌细胞增殖与凋亡的影响。方法利用RNA-seq筛选稳定敲减TNIK表达后A549细胞差异表达基因,并分析微丝骨架组装相关基因的表达情况;通过RT-PCR、免疫印迹和双重免疫荧光染色分析TNIK调控微丝-微管骨架系统组装的分子机制,并联用靶向有丝分裂化疗药物紫杉醇处理癌细胞后,检测癌细胞的生长及凋亡情况。结果RNA-seq结果显示,敲减TNIK表达后的差异表达基因与有丝分裂进程密切相关;进一步分析发现TNIK表达可在转录水平显著抑制Rho通路相关基因RhoA/B、ROCK1/2和LIMK1表达(P<0.01),但对Rac与CDC42通路相关基因表达无显著影响。免疫荧光检测发现,敲减TNIK表达导致微丝骨架系统形态紊乱及有丝分裂异常。与对照细胞相比,联合紫杉醇处理的TNIK敲减组细胞增殖下调(P<0.01),而凋亡率显著增加(P<0.01)。结论肺腺癌A549细胞中TNIK通过Rho/ROCK/LIMK1调控细胞微丝-微管骨架系统形态,敲减TNIK可增强化疗药物对癌细胞增殖的抑制作用。

关键词：肺腺癌细胞微丝骨架微管骨架化疗 TNIK

乙型肝炎病毒X蛋白对肝细胞L02增殖及GSK3β表达的影响

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肿瘤 2011年第5期31卷 406-411页

作者：喻垚吴婷婷蒋崇亮焦庆昉冯涛重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室重庆400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的:通过研究乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)对人肝细胞株L02细胞增殖、细胞周期以及细胞中糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)表达的影响,探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关性... 详细信息

目的:通过研究乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)对人肝细胞株L02细胞增殖、细胞周期以及细胞中糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)表达的影响,探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关性原发性肝细胞癌(hepatoccellular carcinoma,HCC)的发生机制。方法:用HBx腺病毒(Ad-HBx)感染人肝细胞株L02细胞后,RT-PCR法检测L02细胞中HBx和GSK3β mRNA表达情况;MTT法检测L02细胞的增殖率变化;FCM法检测细胞周期中各时相所占比例;蛋白质印迹法检测HBx、总GSK3β(total-GSK3β,t-GSK3β)、磷酸化GSK3β(phospho-GSK3β,p-GSK3β)、β-连环素(β-catenin)以及细胞用期蛋白(cyclinD1)等蛋白的表达水平。结果:Ad-HBx感染L02细胞后,HBx的mRNA和蛋白均出现表达,细胞增殖率随着时间的延长而增加;G1期细胞所占比例较对照组减少,S期和G2期细胞比例较对照组增加(P<0.05)。感染Ad-HBx后,t-GSK3β在mRNA和蛋白水平上均无明显变化,而p-GSK3β、β-catenin以及cyclinD1蛋白的表达量增加(P<0.05)。结论:HBx可能通过促进人肝细胞株L02细胞中GSK3β的磷酸化,激活Wnt/β-catenin下游信号通路,从而促进细胞的增殖。

关键词：肝肿瘤,实验性肝炎病毒,乙型糖原合成酶激酶3 细胞增殖 HBx蛋白

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医学蠕虫水通道蛋白研究进展

中国血吸虫病防治杂志 2020年第5期32卷 542-547页

作者：王芬叶彬重庆医科大学基础医学院病原生物学教研室重庆400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心

水通道蛋白是广泛存在于医学蠕虫中的一类可特异性介导水和其他溶质分子跨膜转运的膜内在蛋白,其在促进水跨膜转运、渗透调节、营养物质吸收、有毒代谢产物排出以及抗寄生虫药物转运过程中发挥重要作用,有望成为抗寄生虫疫苗候选分子和... 详细信息

水通道蛋白是广泛存在于医学蠕虫中的一类可特异性介导水和其他溶质分子跨膜转运的膜内在蛋白,其在促进水跨膜转运、渗透调节、营养物质吸收、有毒代谢产物排出以及抗寄生虫药物转运过程中发挥重要作用,有望成为抗寄生虫疫苗候选分子和药物靶点。本文综述了医学蠕虫水通道蛋白的结构特征并探讨其作为抗蠕虫疫苗候选分子和药物靶点的可行性,为新型抗寄生虫疫苗或药物研发提供参考。

关键词：医学蠕虫水通道蛋白疫苗候选分子药物靶点

建立稳定敲减MAP4K4表达的A549细胞系及初步分析

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四川大学学报（医学版） 2022年第4期53卷 611-618页

作者：王茹尹讯张涛孙雪花张春冬重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室重庆400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的分析敲减MAP4K4表达对癌细胞增殖及迁移运动的影响,并探究潜在的分子机理。方法构建稳定敲减MAP4K4表达A549细胞,并综合免疫荧光、细胞增殖与迁移运动等实验方法,检测其亚细胞定位,并分析对照组与敲减组细胞增长及迁移运动变化情况... 详细信息

目的分析敲减MAP4K4表达对癌细胞增殖及迁移运动的影响,并探究潜在的分子机理。方法构建稳定敲减MAP4K4表达A549细胞,并综合免疫荧光、细胞增殖与迁移运动等实验方法,检测其亚细胞定位,并分析对照组与敲减组细胞增长及迁移运动变化情况。结果A549细胞中MAP4K4定位于黏着斑及细胞边缘部位,稳定敲减MAP4K4表达诱导癌细胞成簇生长,阻滞细胞周期进程及细胞迁移运动。进一步分析发现,敲减MAP4K4表达诱导E-cadherin积累而下调N-cadherin,扰乱“钙黏蛋白转换”及上皮-间质转换。最终,对照组与敲减组细胞分别联合顺铂(终浓度为5μmol/L)及紫杉醇(终浓度为20 nmol/L)处理,稳定敲减MAP4K4表达可明显增强化疗药物对癌细胞的杀伤效果。结论A549细胞中MAP4K4可通过调控“钙黏蛋白转换”促上皮-间质转化而调控癌细胞恶性表型及化疗耐药。

关键词：肺腺癌细胞上皮-间质转化钙黏蛋白转换化疗耐药 MAP4K4

A549细胞中DBNLS232磷酸化调控丝状伪足形成及细胞迁移运动

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陆军军医大学学报 2023年第17期45卷 1797-1805页

作者：尹讯张涛李瑶张莲张春冬重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室重庆400016

目的分析脑发育调节蛋白样蛋白(Drebrin-like,DBNL)对肺腺癌细胞迁移运动的影响,及其特异位点磷酸化修饰在丝状伪足形成中的作用。方法基于shRNA表达载体建立稳定敲减DBNL表达的A549细胞,分析其对癌细胞迁移运动的影响;综合利用在线蛋... 详细信息

目的分析脑发育调节蛋白样蛋白(Drebrin-like,DBNL)对肺腺癌细胞迁移运动的影响,及其特异位点磷酸化修饰在丝状伪足形成中的作用。方法基于shRNA表达载体建立稳定敲减DBNL表达的A549细胞,分析其对癌细胞迁移运动的影响;综合利用在线蛋白质组数据库、定点突变和间接免疫荧光分析A549细胞中过表达野生型DBNL及3个位点突变型(S146E、T165E、S232E和S232A)对微丝骨架形态、丝状伪足形成及细胞迁移运动的影响;通过免疫沉淀实验确定A549细胞中S232位点发生磷酸化修饰。结果肺癌细胞中稳定敲减DBNL表达显著抑制细胞迁移运动(P0.05);但3个丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点S146、T165和S232修饰化水平明显上调(P<0.001)。野生型及模拟磷酸化突变体S146E、T165E、S232E过表达在A549细胞中,免疫荧光检测发现S232E富集于膜周凸起,且显著促进癌细胞丝状伪足形成(P<0.001);而表达磷酸化失活型S232A则诱导其弥散状分布在细胞质中,并抑制丝状伪足形成(P<0.01)。最后利用免疫共沉淀及通用型丝氨酸磷酸化抗体证明A549细胞中DBNL的S232位点被磷酸化修饰;并基于在线磷酸化序列激酶预测分析发现,p38和CDK5等激酶是S232位点的潜在修饰激酶。结论肺腺癌细胞A549中磷酸化DBNLS232调控丝状伪足形成并促进细胞迁移运动。

关键词：肺癌脑发育调节蛋白样蛋白磷酸化修饰细胞运动丝状伪足

刚地弓形虫细胞培养上清对人结肠癌细胞sw480增殖与凋亡的影响

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中国人兽共患病学报 2010年第3期26卷 229-234页

作者：高剑叶彬武卫华重庆医科大学病原生物学教研室重庆400016 重庆医科大学分子与肿瘤研究中心

目的观察刚地弓形虫RH株速殖子与人结肠癌sw480细胞系共培养上清对人结肠癌sw480细胞增殖的影响和诱导其凋亡与坏死的情况。方法取对数生长期的人结肠癌sw480细胞(1×106),建立弓形虫RH株速殖子数目分别为2×106、4×106、8×106、16×... 详细信息

目的观察刚地弓形虫RH株速殖子与人结肠癌sw480细胞系共培养上清对人结肠癌sw480细胞增殖的影响和诱导其凋亡与坏死的情况。方法取对数生长期的人结肠癌sw480细胞(1×106),建立弓形虫RH株速殖子数目分别为2×106、4×106、8×106、16×106的共培养模型,观察弓形虫速殖子在sw480细胞中的寄生,提取共同孵育72h后的培养上清,以新鲜培养基稀释为半量,体外作用人结肠癌sw480细胞12h、24h、48h、72h,CKK-8法检测吸光度(A450值)并计算抑制率;Annexin-v-FITC/PI染色细胞后上流式细胞仪检测细胞凋亡与坏死率;琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡DNA条带;透射电镜和荧光显微镜观察细胞形态学改变。结果弓形虫RH株速殖子可在人结肠癌sw480细胞内寄生和增殖。CKK-8法检测结果显示上述共培养上清对sw480细胞增殖抑制率随上清作用时间延长均明显增大,48h最大抑制率达44.55%。流式细胞仪检测显示实验组sw480细胞早期凋亡率和晚期凋亡与坏死率随上清作用时间延长均明显增加,48h早期凋亡率达最高值(11.54%),48h以后早期凋亡率下降,晚期凋亡和坏死率显著上升,72h总死亡率可达46.11%,细胞杀伤效果明显;琼脂糖凝胶电泳显示典型的DNA云梯状条带;荧光显微镜和透射电镜观察到细胞凋亡和坏死典型形态。结论弓形虫RH株速殖子与人结肠癌sw480细胞共培养上清对体外培养的sw480细胞增殖有明显的抑制作用,并可诱导sw480细胞凋亡与坏死。

关键词：弓形虫人结肠癌细胞sw480 培养细胞凋亡

大肠不耐热肠毒素B亚单位佐剂活性相关蛋白的筛选

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中国药理学通报 2016年第12期32卷 1761-1766页

作者：刘林周慧聪王秋娟陈思静马永平重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心生物化学与分子生物学教研室重庆400016

目的通过对大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位相互作用蛋白的分析,探讨LTB佐剂活性的分子机制。方法纯化的LTB蛋白和生理盐水分别处理RAW 264.7细胞,pulldown实验分离与LTB有相互作用的蛋白分子,质谱鉴定这些相互作用蛋白;免疫荧光和Western ... 详细信息

目的通过对大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位相互作用蛋白的分析,探讨LTB佐剂活性的分子机制。方法纯化的LTB蛋白和生理盐水分别处理RAW 264.7细胞,pulldown实验分离与LTB有相互作用的蛋白分子,质谱鉴定这些相互作用蛋白;免疫荧光和Western blot分析验证与LTB相互作用蛋白在细胞内的相互作用。结果通过质谱鉴定了25种可能与LTB存在相互作用的蛋白分子,并构建了其相互作用网络图,筛选出可能与LTB免疫调节作用相关的蛋白分子;免疫荧光结果显示神经节苷脂能阻断LTB进入RAW 264.7细胞内,LTB在细胞内与GM130存在相互作用,而Vimentin在生理状态下与LTB不存在相互作用;LTB处理RAW 264.7细胞12 h后,β-actin表达上调,Hspd1表达无变化。结论 LTB佐剂活性的发挥是通过与免疫细胞表面GM1结合,引起内吞,并以小泡的形式到达高尔基体,通过高尔基体的加工。最终通过与Jup结合进而作用于TCF/LEF,引起Bcl-2、IL-6、Runx3等基因表达的变化,发挥促进T细胞和B细胞的增殖分化及活化、分泌细胞因子及免疫球蛋白的作用。

关键词： LTB RAW 264.7 相互作用蛋白免疫佐剂内吞

两种棘球绦虫的水通道蛋白基因克隆及功能特性的比较

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中国人兽共患病学报 2018年第6期34卷 501-508页

作者：刘许诺王芬吴宏烨李锴范俊杰叶彬重庆医科大学病原生物学教研室重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的探索棘球绦虫水通道蛋白(aquaporin,AQP)在棘球蚴、泡球蚴囊液形成中的作用,为阐明棘球蚴、泡球蚴囊液的形成过程以及筛选棘球蚴病新的药物治疗靶点提供理论依据。方法利用RT-PCR扩增棘球蚴、泡球蚴AQPs基因,构建AQPs体外转录载体,... 详细信息

目的探索棘球绦虫水通道蛋白(aquaporin,AQP)在棘球蚴、泡球蚴囊液形成中的作用,为阐明棘球蚴、泡球蚴囊液的形成过程以及筛选棘球蚴病新的药物治疗靶点提供理论依据。方法利用RT-PCR扩增棘球蚴、泡球蚴AQPs基因,构建AQPs体外转录载体,并在非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞中进行异源表达,以验证其水通道功能。利用生物信息学方法分析两种棘球绦虫水通道蛋白跨膜结构域特点及差异,并对棘球绦虫和人AQPs进行多序列比对,分析棘球绦虫AQPs序列结构与人AQPs的差异。结果通过RT-PCR成功克隆了棘球蚴EgAQP4和EgAQP9、泡球蚴EmAQP4和EmAQP9四个基因,注射了这些基因cRNA的卵母细胞与注射DEPC水的对照组卵母细胞的体积变化率(V/V0)差别无统计学意义(F=1.143,P>0.05),透水系数差别亦无统计学意义(F=1.416,P>0.05),这四个AQPs基因在非洲爪蟾卵母细胞中未表现出水通道的功能。跨膜结构域预测及多序列比对结果表明,与经典的水通道蛋白相比,EgAQP4和EmAQP4虽然N和C末端均位于胞质侧,但跨膜结构域数目为4个,NPA基序替换为NPM和NPT;而EgAQP9和EmAQP9虽然具有2个保守的NPA基序,但跨膜结构域数目为5个,N末端位于胞外侧、C末端位于胞质侧。棘球绦虫AQPs蛋白结构存在的这些差异,可能与其在卵母细胞中未表现水通道蛋白的功能有关。结论两种棘球绦虫基因组中都存在编码AQPs的基因,但这些AQPs基因的功能验证试验未见到水通道功能。该结果可能正好说明了囊液的水分子既不能通过AQPs进入生发层细胞而致使细胞肿胀坏死,也不能以AQPs为通道从生发层细胞转移出囊壁,致使囊液累积、棘球蚴包囊或泡球蚴囊泡体积长大。

关键词：细粒棘球绦虫多房棘球绦虫单房棘球蚴多房棘球蚴水通道蛋白