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肝细胞局部补体活化对疟原虫红外期发育影响的研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2024年第2期42卷 169-176页

作者：谭涅焦世铭丁艳朱成宇徐文岳陆军军医大学基础医学院病原生物学教研室重庆400038 重庆大学医学院重庆400044

目的探讨肝细胞局部补体对疟原虫红外期发育的影响。方法分别提取Hepa1-6和HepG2-CD81细胞RNA,逆转PCR扩增C3、C3aR1、C5、C5aR1基因。Hepa1-6细胞和HepG2-CD81细胞悬液分别加入蛋白酶和磷酸酶裂解,2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)法测... 详细信息

目的探讨肝细胞局部补体对疟原虫红外期发育的影响。方法分别提取Hepa1-6和HepG2-CD81细胞RNA,逆转PCR扩增C3、C3aR1、C5、C5aR1基因。Hepa1-6细胞和HepG2-CD81细胞悬液分别加入蛋白酶和磷酸酶裂解,2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)法测定蛋白浓度,用蛋白质免疫印迹(Western blotting)测定肝细胞内补体和受体表达情况。将表达红色荧光蛋白(RFP)的约氏疟原虫BY265-RFP株、伯氏疟原虫ANKA株的昆明小鼠供斯氏按蚊吸血,17~19 d后解剖分离斯氏按蚊唾液腺,收集子孢子,在24孔板中按50000个子孢子/孔加入HepG2-CD81细胞(105个/孔)孵育6、12、24 h;另设置共孵育3 h后加入C5aR拮抗剂(40 nnmol/L,每孔500μl)的组别。经4%多聚甲醛固定、封闭,非透膜组加入一抗C3a兔抗人IgG抗体(1∶500)或rC5a兔抗人IgG抗体(1∶500)4℃孵育过夜,加入绿色Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1 h,加入DAPI染色液孵育5 min;透膜组加入一抗UIS4山羊多克隆抗体(1∶500)4℃孵育过夜,加入绿色IFKineTM荧光标记的驴抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1 h,加入CD88兔多克隆抗体(1∶400)4℃孵育过夜,加入红色Dylight 649荧光标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1 h,加入DAPI染色液孵育5 min,激光共聚焦显微镜观察补体在纳虫空泡周围的富集情况。取眼镜蛇毒因子(CVF)腹腔注射至C57BL/6小鼠,为CVF组;并设置C3-/-组(C3全基因敲除C3-/-小鼠)和对照组(C57BL/6小鼠)。取10000个约氏疟原虫子孢子感染各组小鼠,取肝脏提取总RNA后逆转录合成cDNA,荧光定量PCR测定疟原虫18S rRNA含量,肝脏虫荷用18S rRNA的相对含量表示。以尾静脉注射方式,用200个约氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BL/6小鼠)10只、C3aR^(-/-)小鼠10只;1000个约氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BL/6小鼠)5只、C5aR全基因敲除C5aR^(-/-)小鼠6只和肝脏C5aR条件性敲除Alb-cre+/+C5aRflox/flox杂交小鼠5只;1000个伯氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BL/6小鼠)6只和C5aR^(-/-)小鼠6只,感染后3 d开始取尾静脉血,制成薄血膜涂片,吉氏染色后观察,至所有小鼠均出现红内期疟原虫为止。采用Graphpad prism 9.0软件进行统计学分析。正态分布的数据采用t检验比较连续变量,两两差异比较采用单因素方差分析(ANOVA)进行多重比较;非正态分布数据比较采用Mann-Whitney U检验。结果PCR结果可见,Hepa1-6细胞株内扩增出C3(358 bp)、C5(267 bp)及其受体C3aR(222 bp)、C5aR(388 bp)基因;HepG2-CD81细胞株内扩增出C3(202 bp)、C5(220 bp)、C3aR(299 bp)和C5aR(374 bp)基因。Western blotting检测结果发现,两种细胞均有C3、C5、C3aR和C5aR蛋白表达。激光共聚焦显微镜成像可见,细胞核经DAPI染色呈蓝色荧光,约氏疟原虫红外期呈红色自发荧光,非透膜组HepG2-CD81细胞内高表达的C3a和C5a呈绿色荧光,与纳虫空泡分布区域重叠;透膜组C5aR(粉色)与纳虫空泡膜(绿色)重叠;加入C5aR拮抗剂组别的纳虫空泡膜上仍有C5aR表达。约氏疟原虫子孢子感染后,对照组、CVF组、C3-/-组的肝脏虫荷(18S rRNA相对含量)分别为0.954±0.523、0.958±0.231、0.638±0.437,3组间差异均无统计学意义(P>0.05)。约氏疟原虫子孢子感染后,对照组和C3aR^(-/-)小鼠分别在(5.30±0.78)d和(5.30±0.78)d后出现红内期;伯氏疟原虫子孢子感染后,对照组和C5aR^(-/-)小鼠分别在(3.67±0.47)d和(3.83±0.69)d后出现红内期;2组基因敲除小鼠红内期出现时间与对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。约氏疟原虫子孢子感染后,对照组、Alb-cre^(+/+)C5aR^(flox/flox)小鼠和C5aR^(-/-)小鼠红内期的出现时间分别为(4.00±0.00)、(4.00±0.00)、(4.17±0.37)d,差异无统计学意义(P>0.05)。结论肝细胞局部补体活化对疟原虫红外期发育无显著影响。

关键词：疟原虫红外期肝细胞局部补体

新型肠炎沙门菌菌影候选疫苗在小鼠免疫应答和保护功效的评估

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中华微生物学和免疫学杂志 2024年第4期44卷 295-303页

作者：杨慧韩雪杜小春焦红梅郑国军常州市第三人民医院检验科常州213000 扬州大学医学院/转化医学研究院病原生物学教研室扬州225001

目的比较肠炎沙门菌制备的菌影(SE-ghost)通过肌肉注射(肌注)和口服不同免疫途径接种雌性BALB/c小鼠诱导体液和细胞免疫应答的功效。方法用SE-ghost接种BALB/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清中IgG抗体水平和阴道灌洗液IgA抗体水平;流式细... 详细信息

目的比较肠炎沙门菌制备的菌影(SE-ghost)通过肌肉注射(肌注)和口服不同免疫途径接种雌性BALB/c小鼠诱导体液和细胞免疫应答的功效。方法用SE-ghost接种BALB/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清中IgG抗体水平和阴道灌洗液IgA抗体水平;流式细胞仪检测小鼠脾脏CD3^(+)CD4^(+)T、CD3^(+)CD8^(+)T细胞百分比变化和脾脏内细胞因子IL-4、IFN-γ分泌;三次免疫后所有小鼠口服半数致死量肠炎沙门菌进行强毒攻击。用SE-ghost刺激小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs),流式细胞仪检测表面分子抗体APC-CD11c、FITC-MHC ClassⅡ、PE-CD40、FITC-CD86、PE-CD80表达量;双抗体夹心ELISA测定BMDCs上清液IL-1β、IL-6、IL-10和IL-12p70的产量。结果与PBS组相比,SE-ghost(口服)和SE-ghost(肌注)免疫组小鼠体内肠炎沙门菌特异性抗体IgG和IgA水平明显增高;脾脏CD3^(+)CD4^(+)T细胞百分比上调、高分泌细胞因子IL-4、IFN-γ。肌肉注射SE-ghost比口服可诱导更强的体液和细胞免疫应答。致病菌肠炎沙门菌强毒攻击后,SE-ghost(口服)和SE-ghost(肌注)免疫组生存率高达80%。与对照组相比,BMDCs经SE-ghost刺激后高表达表面成熟分子抗体CD86、CD80、CD40、MHCⅡ,高分泌细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p70。结论通过肌肉注射SE-ghost进行免疫,可在小鼠中引发更强大的抗原特异性免疫应答,以防止沙门菌感染。SE-ghost是一种有用的沙门菌候选疫苗。

关键词：肠炎沙门菌细菌菌影灭活疫苗免疫应答保护功效

耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌生物膜形成与外排泵基因AdeABC表达的相关性研究

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中国抗生素杂志 2024年第8期49卷 898-902页

作者：潘蓓珍刘岩宿建胜杨继飞姜菲菲孙丽媛北华大学医学技术学院临床病原学检验教研室吉林132013

目的研究鲍曼不动杆菌的生物膜形成,以及浮游态和生物膜状态下对外排泵基因AdeABC的相对表达量作用于碳青霉烯类抗生素耐药机制的影响。方法将菌株经药物敏感性试验分为碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌(CRAB)组和碳青霉烯类敏感鲍曼不动杆... 详细信息

目的研究鲍曼不动杆菌的生物膜形成,以及浮游态和生物膜状态下对外排泵基因AdeABC的相对表达量作用于碳青霉烯类抗生素耐药机制的影响。方法将菌株经药物敏感性试验分为碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌(CRAB)组和碳青霉烯类敏感鲍曼不动杆菌(CSAB)组,采用结晶紫染色法检测两组生物膜形成能力;通过微量肉汤稀释法分别测定两组对亚胺培南的MIC、MBIC值,并计算MBIC/MIC的比值进一步比较分析生物膜菌和浮游菌的耐药性;同时提取CRAB组浮游态和生物膜态的RNA,通过RT-qPCR检测外排泵基因AdeABC相对表达量。结果 35株标本的生物膜阳性率为91.43%,其中CRAB组生物膜的阳性检出率为92%,生物膜阴性、弱阳性、阳性和强阳性分别占8%、48%、36%和8%。MBIC/MIC比值显示,形成生物膜后,鲍曼不动杆菌的耐药能力呈现不同程度的增加,CSAB组的耐药增加幅度以2倍的菌株最多;CRAB组的增加幅度以4倍的菌株最多。同时CRAB组RT-qPCR结果显示,生物膜较浮游态相比,外排泵基因adeA和adeB的相对表达量明显增高(P0.05)。结论鲍曼不动杆菌碳青霉烯类耐药与生物膜密切相关,且生物膜态的鲍曼不动杆菌较浮游态可促进外排泵基因AdeABC的表达从而增强碳青霉烯类抗生素的耐药性。

关键词：鲍曼不动杆菌亚胺培南生物膜外排泵

脑型疟炎症微环境诱导星形胶质细胞活化及对神经元损伤的研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2024年第2期42卷 160-168页

作者：仝国栋朱卿昊王军刘晓冉沈燕梁姣李英辉黄豫晓王一赵亚西北大学生命科学学院陕西西安710127 空军军医大学基础医学院微生物与病原生物学教研室陕西西安710032 空军军医大学基础医学院陕西西安710032

目的探索脑型疟发病过程中,星形胶质细胞被脑血管周炎性微环境诱导活化及其机制,及其对神经元损伤的影响。方法4~5周C57BL/6雄性小鼠经腹腔接种5×10^(6)个感染伯氏疟原虫ANKA株的红细胞,7~10 d后死亡,作为实验型脑型疟模型。新生3~5 d... 详细信息

目的探索脑型疟发病过程中,星形胶质细胞被脑血管周炎性微环境诱导活化及其机制,及其对神经元损伤的影响。方法4~5周C57BL/6雄性小鼠经腹腔接种5×10^(6)个感染伯氏疟原虫ANKA株的红细胞,7~10 d后死亡,作为实验型脑型疟模型。新生3~5 d的乳鼠,安乐死后分离脑皮层原代星形胶质细胞;24 h内的乳鼠,安乐死后分离脑皮层原代神经元。以20 ng/mlγ干扰素(IFN-γ)、1 ng/ml肿瘤坏死因子α(TNF-α)和感染疟原虫的小鼠红细胞(pRBC)诱导星形胶质细胞活化,作为活化组,同时设置未处理静息态细胞作为对照组。24 h后用细胞裂解提取液提取总RNA测序,聚类分析生成热图,选取代表性的数个基因绘制小提琴图。ELISA测定细胞培养上清中CXCL10表达水平。分离脑型疟小鼠脾脏CD8^(+)T细胞,与活化的星形胶质细胞共孵育,荧光显微镜下观察免疫突触及与CXCL10抗体共孵育后的CXCL10水平,流式细胞仪检测CD80等分子表达水平。原代神经元加入两组星形胶质细胞培养上清,在MAP2抗体中孵育,设置空白培养基作为空白组,乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测神经元损伤程度,CCK-8试剂盒检测神经元活力。Western blotting检测STAT1、STAT3及其磷酸化分子水平,活化组加入STAT1通路抑制剂氟达拉滨,免疫荧光染色观察神经元形态。采用PRISM Graph Pad 8.0软件进行统计学分析,两两比较采用t检验。结果活化组星形胶质细胞形态由扁平星状变为长梭形,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)相对含量为(1.36±0.03),高于对照组的(1.00±0.00)(t=13.33,P学意义(t=0.31、0.13,均P>0.05)。Western blotting结果显示,活化组胞浆中STAT1、p-STAT1蛋白相对表达量分别为3.40±1.08、4.00±0.82,均高于对照组(1)(t=3.13、5.13,均P学意义(t=0.27、0.52,均P>0.05)。在活化组胞核中p-STAT1蛋白相对表达量为1.78±0.21,高于对照组(1)(t=5.081,P学意义(t=1.38,均P>0.05)。对MAP2免疫荧光染色结果显示,活化组上清可造成明显的神经元损伤,经STAT1抑制剂处理后损伤得到缓解。结论脑型疟发病过程中血管周炎性微环境可通过STAT1分子诱导神经毒性星形胶质细胞产生,可导致神经元死亡。活化星形胶质细胞与活化的CD8^(+)T细胞相互作用,进一步加重中枢神经系统损伤。

关键词：脑型疟星形胶质细胞 CD8^(+)T细胞神经元炎性微环境

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梅毒螺旋体与母胎界面细胞相互作用影响妊娠结局的机制研究进展

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中国病理生理杂志 2024年第2期40卷 351-357页

作者：黄少彬熊顺刘兆平张晓红赵飞骏南华大学衡阳医学院病原生物学研究所/特殊病原体防控湖南省重点实验室湖南衡阳421001 南华大学附属第一医院检验医学中心/感染性疾病研究所湖南衡阳421001

梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)感染引起的一种慢性、性传播疾病[1]。近十年来,梅毒在世界范围内流行,特别是在非洲、东南亚、西欧、俄罗斯和中国,并在这些地区造成了严重的公共卫生问题[2-3]。梅毒发病率逐年上升,先天性梅... 详细信息

梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)感染引起的一种慢性、性传播疾病[1]。近十年来,梅毒在世界范围内流行,特别是在非洲、东南亚、西欧、俄罗斯和中国,并在这些地区造成了严重的公共卫生问题[2-3]。梅毒发病率逐年上升,先天性梅毒(con-genital syphilis,CS)发生率也一直处于较高水平[4-5]。CS是由Tp经胎盘垂直传播感染胎儿的一种先天感染性疾病,可发生于妊娠任何阶段.

关键词：梅毒螺旋体先天性梅毒母胎免疫不良妊娠结局

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衣原体对宿主细胞代谢与死亡的影响研究概况

动物医学进展 2024年第9期45卷 114-118页

作者：梁兴露贾天军河北北方学院临床检验诊断学重点实验室病原生物学与免疫研究所河北张家口075000

衣原体(Chlamydia)是专性寄生于胞内的病原体,感染宿主细胞后形成包涵体并分泌大量效应分子,为逃避宿主内吞插入并修饰包涵体膜的蛋白称为包涵体膜蛋白。衣原体凭借包涵体膜蛋白从宿主细胞摄取能量或代谢物以完成自身生长发育,也可凭借... 详细信息

衣原体(Chlamydia)是专性寄生于胞内的病原体,感染宿主细胞后形成包涵体并分泌大量效应分子,为逃避宿主内吞插入并修饰包涵体膜的蛋白称为包涵体膜蛋白。衣原体凭借包涵体膜蛋白从宿主细胞摄取能量或代谢物以完成自身生长发育,也可凭借包涵体膜蛋白(inclusion membrane proteins,Incs)调控宿主细胞的死亡。论文从衣原体感染宿主细胞后对宿主细胞代谢与死亡的调节作用进行综述,以期为预防和治疗衣原体感染提供参考。

关键词：衣原体包涵体膜蛋白代谢细胞死亡

云南省2例婴幼儿输入性内脏利什曼病病例临床分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2024年

作者：世淑兰李翠英张倩李荣杰奎莉越樊茂昆明市儿童医院检验科云南省儿童医学中心昆明医科大学基础医学院病原生物学与免疫学系

回顾性分析2021年1月至2022年12月昆明市儿童医院收治的2例内脏利什曼病患儿的实验室检查及临床病历资料。2例均为云南女性患儿，年龄分别为9个月和2岁，均有内脏利什曼病流行区（分别为甘肃省甘南藏族自治州舟曲县及新疆维吾尔自治区... 详细信息

回顾性分析2021年1月至2022年12月昆明市儿童医院收治的2例内脏利什曼病患儿的实验室检查及临床病历资料。2例均为云南女性患儿，年龄分别为9个月和2岁，均有内脏利什曼病流行区（分别为甘肃省甘南藏族自治州舟曲县及新疆维吾尔自治区库车市）居住史和白蛉叮咬史。2例患儿均有长期不规则发热，体温39.7～40℃，有皮疹，面色苍白。血常规示血白细胞（病例1、病例2分别为3.92×10～9/L、3.34×10～9/L）、血红蛋白（98 g/L、79 g/L）、血小板（49×10～9/L、57×10～9/L）减少；超敏C反应蛋白（200 mg/L、58.19 mg/L）、降钙素原（2.29 ng/ml、1.38 ng/ml）、铁蛋白（69 445μg/L、2 800μg/L）升高。rK39抗体均为阳性。骨髓穿刺涂片均检出利什曼原虫无鞭毛体。病例2经全套病原微生物宏基因组高通量测序，检出杜氏利什曼原虫序列32 026条。腹部B超示2例患儿均有肝脏、脾脏肿大。确诊为内脏利什曼病后给予葡萄糖酸锑钠240 mg/kg （均分为6剂），每日静脉注射1次，一个疗程6 d，共3个疗程。2例患儿均治愈，随访半年、1年均未见异常。儿童内脏利什曼病临床症状不典型，若长期不规则发热，临床医师应详细询问内脏利什曼病的流行病学史，结合实验室检查及骨髓穿刺涂片寻找病原体，若骨髓中未找到病原体时，应及时行病原体宏基因组高通量测序等检查，以减少误诊或漏诊。

关键词：内脏利什曼病婴幼儿临床分析云南省

鼻内滴入罗伊氏乳杆菌TR02减轻肺炎支原体诱导的小鼠肺部炎症损伤

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中华微生物学和免疫学杂志 2024年第4期44卷 323-329页

作者：田巍杜霆锋何桂婷谭田平孟雁魏红江南华大学衡阳医学院附属南华医院输血科衡阳421001 南华大学衡阳医学院附属南华医院检验科衡阳421001 南华大学衡阳医学院病原生物学研究所特殊病原体防控湖南省重点实验室衡阳421001 南华大学衡阳医学院附属南华医院急诊科衡阳421001

目的探讨经鼻滴入罗伊氏乳杆菌TR02(Lactobacillus reuteri TR02,Lr TR02)对BALB/c小鼠呼吸道肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)感染的免疫调节。方法小鼠随机分2组,分别连续2 d经鼻滴入PBS或Lr TR02,第3天经呼吸道感染2×107菌落... 详细信息

目的探讨经鼻滴入罗伊氏乳杆菌TR02(Lactobacillus reuteri TR02,Lr TR02)对BALB/c小鼠呼吸道肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)感染的免疫调节。方法小鼠随机分2组,分别连续2 d经鼻滴入PBS或Lr TR02,第3天经呼吸道感染2×107菌落形成单位的Mp。Mp感染后第3天处死小鼠,固体培养和定量PCR检测肺组织匀浆中Mp载量,病理切片HE染色分析肺组织炎症,流式细胞术对外周血进行细胞分类及计数,ELISA检测促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17A和抑炎细胞因子IL-10的水平。结果预先经鼻滴入Lr TR02不影响Mp感染第3天小鼠肺组织Mp载量,但可阻止Mp感染引起的小鼠体重减轻,并显著减轻肺组织炎症。与对照组比较,经鼻滴入Lr TR02小鼠感染Mp后外周血中性粒细胞数量和比例减少,肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性降低,肺组织TNF-α、IL-8和IL-17A的分泌水平降低,IL-10的表达增加,但未显著影响IL-6的产生。结论经鼻滴入Lr TR02可减少Mp感染小鼠中性粒细胞浸润和MPO活性,减少TNF-α、IL-8和IL-17A的分泌,增加IL-10的产生,减轻感染早期肺组织炎症损伤。

关键词：肺炎支原体罗伊氏乳杆菌TR02 中性粒细胞炎症细胞因子

微小膜壳绦虫感染仓鼠小肠组织病理学观察及MUC2表达的分析

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黑龙江畜牧兽医 2024年第9期 109-113,121,122页

作者：王鸿雁李小毛崔轩胤张科牟荣贵州医科大学基础医学院人体寄生虫学教研室贵阳561113 贵州医科大学现代病原生物学特色重点实验室贵阳561113 铜仁市人民医院检验科贵州铜仁554300

为了解微小膜壳绦虫感染仓鼠小肠组织的病理学特征及黏蛋白2(MUC2蛋白)的表达情况,试验从贵阳市宠物市场随机选取60只宠物仓鼠,采用饱和盐水浮聚法检测仓鼠粪便中的虫卵并进行鉴定,根据仓鼠感染微小膜壳绦虫的情况将仓鼠分为未感染组、... 详细信息

为了解微小膜壳绦虫感染仓鼠小肠组织的病理学特征及黏蛋白2(MUC2蛋白)的表达情况,试验从贵阳市宠物市场随机选取60只宠物仓鼠,采用饱和盐水浮聚法检测仓鼠粪便中的虫卵并进行鉴定,根据仓鼠感染微小膜壳绦虫的情况将仓鼠分为未感染组、无症状感染组、普通型感染组和重型感染组,解剖所有仓鼠获取肠道内寄生虫及小肠组织,制备小肠组织切片并进行苏木精-伊红(H.E.)染色、阿利新蓝-过碘酸-雪夫(AB-PAS)染色及免疫组织化学染色,通过实时荧光定量PCR(qPCR)扩增分析仓鼠小肠MUC2基因相对表达情况。结果表明:微小膜壳绦虫在宠物仓鼠中的感染率为74.5%,其感染可引起仓鼠小肠绒毛损伤、上皮细胞变性坏死、杯状细胞异常、白细胞浸润等病理改变;与未感染组相比,无症状组杯状细胞数量及MUC2基因相对表达量差异不显著(P>0.05),普通型感染组的杯状细胞数量极显著增加(P<0.01),重型感染组的杯状细胞极显著减少(P<0.01),同时重型感染组的MUC2基因及MUC2蛋白表达水平极显著增高(P<0.01)。说明微小膜壳绦虫感染会导致仓鼠小肠绒毛结构破坏,杯状细胞数量及形态异常,并引起杯状细胞分泌MUC2蛋白增多,且重型感染组杯状细胞数量减少,但其分泌的MUC2蛋白量增加。

关键词：仓鼠微小膜壳绦虫小肠病理学特征黏蛋白2