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毕赤酵母高效表达外源蛋白的分子水平策略

食品与发酵工业 2022年第17期48卷 321-328页

作者：张欣然凌焱杨英军事医学研究院辐射医学研究所北京100850 河北大学生命科学学院河北保定071000

毕赤酵母表达系统具有许多优异特性,并且是目前最成功的外源蛋白表达系统之一。通过近几十年的快速发展,该系统已引起各界的广泛关注,并产生了巨大的经济和社会价值。与其他现有表达系统相比,毕赤酵母在目的蛋白翻译后修饰上有着极大优... 详细信息

毕赤酵母表达系统具有许多优异特性,并且是目前最成功的外源蛋白表达系统之一。通过近几十年的快速发展,该系统已引起各界的广泛关注,并产生了巨大的经济和社会价值。与其他现有表达系统相比,毕赤酵母在目的蛋白翻译后修饰上有着极大优势,已被广泛应用于表达外源蛋白。但是另一方面,由于该系统受包括外源基因的特性、菌种、表达环境和发酵技术等多种因素的影响,,其在不同外源蛋白的表达上也表现出很大差异。该文着眼于分子水平上的基因转录、蛋白质加工、蛋白质降解以及转运分泌4个模块,介绍了利用毕赤酵母表达系统通过优化密码子、高拷贝数外源基因、引导肽筛选、敲除蛋白酶基因、共表达促折叠因子等途径提高外源蛋白表达效率的相关策略,并简要展望了该系统的发展前景,以期为构建高效毕赤酵母细胞工厂提供指导。

关键词：巴斯德毕赤酵母酵母表达系统高效表达分子水平外源蛋白

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弯扭组合变形实验的改进与探讨

实验室研究与探索 2023年第10期42卷 15-18页

作者：朱飞鹏杜宁宇雷冬河海大学力学与材料学院南京211100 河海大学河海里尔学院南京211100

为了提高弯扭组合变形实验装置的应力测量精度,采用3个单片层叠的应变花改进了原有实验装置,实现了同一测点沿不同方向上的应变测量。应用上述改进装置开展了实验测试。结果表明,该改进装置能有效减小主应力、泊松比、扭转切应力和弯曲... 详细信息

为了提高弯扭组合变形实验装置的应力测量精度,采用3个单片层叠的应变花改进了原有实验装置,实现了同一测点沿不同方向上的应变测量。应用上述改进装置开展了实验测试。结果表明,该改进装置能有效减小主应力、泊松比、扭转切应力和弯曲切应力的测量误差(前三者误差都在3%以内),提高了基于电测技术的力学参数测量精度。

关键词：弯扭组合主应力泊松比弯曲切应力应变花

RIK蛋白的重组表达、多克隆抗体制备及其功能的初步研究

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免疫学杂志 2016年第5期32卷 435-440页

作者：张朝璨邝林林蒋望陈桂芳梁小珍上海大学生命科学学院 200444 中国科学院上海巴斯德研究所 200031

目的本研究从MHV68转化得到的小鼠B淋巴瘤细胞中筛选出一种功能尚未明确的蛋白质,暂时命名为RIK。通过对RIK基因克隆、表达和纯化并成功制备其多克隆抗体,并初步探讨其生物学功能,为该蛋白的进一步深入研究奠定基础。方法通过RT-PCR的... 详细信息

目的本研究从MHV68转化得到的小鼠B淋巴瘤细胞中筛选出一种功能尚未明确的蛋白质,暂时命名为RIK。通过对RIK基因克隆、表达和纯化并成功制备其多克隆抗体,并初步探讨其生物学功能,为该蛋白的进一步深入研究奠定基础。方法通过RT-PCR的方法检测B淋巴瘤细胞系和原代B细胞中的RIK m RNA水平,并扩增出RIK的基因片段,采用基因重组技术构建出RIK的原核表达载体,经诱导表达后,利用镍离子柱亲和纯化出RIK重组蛋白,免疫新西兰大耳兔,制备抗RIK多克隆抗体,ELISA和Western blot检测抗体灵敏度和特异性。最后,通过在过表达鼠源RIK的小鼠NIH3T12细胞中,进行MHV68病毒感染实验,初步确定其生物学功能。结果 RT-PCR检测发现RIK在B淋巴瘤细胞系中m RNA水平高于原代B细胞,并且成功构建人源和鼠源重组表达质粒p ET-28a(+)-h/m RIK,实现包涵体形式RIK蛋白的诱导表达纯化和抗体制备,SDS-PAGE和Western blot证实获得的抗RIK多克隆抗体与预期结果一致,能够特异地识别RIK蛋白。同时,研究发现,在小鼠NIH3T12细胞中过表达m RIK蛋白,能够有效的抑制MHV68对该细胞的感染。结论本研究成功实现了RIK的重组表达、抗体制备,并且发现RIK蛋白对于MHV68的感染具有十分有效的抑制作用,实现了对其功能的初步研究,并且为深入研究奠定了基础。

关键词： RIK RT-PCR 重组表达多克隆抗体 MHV68感染

TIPE2分子在结直肠癌发生发展中相关作用的研究

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TIPE2分子在结直肠癌发生发展中相关作用的研究

作者：李君中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所)

学位级别：硕士

TIPE2作为一种免疫负调控因子,在固有免疫和获得性免疫中起到至关重要的作用,同时TIPE2也是理想的癌症标志物和抑癌分子。在结直肠癌病理切片中,我们发现相较于癌旁组织,TIPE2在癌组织中高表达,而在结直肠癌细胞系中表达缺失。为了更深... 详细信息

TIPE2作为一种免疫负调控因子,在固有免疫和获得性免疫中起到至关重要的作用,同时TIPE2也是理想的癌症标志物和抑癌分子。在结直肠癌病理切片中,我们发现相较于癌旁组织,TIPE2在癌组织中高表达,而在结直肠癌细胞系中表达缺失。为了更深入研究TIPE2在结直肠癌发生发展中的影响,我们利用AOM/DSS造模方法构建了小鼠结直肠癌模型,实验结果表明TIPE2小鼠的成瘤率远高于TIPE2小鼠,前者体重丢失比例更高且成瘤个数和大小均高于后者,这与TIPE2是一种抑癌分子的结论相矛盾。我们首先推测是否为造模方式的影响,于是建立了DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型,结果显示,亦是TIPE2小鼠的结肠炎相较TIPE2小鼠更加严重。后续我们验证了TIPE2存在着泛素化修饰现象,并且发现以k63修饰为主,这提示TIPE2的泛素化修饰与其活性或者信号传递等相关。而在实验室前期质谱研究中显示,14-3-3家族蛋白与TIPE2具有相关性,于是我们探究了14-3-3对TIPE2泛素化的影响,发现14-3-3 sigma的表达会降低TIPE2的泛素化。由此,我们推测TIPE2与14-3-3 sigma是否有直接相互作用,但后期通过细胞共定位和免疫共沉淀的研究,我们均未发现两者的直接相互作用。综上所述,我们的研究发现了14-3-3 sigma会抑制TIPE2的泛素化,在AOM/DSS的小鼠结直肠癌模型中,TIPE2的缺失会降低成瘤率,其中的分子机制还需进一步探究。我们也将探究14-3-3 sigma对TIPE2泛素化修饰的抑制作用如何影响TIPE2的蛋白功能和其对结直肠癌发生发展的影响。

关键词： TIPE2 结直肠癌 14-3-3sigma 泛素化小鼠结直肠癌模型

晚发型败血症新生儿外周血中性粒细胞表型研究

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中华围产医学杂志 2019年第5期22卷 316-323页

作者：韩俊彦曹云张晓明陶成武李淑涓复旦大学附属儿科医院新生儿科上海201102 中国科学院上海巴斯德研究所 200031

目的探讨晚发型败血症新生儿中性粒细胞表型分布及其临床意义。方法前瞻性纳入2015年1月至2016年10月入住复旦大学附属儿科医院新生儿科的晚发型败血症患儿42例(早产儿26例,足月儿16例)为病例组,非感染患儿33例(早产儿20例,足月儿13例)... 详细信息

目的探讨晚发型败血症新生儿中性粒细胞表型分布及其临床意义。方法前瞻性纳入2015年1月至2016年10月入住复旦大学附属儿科医院新生儿科的晚发型败血症患儿42例(早产儿26例,足月儿16例)为病例组,非感染患儿33例(早产儿20例,足月儿13例)为对照组。根据疾病的严重程度,将病例组分为重症败血症组(11例)及轻症败血症组(31例)。利用流式细胞术检测中性粒细胞表面CD16及CD62L的表达情况以确定新生儿外周血中性粒细胞亚群分布。采用Wilcoxon秩和检验比较病例组与对照组之间、重症与轻症败血症患儿之间中性粒细胞亚群分布差异,并采用多因素logistic回归分析方法探究中性粒细胞亚群分布与新生儿败血症严重程度间的关系。采用受试者工作特性曲线评估中性粒细胞亚群在败血症严重程度中的诊断价值。结果新生儿外周血中性粒细胞有4个亚群,分别为早期中性粒细胞(CD16^-/CD62L^-)、未成熟中性粒细胞(CD16^-/CD62L^+)、成熟中性粒细胞(CD16^+/CD62L^+)及活化中性粒细胞(CD16^+/CD62L^-)。在对照组新生儿外周血中,以活化中性粒细胞[早产儿为61.1%(20.2%~79.4%),足月儿为47.6%(15.2%~70.1%)]及成熟中性粒细胞[早产儿为35.7%(19.9%~75.8%),足月儿为52.0%(25.6%~82.8%)]为主。与对照组早产儿相比,病例组早产儿外周血中早期中性粒细胞[3.5%(1.7%~9.4%)与1.9%(0.6%~4.0%),Z=-2.501,P=0.012]及未成熟中性粒细胞比例[6.3%(0.7%~45.5%)与0.4%(0.3%~0.7%),Z=-3.878,P<0.001]均明显升高,而活化中性粒细胞比例则明显减低[8.3%(2.3%~49.2%)与61.1%(20.2%~79.4%),Z=2.991,P=0.002];各亚群细胞绝对计数呈现同样的差异。而病例组足月儿外周血中未成熟中性粒细胞绝对计数较对照组足月儿升高[49(18~200)与13(5~36)个/ul,Z=-2.193,P=0.028]。重症败血症患儿外周血早期及未成熟中性粒细胞比例[分别为5.8%(3.4%~17.8%)和23.0%(6.3%~47.0%)]及绝对计数[分别为304(137~1 478)和1 003(487~2 818)个/ul]均较轻症败血症者[分别为3.0%(1.4%~7.3%)和0.9%(0.5%~6.8%),158(53~321)和85(18~275)个/ul]明显升高(P值均<0.05)。多因素logistic回归分析显示,败血症患儿外周血中早期中性粒细胞比例与败血症严重程度有关(OR=1.2,95%CI:1.0~1.4,P=0.012)。受试者工作特性曲线下面积为0.7(95%CI:0.6~0.9),当以外周血早期中性粒细胞比例3.3%为临界值时,对重症败血症诊断价值最高,敏感性为81.8%(95%CI:48.2%~97.7%),特异性为62.3%(95%CI:42.2%~78.2%)。结论新生儿外周血中存在4个亚群中性粒细胞,且可能存在自身活化现象;败血症发生后,早产儿与足月儿中性粒细胞亚群变化不同;早期中性粒细胞比例与新生儿败血症严重程度相关,对重症败血症可能具有预测价值。

关键词：新生儿脓毒症中性白细胞表型

寨卡病毒蛋白NS5甲基化酶 SUMO化修饰研究

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寨卡病毒蛋白NS5甲基化酶 SUMO化修饰研究

作者：黄鹂中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所)

学位级别：硕士

寨卡病毒(ZIKV)的爆发、传播及发病机制尚不完全清楚。将过去不同时间、地点来源的非洲和亚洲ZIKV毒株的序列进行比对,实验室之前的工作发现不同毒株上赖氨酸的分布存在差异。赖氨酸是翻译后修饰(post translational modification,PTM)... 详细信息

寨卡病毒(ZIKV)的爆发、传播及发病机制尚不完全清楚。将过去不同时间、地点来源的非洲和亚洲ZIKV毒株的序列进行比对,实验室之前的工作发现不同毒株上赖氨酸的分布存在差异。赖氨酸是翻译后修饰(post translational modification,PTM)的重要靶点,如泛素化、乙酰化或类泛素化修饰。最近,我们及其他一些学者阐明了某些病毒蛋白附着的类泛素化修饰(SUMO)在病毒周期的不同阶段发挥重要作用。为了找到潜在的SUMO化修饰,我们分别在293T细胞中表达了ZIKV的不同蛋白与标签标记的SUMO蛋白来检测这些病毒蛋白是否有SUMO化修饰。Anupriya的WB图表明ZIKV NS5可以被SUMO化,与近期发现的DENV NS5蛋白可以被SUMO化修饰相一致。NS5蛋白是ZIKV RNA复制的重要组成部分,其C端部分利用RNA依赖性RNA聚合酶实现复制功能,在N端部分利用甲基转移酶(MTase)实现病毒RNA的甲基化。通过序列比对和定点突变,实验室之前的工作在NS5蛋白氨基term鉴定出一个SUMO化作用位点(SUMO interacting motif,SIM),该位点在所有的虫媒病毒中都高度保守,在所有的非洲株和亚洲或美洲株中都可以和SUMO蛋白非共价结合。此外,通过对不同赖氨酸的定点突变,Anupriya鉴定出在NS5蛋白氨基端的一个赖氨酸可以被SUMO化。有趣的是,该位点在亚洲/美洲株上是赖氨酸(K101),但非洲株是(R101)。然而,实验结果显示非洲毒株也可以被SUMO化修饰,这就提示可能不同于亚洲株非洲株可能在其他位点上与SUMO蛋白共价结合。本研究分别在大肠杆菌中表达了野生型和MTase结构域突变型的亚洲株NS5蛋白。我采取了多种方法提升蛋白表达的产量、纯度以及蛋白的稳定性,用不同的纯化标签期望在体外表达纯化出具有正确结构和SUMO化活性的NS5MTase蛋白。在体外进行的SUMO化活性实验证明NS5 MTase可以被SUMO化。并揭示SIM位点残基和K101R位点突变的突变体可以抑制SUMO化反应。这里,我们首次报导了亚洲/美洲株的NS5 MTase中的赖氨酸(K101)可以被SUMO化。ZIKV NS5蛋白的SUMO化对于病毒的复制起着关键作用,并且对神经组织损伤等严重病毒损伤有着重要意义。由于不同的毒株会造成不同的疾病综合征,我们的研究可能只在一定程度上解释病理机制以及ZIKV基因组是如何通过进化逐渐适应从中间媒介到人类宿主。SUMO化的相关体外研究,为研发抗ZIKV的药物提供了可能的有效靶点。

关键词：寨卡病毒体外表达 NS5 甲基化类泛素化

基于病毒全蛋白组序列筛选T细胞表位研发新型寨卡病毒T细胞疫苗

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基于病毒全蛋白组序列筛选T细胞表位研发新型寨卡病毒T细胞疫苗

作者：郑智航中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所)

学位级别：硕士

寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是一种通过蚊媒传播的黄病毒,属于黄病毒科黄病毒属,在热带、亚热带地区广泛流行。自1947年在乌干达寨卡森林首次被发现以来,在全球范围内60多年都未曾爆发流行。2007年,ZIKV在太平洋西部的雅浦岛首次爆发后,... 详细信息

寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是一种通过蚊媒传播的黄病毒,属于黄病毒科黄病毒属,在热带、亚热带地区广泛流行。自1947年在乌干达寨卡森林首次被发现以来,在全球范围内60多年都未曾爆发流行。2007年,ZIKV在太平洋西部的雅浦岛首次爆发后,引起了部分关注;但直到2015年南美洲ZIKV疫情爆发,才受到了国际社会的广泛关注。基于该病毒对全球公共卫生安全造成的重大威胁,2016年ZIKV感染被正式列为全球公共卫生紧急事件,针对它的研究也不断深入。ZIKV表面覆盖包膜,内部核衣壳组成二十面体结构,其基因组为大小约11kb的正义单链RNA。被ZIKV感染后,患者症状一般较轻,包括发热、斑疹、关节痛和结膜炎等,也有研究发现,它与神经系统疾病(如格林-巴利综合征)存在必要关联;更严重的是,先天性ZIKV感染可能导致严重的临床疾病,包括骨骼异常、眼睛视觉病变、小头畸形、脑积水等。ZIKV可能存在的垂直传播、性传播、血液传播等诸多传播途径,也导致ZIKV的防治更为艰难,更易造成严重的公共卫生危机。在ZIKV引起了国际社会的广泛关注后,其疫苗研发也进入了“快车道”。目前,正在研发的ZIKV疫苗种类主要包括减毒活疫苗、灭活疫苗、核酸疫苗、重组疫苗等。而这些正在研发的疫苗都专注于诱导中和性抗体的产生,抗体能够通过中和病毒颗粒近而抑制病毒的复制,但所产生的抗体虽然可能有保护性,但也可能导致病毒感染过程中的抗体依赖性增强(antibody dependent enhancement,ADE)反应的发生。有实验证据显示,ZIKV的抗体能够在体外实验模型中协助登革病毒增强对机体或细胞的感染(ADE),反之亦然。有报道发现ZIKV感染过程中的T细胞反应发挥着重要作用,ZIKV的记忆性CD4+和CD8+T细胞反应在动物模型中被证实具有针对ZIKV的保护作用,而T细胞反应本身没有ADE发生的可能性。本课题通过开发具有保护性,且无ADE风险的T细胞疫苗,研究T细胞疫苗预防病毒感染的可行性以及有效性,进而探究T细胞反应在ZIKV感染过程中所发挥的作用,以及T细胞疫苗在ZIKV感染过程中提供保护作用的机制。ZIKV T细胞表位的确定对T细胞疫苗及T细胞免疫研究有重要作用,因此本课题首先着重于在ZIKV感染小鼠中T细胞表位的确定。我们针对ZIKV的蛋白序列,设计并合成了427条重叠多肽,每条为18个氨基酸长,相邻多肽间重叠10个氨基酸,覆盖病毒蛋白序列全长。利用IFN-γELISPOT试剂盒,我们检测出了63条阳性肽段。通过FACS进一步分析不同T细胞亚群被ZIKV肽段刺激起的细胞因子分泌量,最终确定了11条包含CD4+T细胞表位的肽段,以及19条包含CD8+T细胞表位的肽段。其中7条肽段位于结构蛋白上,21条肽段位于非结构蛋白上。为了聚焦T细胞疫苗、避免抗体反应的干扰,我们利用从非结构蛋白中选择的包含T细胞表位的肽段构建了3种ZIKV T细胞疫苗,包括仅含CD4+T细胞表位的肽段NS2A(95-112),NS2B(13-30),NS2B(37-54),NS2B(93-110),NS3(43-60)。仅含CD8+T细胞表位的肽段NS1(263-280),NS4A(66-83),NS4B(36-53),NS4B(76-93),NS4B(84-101),以及包含CD4+T细胞表位肽段NS2A(95-112),NS2B(13-30),NS2B(37-54),NS2B(93-110),NS3(43-60)与包含CD8+T细胞表位肽段NS1(263-280),NS4A(66-83),NS4B(36-53),NS4B(76-93),NS4B(84-101)的混合。然后我们通过ZIKV感染免疫后的小鼠以验证三种ZIKV T细胞疫苗的保护效果,发现三种ZIKV T细胞疫苗都能给被感染的小鼠提供保护,且同时包含CD4+与CD8+T细胞表位肽段疫苗能提供最佳保护。我们也同时发现ZIKV T细胞疫苗对于清除眼睛、脾脏、肝脏组织内的病毒有很好的效果。通过中和实验、ADE实验,我们确认利用这些T细胞表位肽段进行多次免疫后,在急性感染期既没有中和性抗体的产生,也没有ADE。在进一步的体内杀伤试验中,发现接种了这三种肽段疫苗的小鼠体内均可杀伤用相应肽段共孵育过的靶细胞。同时接种包含CD4+和CD8+T细胞表位肽段疫苗的小鼠表现出最佳的体内杀伤率,达到40.6%的特异性杀伤率。而那些单独使用CD4+或CD8+T细胞表位疫苗免疫的小鼠则分别有24.5%或19.1%的特异性T细胞杀伤率。这些数据表明,由T细胞表位疫苗产生的保护作用,部分是由T细胞介导的细胞毒作用。并且这种保护作用不依赖中和抗体,所以没有诱导ADE的风险。因此,T细胞表位具有开发前景。我们也尝试T细胞疫苗与传统抗体疫苗的组合以提

关键词：寨卡病毒 T细胞疫苗细胞毒作用联合免疫

锌指蛋白CXXC5通过调节肠上皮细胞的增殖修复以控制肠炎的发生

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免疫学杂志 2018年第8期34卷 674-682页

作者：郝从芳谢亚栋马世鑫杜东书肖晖上海大学生命科学学院 200444 中国科学院上海巴斯德研究所 200031

目的探讨CXXC5在炎症性肠病中的潜在功能。方法利用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎模型检测野生型对照小鼠和CXXC5基因敲除小鼠对DSS的敏感性,利用免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR和免疫印迹法分别检测了肠道上皮细胞... 详细信息

目的探讨CXXC5在炎症性肠病中的潜在功能。方法利用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎模型检测野生型对照小鼠和CXXC5基因敲除小鼠对DSS的敏感性,利用免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR和免疫印迹法分别检测了肠道上皮细胞增殖、炎症因子表达和细胞增殖相关通路的激活。结果发现CXXC5基因敲除小鼠比野生型对照小鼠更敏感,呈现严重的肠道组织损伤和高致死率。我们进一步发现CXXC5基因敲除小鼠的肠上皮细胞增殖在修复期非常低,而对照小鼠的肠上皮细胞则大量增殖。虽然炎症因子的表达在2组小鼠中相当,但是我们发现c-MYC蛋白在CXXC5基因敲除小鼠的肠上皮细胞中表达量明显偏低,这可能导致了细胞增殖的减少。结论证明CXXC5能够抑制炎症性肠病的发生,促进肠上皮细胞的损伤修复,因此是控制肠炎发生的一个重要调控子。

关键词：锌脂蛋白CXXC5 肠炎肠上皮细胞细胞增殖

诺如病毒四价疫苗的免疫学评价和GⅡ.4型诺如病毒阻断抗体表位的鉴定

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诺如病毒四价疫苗的免疫学评价和GⅡ.4型诺如病毒阻断抗体表位的...

作者：熊佩中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所)

学位级别：硕士

继轮状病毒疫苗大规模使用后,诺如病毒(Norovirus,NoV)已成为全球病毒性急性胃肠炎的首要病因。诺如病毒具有多个基因型,且不同基因型高度变异,新的毒株的流行对人类健康造成很大威胁,然而目前还没有上市的疫苗和特效药物可用于诺如病... 详细信息

继轮状病毒疫苗大规模使用后,诺如病毒(Norovirus,NoV)已成为全球病毒性急性胃肠炎的首要病因。诺如病毒具有多个基因型,且不同基因型高度变异,新的毒株的流行对人类健康造成很大威胁,然而目前还没有上市的疫苗和特效药物可用于诺如病毒感染的预防和治疗。本研究以开发针对NoV的广谱疫苗为目的,开展了两部分研究工作:(1)基于病毒样颗粒的诺如病毒四价疫苗的免疫学评价;(2)分析诺如病毒主要致病亚型GII.4阻断抗体表位。本研究室前期已经获得了包含诺如病毒GI基因群和GII基因群的GI.1、GII.3、GII.4和GII.17四型的酵母表达菌株。为评价诺如病毒疫苗的免疫原性,在前期工作基础上,利用酵母重组表达系统分别表达制备诺如病毒GI.1、GII.3、GII.4、GII.17的病毒样颗粒,电镜分析显示四个亚型的免疫原均呈现典型的球形颗粒。单价(GI.1或GII.3或GII.4或GII.17)、双价(GI.1&GII.4)或四价(GI.1&GII.3&GII.4&GII.17)候选疫苗分别免疫小鼠,免疫结果显示候选四价疫苗组可在小鼠体内诱发相当于单价免疫组的抗体反应,随着免疫次数的增加特异抗体反应升高,血清体外阻断研究显示四价免疫组能平衡地诱导针对四型诺如病毒的阻断抗体,能够分别阻断四型VLP与PGM(含受体HBGA)的结合,表明GI.1、GII.3、GII.4、GII.17型别间无相互干扰,组合的四价病毒样颗粒疫苗可以作为预防多型别诺如病毒感染的可靠疫苗候选者。GII.4是诺如病毒最主要的致病亚型,也是其中变异最快的亚型,为分析GII.4型历年流行株的抗原特性和阻断表位,本研究运用单克隆抗体结合阻断试验,针对GII.4进行了表位分析,在GII.4特异单抗对GII.4型历年流行毒株的VLPs的抗体阻断实验中发现阻断性抗体GII.4-M5能中和阻断GII.4-2009、GII.4-2012S和GII.4-2012H VLPs结合PGM,而不能中和阻断GII.4-2006a和GII.4-2006b。运用同源重组技术构建了一系列在抗原多变区P2结构域重组的GII.4-2006b和GII.4-2012H的嵌合VLPs,通过分析阻断性抗体对GII.4型嵌合VLPs的识别反应情况,确定了抗体GII.4-M5识别的阻断表位位于VP1上361-375位氨基酸,高度暴露于VP1衣壳蛋白的顶部并靠近受体HBGA的结合口袋,且与HBGA结合位点在374位氨基酸处重合。说明抗体M5识别表位361-375位氨基酸是GII.4主要致病亚型的关键性表位。以上结果证明了基于病毒样颗粒的GI.1-VLP、GII.3-VLP、GII.4-VLP、GII.17-VLP四价重组疫苗是一种有开发前景的具有广谱保护性的诺如病毒候选疫苗,同时也明确了诺如病毒的主要致病亚型GII.4 VLP的关键性阻断表位(VP1上361-375位氨基酸)。

关键词：急性胃肠炎诺如病毒病毒样颗粒四价疫苗阻断抗体表位