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人白介素12亚基p40和p35基因串联在毕赤酵母中的表达及表达产物活性分析

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中国生物工程杂志 2008年第3期28卷 20-24页

作者：周鹤峰邵敏孙伟刘银花李官成葛正龙遵义医学院珠海校区生物工程教研室珠海519041 遵义医学院珠海校区生物化学教研室珠海519041 遵义医学院生物化学教研室遵义563003

利用毕赤酵母系统表达有活性的人单链白细胞介素12(hscIL-12),PCR法从质粒pBI121-IL-12中扩增hscIL-12基因,经酶切、连接构建重组表达载体pPIC9K-hscIL-12,SacI线性化后,PEG1000法转化毕赤酵母GS115,经G418筛选和菌落PCR鉴定,经甲醇诱导... 详细信息

利用毕赤酵母系统表达有活性的人单链白细胞介素12(hscIL-12),PCR法从质粒pBI121-IL-12中扩增hscIL-12基因,经酶切、连接构建重组表达载体pPIC9K-hscIL-12,SacI线性化后,PEG1000法转化毕赤酵母GS115,经G418筛选和菌落PCR鉴定,经甲醇诱导,hscIL-12在酵母中获得分泌表达,表达产物经Western blot检测,显示该蛋白相对分子质量为70kDa,可与鼠抗人IL-12单克隆抗体特异性结合;定量分析结果表明,重组酵母培养上清中hscIL-12约占总蛋白的26%,表达量约为60mg/L;生物学活性实验表明,重组蛋白能促进人外周血淋巴细胞增殖。为利用rhscIL-12进行基因治疗奠定了基础。

关键词：人白细胞介素12 毕赤酵母分泌表达活性分析

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人白介素-12植物表达载体的构建

第四军医大学学报 2007年第10期28卷 868-870页

作者：邵敏周鹤峰葛正龙遵义医学院珠海校区生物化学教研室广东珠海519041 遵义医学院珠海校区生物工程教研室广东珠海519041 遵义医学院生物化学与分子生物学教研室贵州遵义563003

目的构建人白介素-12(hIL-12)基因的植物表达载体.方法采用PCR技术从质粒pCA13-hIL-12中扩增hIL-12基因,SmaI,SacI分别酶切hIL-12基因和植物表达载体pBI121,回收,T4DNA连接酶连接得到重组质粒pBI121-hIL-12,双酶切和DNA测序鉴定后,通过... 详细信息

目的构建人白介素-12(hIL-12)基因的植物表达载体.方法采用PCR技术从质粒pCA13-hIL-12中扩增hIL-12基因,SmaI,SacI分别酶切hIL-12基因和植物表达载体pBI121,回收,T4DNA连接酶连接得到重组质粒pBI121-hIL-12,双酶切和DNA测序鉴定后,通过三亲杂交法将表达载体pBI121-hIL-12分别导入根癌农杆菌EHA105和GV3101,用PCR法进行鉴定.结果双酶切及DNA序列测定证实hIL-12已插入到表达载体pBI121中,PCR扩增表明构建的重组表达载体pBI121-hIL-12成功转入根癌农杆菌EHA105和GV3101中.结论成功构建了植物表达载体pBI121-hIL-12,为进一步利用转基因植物生产hIL-12奠定了实验基础.

关键词：人白细胞介素-12 植物表达载体载体构建根瘤菌属

Ezrin增强子敲除可抑制人食管癌Eca-109细胞的增殖和迁移

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中国肿瘤生物治疗杂志 2019年第1期26卷 29-35页

作者：雷悦野庆松卫金岐李文娜莫镇涛张青峰高书颖遵义医学院珠海校区生物化学与分子生物学教研室广东珠海519041 中山大学附属第五医院消化内科广东珠海519000 遵义医学院珠海校区

目的:探讨ezrin增强子敲除对食管癌Eca-109细胞ezrin基因表达、细胞增殖和迁移的影响。方法:将靶向ezrin增强子上、下游的CRISPR/Cas9重组质粒共转染食管癌Eca-109细胞,经嘌呤霉素筛选,获得敲除ezrin增强子的细胞株Eca-C2。用qPCR和West... 详细信息

目的:探讨ezrin增强子敲除对食管癌Eca-109细胞ezrin基因表达、细胞增殖和迁移的影响。方法:将靶向ezrin增强子上、下游的CRISPR/Cas9重组质粒共转染食管癌Eca-109细胞,经嘌呤霉素筛选,获得敲除ezrin增强子的细胞株Eca-C2。用qPCR和Western blotting分别检测敲除ezrin增强子的Eca-C2细胞中ezrin mRNA和蛋白的表达,用蛋白芯片技术检测MAPK通路相关蛋白的表达,用WST-1法和细胞划痕愈合实验分别检测ezrin增强子敲除对Eca-C2细胞增殖和迁移能力的影响。结果:成功构建稳定敲除ezrin增强子的食管癌细胞株Eca-C2;与对照细胞相比,ezrin增强子敲除细胞ezrin mRNA和蛋白的表达水平均明显降低(均P<0.05)。Eca-C2细胞中17种被检测的MAPK通路相关蛋白中有9种(AKT、CREB、GSK3b、MKK6、m TOR、P38、P53、P70S6K和RSK1)表达下调,ezrin增强子敲除后细胞的增殖和迁移能力受到明显抑制(均P<0.05)。结论:在人食管癌Eca-109细胞中,敲除ezrin增强子可明显抑制细胞的增殖和迁移。

关键词： ezrin增强子基因敲除食管癌 Eca-109细胞增殖迁移

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人蔗糖酶蛋白在大肠杆菌的诱导表达与纯化

细胞与分子免疫学杂志 2015年第12期31卷 1629-1632页

作者：邵敏王新颖张青峰牛宪立王燕周鹤峰葛正龙遵义医学院珠海校区生物工程系广东珠海519041 遵义医学院生物化学教研室贵州遵义563003

目的构建人蔗糖酶(h SUC)基因原核表达载体,诱导表达获得融合蛋白。方法采用反转录PCR法扩增得到h SUC基因片段,并将其克隆到表达载体p ET-28a(+)中,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导在大肠杆菌中表达,采用Ni柱亲和层析纯化重组蛋白,对... 详细信息

目的构建人蔗糖酶(h SUC)基因原核表达载体,诱导表达获得融合蛋白。方法采用反转录PCR法扩增得到h SUC基因片段,并将其克隆到表达载体p ET-28a(+)中,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导在大肠杆菌中表达,采用Ni柱亲和层析纯化重组蛋白,对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果克隆得到1482 bp目的基因,酶切和测序证实h SUC基因片段成功插入到p ET-28a(+)表达载体。表达的融合蛋白质相对分子质量(Mr)为61 240,Western blot结果显示融合蛋白可以与h SUC抗体特异性结合。结论成功在大肠杆菌中表达和纯化h SUC融合蛋白。

关键词：蔗糖酶 α-葡萄糖苷酶大肠杆菌基因表达蛋白纯化

农杆菌介导的hIL-12基因转化马铃薯的研究

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华北农学报 2008年第3期23卷 46-49页

作者：邵敏周鹤峰葛正龙遵义医学院珠海校医生物化学教研室广东珠海519041 遵义医学院珠海校区生物工程教研室广东珠海519041 遵义医学院生物化学教研室贵州遵义563003

构建CaMv35S启动子驱动人白细胞介素12基因(hIL-12)的植物表达载体pBI121-hIL-12,通过三亲杂交法将重组载体导入根癌农杆菌菌株EHA105,农杆菌介导法转化马铃薯茎段,经卡那霉素抗性筛选,获得28株抗性植株。通过PCR检测,22株为阳性,从PCR... 详细信息

构建CaMv35S启动子驱动人白细胞介素12基因(hIL-12)的植物表达载体pBI121-hIL-12,通过三亲杂交法将重组载体导入根癌农杆菌菌株EHA105,农杆菌介导法转化马铃薯茎段,经卡那霉素抗性筛选,获得28株抗性植株。通过PCR检测,22株为阳性,从PCR阳性植株中随机选取5株,ELISA法检测茎和叶中hIL-12的表达量,其中2株与对照组相比有显著性差异(p生物学活性奠定了试验基础。

关键词：马铃薯人白细胞介素12 遗传转化根癌农杆菌

菟丝子含药血清对大鼠肢芽细胞、骨形成蛋白2及Ⅱ型胶原表达的影响

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山东大学学报（医学版） 2014年第7期52卷 37-40页

作者：刘星李啸红王燕邹聪聪遵义医学院珠海校区生物化学与细胞分子生物学教研室广东珠海519041 遵义医学院珠海校区人体解剖与组织胚胎学教研室广东珠海519041

目的探讨菟丝子含药血清对SD大鼠胚胎肢芽细胞增殖与分化、细胞中骨形成蛋白2(BMP-2)mRNA表达、Ⅱ型胶原mRNA和蛋白表达的影响。方法采用中药血清药理学方法制备高、中、低剂量(40、20、10 g/kg)菟丝子含药血清和正常血清。取E15后肢芽... 详细信息

目的探讨菟丝子含药血清对SD大鼠胚胎肢芽细胞增殖与分化、细胞中骨形成蛋白2(BMP-2)mRNA表达、Ⅱ型胶原mRNA和蛋白表达的影响。方法采用中药血清药理学方法制备高、中、低剂量(40、20、10 g/kg)菟丝子含药血清和正常血清。取E15后肢芽制成细胞悬液,接种到细胞培养板中,分别加入高、中、低剂量菟丝子含药血清和正常血清,作为高、中、低剂量组和阴性对照组。体外培养72 h,MTT法检测肢芽细胞的增殖,阿利新蓝染色检测肢芽细胞的分化,RT-PCR法检测肢芽细胞中BMP-2、Ⅱ型胶原mRNA的表达,Western blotting检测Ⅱ型胶原蛋白的表达。结果低、中剂量组细胞增殖较快,吸光度值高于阴性对照组(P<0.05);中剂量组软骨细胞集落数多于阴性对照组(P<0.05),高剂量组软骨细胞集落数低于阴性对照组(P<0.05);低、中剂量组BMP-2 mRNA表达水平高于阴性对照组(P<0.05),高剂量组BMP-2 mRNA低于阴性对照组(P<0.05);各剂量组Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达水平均高于阴性对照组(P<0.05)。结论不同剂量菟丝子含药血清均可促进肢芽细胞的增殖和Ⅱ型胶原mRNA及蛋白的表达;高剂量菟丝子含药血清可下调BMP-2 mRNA的表达水平,抑制肢芽细胞的分化。

关键词：菟丝子含药血清肢芽细胞骨形成蛋白2 Ⅱ型胶原

刚地弓形虫感染对大鼠细胞因子和生精细胞的影响

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2011年第4期29卷 274-278页

作者：杨瑞遵义医学院珠海校区免疫与病原生物学教研室珠海519041

目的研究弓形虫感染对雄性大鼠血清1型T辅助细胞（Th1）和2型T辅助细胞（Th2）细胞因子水平，以及睾丸的病理损伤和各级生精细胞凋亡的影响。方法将9～10周龄雄性SD大鼠88只随机分为感染组和健康对照组（每组44只）。感染组腹腔注射弓... 详细信息

目的研究弓形虫感染对雄性大鼠血清1型T辅助细胞（Th1）和2型T辅助细胞（Th2）细胞因子水平，以及睾丸的病理损伤和各级生精细胞凋亡的影响。方法将9～10周龄雄性SD大鼠88只随机分为感染组和健康对照组（每组44只）。感染组腹腔注射弓形虫速殖子1×10^4个／只，健康对照组注射等量PBS，于感染前和感染后第3、6、9、12、……和30天取两组大鼠各4只，分离血清及取睾丸，EUSA检测血清1干扰素（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）水平变化．对睾丸进行病理学检查和免疫组化检测生精小管凋亡蛋白Bel-2和Bax的表达改变。结果感染组大鼠感染速殖子后血清IFN-γ迅速升高，在感染后第6天出现峰值[（518．3±83．6）pg/ml]后迅速降低；血清114升高缓慢，于第12天达到峰值[（325．0±38．6）pg/ml]后逐渐降低。两者在感染后30d内均显著高于健康对照组（P〈0．01）。病理学检查发现，感染组大鼠感染后第6天睾丸生精小管细胞层次紊乱，初级精母细胞和次级精母细胞明显减少，管腔内精子稀少甚至管腔闭合，感染后30d内未见明显改善。感染组大鼠于感染后第3天睾丸细胞的Bax表达即显著增加（P〈0．01），第6天达到峰值（0．547±0．037）后逐渐减少，15d后恢复至正常水平。感染组大鼠睾丸细胞Bel-2表达无明显变化。结论弓形虫可导致生精细胞严重的病理损伤，在急性期出现Th1细胞因子极化，伴有精母细胞凋亡蛋白Bax的高表达；Th1／Th2重新平衡后，Bax蛋白表达减少。但生精过程无明显恢复。

关键词：刚地弓形虫 Th1/Th2 Bcl-2/Bax 生精细胞

野生天麻DNA导入马铃薯实现遗传转化的研究

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广西植物 2005年第4期25卷 353-355,i0002页

作者：周鹤峰邵敏葛正龙遵义医学院珠海校区生物工程教研室广东珠海519041 遵义医学院生物化学教研室贵州遵义563003

采用浸苗法将野生天麻总DNA导入马铃薯试管苗,对筛选得到的转化植株进行蛋白及药用成份的分析。结果显示:(1)在200株转化的马铃薯中有21株的紫外扫描图谱与正常对照组有显著差异,且在220nm有明显吸收峰。(2)5株经PCR扩增出野生天麻抗真... 详细信息

采用浸苗法将野生天麻总DNA导入马铃薯试管苗,对筛选得到的转化植株进行蛋白及药用成份的分析。结果显示:(1)在200株转化的马铃薯中有21株的紫外扫描图谱与正常对照组有显著差异,且在220nm有明显吸收峰。(2)5株经PCR扩增出野生天麻抗真菌蛋白(GAFP)基因。(3)转基因马铃薯与正常马铃薯的蛋白表达有明显差异,并且在转基因马铃薯中有一条与野生天麻抗真菌蛋白(GAFP)相同的条带。而正常马铃薯中无此条带。(4)通过薄层层析法检测出3株转基因马铃薯表达野生天麻的有效药用成份天麻素。说明采用浸苗法进行外源总DNA导入是可行的。

关键词：野生天麻浸苗法天麻素转基因

hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定

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吉林大学学报（医学版） 2016年第1期42卷 59-63页

作者：邵敏王新颖刘星王燕周鹤峰葛正龙遵义医学院珠海校区生物化学教研室广东珠海519041 遵义医学院生物化学教研室贵州遵义563003

目的:构建原核表达载体pET-28a(+)-hISO,探讨其融合蛋白在大肠杆菌中的稳定表达情况,为后续实验研究奠定基础。方法:以Caco-2细胞的总RNA为模版,采用RT-PCR方法扩增出大小为1 770bp的人异麦芽糖酶(hISO)基因片段,将其插入到pET-28a(+)中... 详细信息

目的:构建原核表达载体pET-28a(+)-hISO,探讨其融合蛋白在大肠杆菌中的稳定表达情况,为后续实验研究奠定基础。方法:以Caco-2细胞的总RNA为模版,采用RT-PCR方法扩增出大小为1 770bp的人异麦芽糖酶(hISO)基因片段,将其插入到pET-28a(+)中,构建重组载体pET-28a(+)-hISO。经PCR、酶切及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE电泳、Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定。结果:经PCR、酶切及测序鉴定后,重组质粒pET-28a(+)-hISO构建正确,表达重组蛋白相对分子质量为68 860,将融合蛋白进行纯化,经40和60mmol·L-1咪唑缓冲液洗脱后能够得到浓度和纯度相对较高的蛋白。结论:成功地构建了hISO基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了融合蛋白表达。

关键词：异麦芽糖酶原核表达 α-葡萄糖苷酶大肠杆菌