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代谢工程改造酿酒酵母高效合成香叶基香叶醇

食品与发酵工业 2024年

作者：尤喜凤彭政张娟江南大学工业生物技术教育部重点实验室江南大学未来食品科学中心江南大学生物工程学院

香叶基香叶醇是一种直链二萜化合物，也是合成多种药物和植物天然产物的重要前体。为实现香叶基香叶醇的高效生产，该研究首先强化甲羟戊酸途径基因表达构建了一株香叶基香叶醇产量为168.0 mg/L的菌株，其次通过引入外源香叶基香叶基焦... 详细信息

香叶基香叶醇是一种直链二萜化合物，也是合成多种药物和植物天然产物的重要前体。为实现香叶基香叶醇的高效生产，该研究首先强化甲羟戊酸途径基因表达构建了一株香叶基香叶醇产量为168.0 mg/L的菌株，其次通过引入外源香叶基香叶基焦磷酸合酶、下调角鲨烯合成竞争途径增加前体的供应，结合敲除不同的调控因子使香叶基香叶醇的产量达到678.2 mg/L，随后通过过表达磷酸戊糖途径基因和增加乙酰辅酶A的供应，为香叶基香叶醇的合成提供更多的辅因子和前体，增加融合基因拷贝数进一步提升香叶基香叶醇的产量至1 116.5 mg/L。最后在5 L生物反应器中补料分批发酵香叶基香叶醇产量达到11.3 g/L，为目前报道的最高水平。该研究为香叶基香叶醇的工业化生产提供了一定的参考，也为萜类天然产物的生物合成提供了有前途的平台。

关键词：香叶基香叶醇酿酒酵母甲羟戊酸途径融合表达代谢工程

调控金纳米花表面凸起的策略及其表面增强拉曼散射活性

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物理化学学报 2024年第4期40卷 184-192页

作者：冯瑞沁樊晔方云夏咏梅江南大学化学与材料工程学院合成与生物胶体教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122

以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)与十二烷基硫酸钠(SDS)通过阳离子架桥形成的拟聚阴离子为软模板,通过改变PVP、SDS和纳米材料前驱体氯金酸(HAu Cl_(4))浓度以及反应时间等因素,调控还原产物金纳米花形貌及粒径。表面张力、电导率、毛细管电泳及Z... 详细信息

以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)与十二烷基硫酸钠(SDS)通过阳离子架桥形成的拟聚阴离子为软模板,通过改变PVP、SDS和纳米材料前驱体氯金酸(HAu Cl_(4))浓度以及反应时间等因素,调控还原产物金纳米花形貌及粒径。表面张力、电导率、毛细管电泳及Zeta电位等实验结果表明PVP-SDS-HAu Cl_(4)形成新的拟聚阴离子,透射电子显微镜和X射线衍射结果表明SDS、PVP和HAu Cl_(4)的较低浓度组合更易获得表面凸起丰富的金纳米花。PVP-SDS拟聚阴离子发挥了二级软模板作用,在PVP(50 g·L^(-1))-SDS(2 mmol·L^(-1))-HAu Cl_(4)(0.25 mmol·L^(-1))溶液中调控合成的金纳米花为{111}晶面为主的面心立方结构,其平均等效粒径为108 nm,且表面上密集分布约16.5 nm的凸起。该金纳米花有较强的表面增强拉曼散射(SERS)活性,探针分子罗丹明6G的SERS信号强度依赖于金纳米花的表面凸起形貌。该研究中金纳米花的SERS增强因子最高达6.71×10^(7),优于同类金纳米花的文献报道水平(106);尽管低于石墨负载的金纳米粒子(1×108)或阳离子软模板合成的金纳米棒(5×109),但成功避免了基质干扰或阳离子强吸附使应用受限。

关键词：金纳米花表面增强拉曼散射纳米凸起拟聚阴离子软模板

节杆菌(Arthrobacter sp.)EpRS66 β-呋喃果糖苷酶重组表达及酶促合成低聚乳果糖

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微生物学通报 2024年第9期51卷 3398-3408页

作者：霍润甜夏伟刘展志吴敬江南大学、生物工程学院、工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学食品科学与资源挖掘全国重点实验室江苏无锡214122

【背景】低聚乳果糖是一种新型的功能性低聚糖,具有改善肠道菌群及提高免疫力等功能,被应用于食品、饲料等行业,市场需求量逐年增加。β-呋喃果糖苷酶对乳糖的受体特异性较高,工业上常用来制备低聚乳果糖,但现有酶种转化率较低、生产成... 详细信息

【背景】低聚乳果糖是一种新型的功能性低聚糖,具有改善肠道菌群及提高免疫力等功能,被应用于食品、饲料等行业,市场需求量逐年增加。β-呋喃果糖苷酶对乳糖的受体特异性较高,工业上常用来制备低聚乳果糖,但现有酶种转化率较低、生产成本较高。【目的】挖掘新型β-呋喃果糖苷酶基因,探究其酶学性质及制备低聚乳果糖的能力。【方法】克隆节杆菌(Arthrobacter sp.)EpRS66的β-呋喃果糖苷酶基因,将其在大肠杆菌(Escherichia coli)中重组表达,研究重组酶的酶学性质,优化其催化制备低聚乳果糖的反应条件。【结果】重组酶的最适温度为40℃,最适pH值为6.0,在pH 5.0−8.0范围内稳定性良好,在40℃的半衰期为20 min。利用重组酶制备低聚乳果糖,以15%蔗糖和15%乳糖为底物,在40℃、pH 6.0及加酶量25μg/mL的条件下反应3 h后转化率最高达到32.2%;而在30%蔗糖和30%乳糖的高底物浓度下,转化率也可达到30.8%。【结论】本研究获得了一种能有效催化形成低聚乳果糖的新型β-呋喃果糖苷酶,为工业化生产低聚乳果糖提供了新的选择。

关键词：低聚乳果糖 β-呋喃果糖苷酶酶学性质酶转化

小白链霉菌中CRISPR-Cas9基因敲除系统的构建与优化

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食品与发酵工业 2024年第14期50卷 10-17页

作者：开朗杨昊朱道君陈旭升江南大学生物工程学院江苏无锡214122 工业生物技术教育部重点实验室(江南大学) 江苏无锡214122

小白链霉菌(Streptomyces albulus)是工业上生产ε-聚赖氨酸的主要菌株。为提高***的ε-聚赖氨酸合成能力,基于诱变和抗性筛选的传统育种方法被普遍应用。然而,由于传统育种存在“疲劳效应”,当前***的育种陷入了瓶颈。为利用代谢工程... 详细信息

小白链霉菌(Streptomyces albulus)是工业上生产ε-聚赖氨酸的主要菌株。为提高***的ε-聚赖氨酸合成能力,基于诱变和抗性筛选的传统育种方法被普遍应用。然而,由于传统育种存在“疲劳效应”,当前***的育种陷入了瓶颈。为利用代谢工程方法进一步提高***的ε-聚赖氨酸合成能力,亟需建立基于CRISPR-Cas9的基因编辑方法。为此,该文以*** GS114为研究对象,以ε-聚赖氨酸合成酶基因pls为靶基因,构建了CRISPR-Cas9基因敲除系统,成功敲除了pls,编辑效率为100%。为进一步提高获得的敲除株数量,对*** GS114结合转移条件进行了系统优化,获得的最优结合转移条件为:供受体比例1∶1,镁离子浓度30 mmol/L,55℃热激孢子10 min,培养20 h后覆盖抗生素。在最优转移条件下,结合转移效率达到2.5×10^(-8),较优化前提高了78%。该研究结果一方面为后续***的代谢工程改造提供了重要工具,另一方面为其他工业链霉菌构建CRISPR-Cas系统提供了重要参考。

关键词：放线菌小白链霉菌 CRISPR-Cas9系统基因敲除

基于组学分析优化兽疫链球菌的透明质酸发酵生产

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食品与发酵工业 2024年第4期50卷 10-16页

作者：胡云箫吴俊俊赵北辰王阳康振糖化学与生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 食品合成生物技术教育部工程研究中心江南大学未来食品科学中心江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

透明质酸具有保湿、润滑等多种生理功能,广泛应用于食品、医药和化妆品领域。目前透明质酸主要依赖于兽疫链球菌发酵生产。然而,遗传背景不清晰等问题,限制了兽疫链球菌作为底盘细胞的相关改造以及透明质酸发酵水平的提升。该研究首先... 详细信息

透明质酸具有保湿、润滑等多种生理功能,广泛应用于食品、医药和化妆品领域。目前透明质酸主要依赖于兽疫链球菌发酵生产。然而,遗传背景不清晰等问题,限制了兽疫链球菌作为底盘细胞的相关改造以及透明质酸发酵水平的提升。该研究首先对兽疫链球菌WSH-24的全基因组和转录组数据进行了测序分析,发现该菌株具有高效的糖酵解和乳酸合成能力,以及不完整的三羧酸循环和多种氨基酸合成途径的缺失。结合生长曲线分析,进一步明确该菌株为缬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和色氨酸4种氨基酸缺陷型。在此基础上,通过外源添加对应的氨基酸使透明质酸产量达到(2.65±0.02)g/L。其次,结合转录组测序数据,确定了维生素B5、维生素B7和维生素B12相关合成基因的转录水平过低。通过外源添加对应的维生素有效提高透明质酸的合成,使其产量达到(2.46±0.07)g/L。最后,通过培养基优化,在3 L发酵罐上透明质酸发酵质量浓度达到5.63 g/L,生产强度为0.31 g/(L·h),相较优化前提高了33.33%。该研究为进一步改造兽疫链球菌WSH-24奠定了基础,为透明质酸的产量提升提供了支撑。

关键词：透明质酸兽疫链球菌全基因组转录组发酵优化

利用代谢工程技术强化肉桂地链霉菌莫能菌素的生物合成

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微生物学报 2024年第9期64卷 3521-3532页

作者：刘旻炜张善飞黄子瑄邢浩博孙付保江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

【目的】莫能菌素(monensin)是由肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)产生的聚醚类抗生素。本研究以肉桂地链霉菌2110为研究材料,利用代谢工程技术开展其重要前体甲基丙二酰CoA合成途径强化的研究,以此提高莫能菌素产量。【方法... 详细信息

【目的】莫能菌素(monensin)是由肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)产生的聚醚类抗生素。本研究以肉桂地链霉菌2110为研究材料,利用代谢工程技术开展其重要前体甲基丙二酰CoA合成途径强化的研究,以此提高莫能菌素产量。【方法】首先过表达巴豆酰CoA还原酶(crotonyl-CoA reductase,CCR)强化乙酰乙酰CoA途径,接着过表达甲基丙二酰CoA变位酶(methylmalonyl-CoA mutase,MCM)强化琥珀酰CoA途径,最后串联过表达CCR和MCM并评估工程菌株的发酵性能。【结果】过表达CCR能促进菌体生长,同时提高莫能菌素产量,摇瓶发酵10 d后过表达菌株的生物量和发酵效价分别提高10.4%和19.0%;过表达MCM未能促进菌体生长,但提高了莫能菌素产量,过表达菌株摇瓶发酵10 d时效价提升9.9%;串联过表达CCR和MCM也使菌株的生物量和发酵效价提高,工程菌株2110-CCR-MCM在摇瓶发酵10d时生物量和发酵效价分别提升9.4%和26.8%,在5L罐上发酵6 d时达到最高的生物量和发酵效价分别为54.6 g/L和11.3 kU/mL,比原始菌株分别增加12.7%和36.2%。【结论】CCR和MCM的确介导了莫能菌素生物合成的关键代谢途径,串联过表达CCR和MCM更有效地促进了莫能菌素的合成。本研究为其他聚酮类化合物高产工程菌株的构建提供技术借鉴。

关键词：肉桂地链霉菌莫能菌素巴豆酰CoA还原酶甲基丙二酰CoA变位酶前体供应串联过表达

采用顶空固相微萃取结合全二维气相色谱飞行时间质谱解析不同等级中高温大曲的挥发性组分差异特征

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食品与发酵工业 2024年

作者：王高伟曹润洁陈双徐岩江南大学生物工程学院酿造微生物与应用酶学研究室安徽古井贡酒股份有限公司

采用定量描述分析和顶空固相微萃取结合全二维气相色谱-飞行时间质谱技术对不同等级的中高温大曲香气感官差异特征和挥发性组分差异特征进行解析。感官描述分析表明一级大曲的烘焙、粮香、木香和烟熏香气比较突出；二级大曲甜香比较突... 详细信息

采用定量描述分析和顶空固相微萃取结合全二维气相色谱-飞行时间质谱技术对不同等级的中高温大曲香气感官差异特征和挥发性组分差异特征进行解析。感官描述分析表明一级大曲的烘焙、粮香、木香和烟熏香气比较突出；二级大曲甜香比较突出；三级大曲的泥土、蘑菇和酸腐味比较突出。在大曲中共鉴定出270种潜在香气化合物，一级大曲中的萜烯类、酯类、醇类和吡嗪类等物质种类较二级和三级大曲丰富。通过显著性分析发现，一级大曲中2，3-二甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、苯乙醛、(E，E)-2，4-壬二烯醛、愈创木酚、香兰素和4-乙烯基愈创木酚等物质含量较为突出；二级大曲中丙酸乙酯和2-辛酮等物质含量较为突出；三级大曲中土味素、2-异丙基-3-甲氧基吡嗪、1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、丁酸和异戊酸等物质含量较为突出。偏最小二乘回归分析结果显示不同等级中高温大曲的感官特征与香气化合物之间有较为明显的关联性。通过对不同等级中高温大曲挥发性组分差异的研究，可为量化评价大曲香气质量以及完善质量评价体系提供参考。

关键词：中高温大曲全二维气相色谱-飞行时间质谱感官分析挥发性组分特征

李渡特香型大曲层次间微生物群落结构与风味物质变化规律研究

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食品与发酵工业 2024年第4期50卷 1-9页

作者：杜姝颖鲍文涛吴立平朱栋才杨涛李杰李国城任聪徐岩江南大学生物工程学院酿造微生物学与应用酶学研究室江苏无锡214122 江西李渡酒业有限公司江西南昌331725

目前对于特香型大曲不同层次间微生物群落结构和数量变化特征,及其与风味物质的关联性尚不清晰。该研究运用绝对定量和相对定量扩增子测序技术,揭示特香型大曲不同层次结构的微生物组成及变化规律,并对主要细菌和真菌的来源进行了溯源... 详细信息

目前对于特香型大曲不同层次间微生物群落结构和数量变化特征,及其与风味物质的关联性尚不清晰。该研究运用绝对定量和相对定量扩增子测序技术,揭示特香型大曲不同层次结构的微生物组成及变化规律,并对主要细菌和真菌的来源进行了溯源分析。同时运用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术(headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS),比较分析大曲不同层次的风味化合物含量。结果表明,曲心的细菌总生物量显著低于曲皮和中层,为曲皮的55%,中层的53%。魏斯氏菌属(Weissella)、乳杆菌属(Lactobacillus)和肠杆菌属(Enterobacter)为曲皮的主要细菌类型,高温放线菌属(Thermoactinomyces)为曲心的特征优势细菌,而糖多孢菌属(Saccharopolyspora)在中层和曲心含量远高于曲皮。伊萨酵母属(Issatchenkia)和丝孢毕赤酵母属(Hyphopichia)为曲皮的主要酵母,曲霉属(Aspergillus)为曲心的优势霉菌。曲心的醇类、醛酮类、吡嗪类和醚酚类的总含量均高于曲皮和中层,而曲皮的酯类的总含量高于曲心。该项研究结果为优化特香型大曲制曲工艺,进而运用生态发酵技术提升大曲品质提供了重要参考。

关键词：特香型大曲微生物群落绝对定量风味化合物微生物溯源

不同来源乳汁外泌体蛋白质及其磷酸化修饰差异分析

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生物化学与生物物理进展 2024年第7期51卷 1697-1710页

作者：刘昌梅胡一帆陈文彦刘丹施杰杨刚龙江南大学生物工程学院无锡214122 江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室无锡214122 四川省内江市农业科学院中药研究所内江641000

目的外泌体是一种由不同类型细胞分泌到胞外的囊泡结构,其粒径范围在30~150 nm,广泛存在于血液、尿液、乳汁等多种生物流体。由于外泌体内部含核酸、脂质、蛋白质等多种生物活性分子,因此被认为是潜在的生物标记物和药物载体。乳汁来源... 详细信息

目的外泌体是一种由不同类型细胞分泌到胞外的囊泡结构,其粒径范围在30~150 nm,广泛存在于血液、尿液、乳汁等多种生物流体。由于外泌体内部含核酸、脂质、蛋白质等多种生物活性分子,因此被认为是潜在的生物标记物和药物载体。乳汁来源的外泌体获取成本低、生物相容性高且免疫原性低,已被广泛应用于药物递送等领域以治疗相关疾病。目前对于乳汁外泌体磷酸化的研究尚未报道。本文旨在对不同来源乳汁外泌体进行磷酸化蛋白质组学分析,以期寻找其中具有特殊功能的通路与蛋白质,为探索寻找更加丰富多样的疾病治疗手段提供思路。方法利用多肽和磷酸化多肽富集技术,分离牛乳、猪乳、羊乳来源外泌体与乳清中样品进行全蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学分析,并结合多种生物信息学工具,分析不同来源乳汁外泌体蛋白质信号通路相关信息。结果从上述3种不同物种乳汁外泌体中鉴定到4191种蛋白质,1640种磷酸化修饰蛋白质以及4064个磷酸化修饰肽段,其中不同物种外泌体蛋白质及其磷酸化修饰的种类均明显高于乳清,且不同物种样品中蛋白质种类差异较大,表明外泌体中蛋白质种类与其来源细胞种类和状态密切相关。结果显示,牛乳来源外泌体蛋白质在吞噬作用(由Fcγ受体介导)通路的富集,羊乳外泌体蛋白质显著富集于神经与免疫相关通路,猪乳外泌体所含蛋白质参与多个生命活动的正/负调控。结论本研究将为不同来源外泌体在疾病靶向治疗和载药方面的应用提供理论依据。

关键词：乳汁外泌体质谱蛋白质组学磷酸化蛋白质组学