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硒对六个青稞品种种子萌发及吸收转运的影响

核农学报 2024年第7期38卷 1385-1397页

作者：高雪李安庆冉黄丹妮卓玛孙媛媛西藏自治区农牧科学院农业资源与环境研究所/省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室西藏拉萨850002 贵州师范大学生命科学学院/贵州省植物生理与发育调控重点实验室贵州贵阳550001

为探明不同价态硒对青稞(Hordeum vulgare *** Hook.f.)种子萌发、生长及其吸收转运硒的影响,本研究以6个青稞品种为研究对象,通过种子萌发试验,研究不同价态(Se^(6+)和Se^(4+))和不同浓度水平(0~5.0 mg·L^(-1)和0~40 mg·L^(-1))对青... 详细信息

为探明不同价态硒对青稞(Hordeum vulgare *** Hook.f.)种子萌发、生长及其吸收转运硒的影响,本研究以6个青稞品种为研究对象,通过种子萌发试验,研究不同价态(Se^(6+)和Se^(4+))和不同浓度水平(0~5.0 mg·L^(-1)和0~40 mg·L^(-1))对青稞种子萌发指标的影响;利用加权隶属函数法对不同价态和不同浓度硒水平下青稞种子的萌发能力进行综合评价;通过水培试验研究青稞对硒的吸收转运。结果表明,随着硒浓度的升高,6个青稞品种种子的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数呈先增加后减小趋势。加权隶属函数值(D值)结果表明,Se^(6+)和Se^(4+)浓度在0~1.0 mg·L^(-1)范围内可促进青稞种子萌发。与Se^(6+)对青稞种子生长的影响不同,当Se^(4+)浓度大于1.0 mg·L^(-1)时,Se^(4+)对胚芽和胚根的抑制作用更为明显。Se^(6+)处理青稞地上部分硒含量高于Se^(4+)处理,6个青稞品种对Se^(6+)的吸收量约为对Se^(4+)吸收量的1.39~4.21倍,以山青9号地上部分硒吸收量最高。6个青稞品种对Se^(6+)的转运系数在0.671~3.342之间;除藏青3000对Se^(6+)的转运系数小于1外,其他5个青稞品种对Se^(6+)的转运系数在1.503~3.342之间,均大于1,而对Se^(4+)的转运系数在0.192~0.319之间,均小于1。本研究结果可为西藏青稞硒生物强化提供理论依据。

关键词：青稞硒价态种子萌发吸收转运

根际微生物增强植物对非生物和生物胁迫耐受机制综述

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江苏农业科学 2024年第12期52卷 24-33页

作者：陈显磊王剑峰王丽陈兰兰吴亚娟孔鑫刘杰乙引龚记熠贵州师范大学生命科学学院贵州贵阳550001 贵州师范大学西南喀斯特山地生物多样性保护国家林业和草原局重点实验室贵州贵阳550001 贵州省植物生理与发育调控重点实验室贵州贵阳550001 兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室/兰州大学草地微生物研究中心甘肃兰州730000

频繁的人类生产过程造成的土壤盐渍化、干旱、病害、重金属等不利环境,以及低温地区环境的限制,严重制约了各地区自然和社会经济的发展,伴随封山育林、植树造林等生态修复工程的大力开展和研究发现,植物因其固着性将长期面临各种生物及... 详细信息

频繁的人类生产过程造成的土壤盐渍化、干旱、病害、重金属等不利环境,以及低温地区环境的限制,严重制约了各地区自然和社会经济的发展,伴随封山育林、植树造林等生态修复工程的大力开展和研究发现,植物因其固着性将长期面临各种生物及非生物胁迫,植物可通过改变自身的生理生化反应来响应逆境。但随着对植物响应逆境研究的不断深入,发现根际不仅是植物根系与土壤之间物质交换和能量代谢的重要界面,根际微生物的生命代谢活动还可以影响植物生长发育、新陈代谢等生理活动来帮助植物建立响应非生物和生物胁迫的抵抗和耐性机制。为了推进生态修复工程和解决人地矛盾,越来越多的科研工作者关注到干旱、盐渍、重金属、低温等地区和植物病害下根际微生物在帮助植物响应逆境过程中发挥的作用。因此本文就根际微生物增强植物耐旱、耐寒、耐盐、耐重金属、抗病害等方面的研究状况进行系统梳理,结合实例综合论述根际微生物在增强植物对非生物和生物胁迫中发挥的作用,以期为根际微生物促进农业发展和参与生态修复提供理论参考。

关键词：根际微生物逆境胁迫微生物功能微生物群落生物修复

一个类黄酮3'-羟化酶参与多星韭花色素生物合成的功能解析

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安徽农业大学学报 2024年第4期51卷 581-587页

作者：孔德静梁进丽宫秋玲俞沙沙梁琳孙威鞠志刚贵州中医药大学药学院贵阳550025 贵州师范大学生命科学学院/植物生理与发育调控重点实验室贵阳550025

类黄酮3'-羟化酶(F3'H)在花色素苷生物合成过程中起关键作用。明确多星韭F3'H在花色素苷生物合成中的功能,将为多星韭花色形成及改良研究提供基因资源。基于转录组数据从多星韭花朵中克隆获得AwF3'H,并对其进行生物信息学分析,利用Real ... 详细信息

类黄酮3'-羟化酶(F3'H)在花色素苷生物合成过程中起关键作用。明确多星韭F3'H在花色素苷生物合成中的功能,将为多星韭花色形成及改良研究提供基因资源。基于转录组数据从多星韭花朵中克隆获得AwF3'H,并对其进行生物信息学分析,利用Real time PCR对AwF3'H1的表达模式进行分析,并利用蘸花法将AwF3'H转入拟南芥中,同时对转基因植株进行表型观察及花色素苷检测分析。结果表明,Aw F3'H的ORF全长为1545 bp,编码514个氨基酸,属于细胞色素P450家族成员,与洋葱AcF3'H的亲缘关系最近;在所检测组织均有表达,但在雄蕊中表达最高,根中表达最低;与野生型拟南芥相比,转AwF3'H拟南芥T2代幼苗子叶及下胚轴颜色明显加深,矢车菊素与天竺葵素类花色苷积累量显著增加。表明AwF3'H具有类黄酮3'-羟化酶的功能。

关键词：多星韭基因功能验证类黄酮3'-羟化酶表达分析花青素

映山红和马缨杜鹃SOD基因家族全基因组鉴定及热胁迫过程中的作用

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映山红和马缨杜鹃SOD基因家族全基因组鉴定及热胁迫过程中的作用

作者：花丽贵州师范大学

学位级别：硕士

我国杜鹃花属(Rhododendron)植物资源非常丰富,但其利用率相对较低。杜鹃属植物大多不耐热,夏季的高温是限制杜鹃花推广应用的主要因素。植物在各种逆境胁迫下会积累过量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),造成过氧化损伤。超氧化... 详细信息

我国杜鹃花属(Rhododendron)植物资源非常丰富,但其利用率相对较低。杜鹃属植物大多不耐热,夏季的高温是限制杜鹃花推广应用的主要因素。植物在各种逆境胁迫下会积累过量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),造成过氧化损伤。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是抗氧化防御系统的第一道防线,在植物各种逆境胁迫适应性中发挥着重要作用。课题组前期通过测定高温胁迫条件下几个杜鹃花品种的生理指标明确了SOD与耐热有关。在此基础上进一步探究SOD基因在杜鹃花耐热性中发挥的作用,对杜鹃花耐热性育种具有重要意义。本研究以杜鹃花属耐热性较好的映山红(Rhododendron simsii)和热敏感的马缨杜鹃(Rhododendron delavayi)2年生幼苗为材料,运用生物信息学、遗传学、分子生物学等手段,鉴定和分析了两种杜鹃花中SOD基因家族的成员数目、类型、系统发育关系、蛋白保守基序、基因结构及启动子中的顺式元件;通过q RT-PCR研究RsSOD和RdSOD基因家族成员的表达模式;克隆获得RsFSD2和RsCSD5基因的全长编码序列,通过瞬时转化烟草叶片明确其亚细胞位置,并通过异源转化拟南芥研究其在高温胁迫条件中发挥的作用。主要研究结果如下:1、映山红和马缨杜鹃SOD基因家族全基因组鉴定。映山红基因组中发现了9个SOD基因,包括5个Cu/Zn SODs(RsCSD1～RsCSD5),2个Fe SODs(RsFSD1、RsFSD2)和2个Mn SODs(RsMSD1、RsMSD2)。马缨杜鹃基因组中发现了11个SOD基因,包括7个Cu/Zn SODs(RdCSD1～RdCSD7),2个Fe SODs(RdFSD1、RdFSD2)和2个Mn SODs(RdMSD1、RdMSD2)。2、RsSOD和RdSOD基因家族成员的生物信息学分析。系统进化关系分析结果表明,两种杜鹃花及其他相关物种的SOD蛋白分为三个亚家族。基因结构和保守基序分析结果表明,SOD蛋白具有很强的进化保守性,同亚族的SOD具有相似的基序分布及相似的基序位置和长度。在RsSOD、RdSOD的启动子中检测到22种光响应元件、8种植物激素调控元件、5种逆境胁迫相关元件、3种生长发育调控元件。3、RsSOD和RdSOD基因家族成员的表达模式分析。研究了RsSOD和RdSOD基因家族对高温胁迫及以下胁迫的响应:脱落酸、乙烯利和过氧化氢处理,然后再高温胁迫。通过q RT-PCR分析发现,在RsSOD和RdSOD基因家族中,除了RdCSD5,其他SODs在4个组织中至少有一个组织中表达,且这些基因家族成员在叶片中均有较高的表达水平。在外源试剂处理和不同高温胁迫时间下,检测到的SOD基因家族成员表达上调程度不同。其中,RsFSD2和RsCSD5分别与RdCSD2和RdFSD1属同源基因,且40℃高温胁迫处理后在两种杜鹃花中的表达量均显著上调,说明高温能显著诱导这2个基因的表达。这暗示这2个基因可能在杜鹃花耐热性中发挥着重要作用。因此,选择耐热性较好的映山红RsFSD2和RsCSD5基因作为主要候选基因,进一步探讨其在杜鹃花耐热性中的潜在作用。4、RsFSD2和RsCSD5的克隆与异源转化。克隆获得RsFSD2和RsCSD5基因的全长编码序列,并采用蘸花法转化拟南芥植株,最终阳检获得9个RsFSD2过表达株系和8个RsCSD5过表达株系。亚细胞定位结果表明,GFP:RsFSD2和GFP:RsCSD5融合蛋白主要定位于稳定转化的烟草细胞的叶绿体中。5、RsFSD2和RsCSD5过表达转基因拟南芥耐热性研究。在40℃高温胁迫3 d后,与野生型植株相比,转基因植株的绿叶更多,叶片萎蔫和卷曲现象更少,丙二醛含量更低,叶绿素含量更高,过氧化氢酶(Catalase,CAT)和SOD活性更高。基于转基因植株在高温胁迫下的表现,得出结论,RsFSD2和RsCSD5基因在提高植物对高温胁迫的耐受性方面具有关键功能。这些结果加深了我们对RsFSD2和RsCSD5基因在高温胁迫响应调控中的作用的了解,并为耐高温植物品种的栽培提供了候选基因。

关键词：杜鹃马缨杜鹃超氧化物歧化酶高温胁迫功能研究

拟南芥AtESP08基因在内质网胁迫通路中的分子机制研究

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拟南芥AtESP08基因在内质网胁迫通路中的分子机制研究

作者：安银贵州师范大学

学位级别：硕士

在逆境环境下,内质网(Endoplasmic Reticulum,ER)会累积大量错误折叠或未折叠蛋白,触发内质网胁迫(ER Stress),对细胞造成伤害。为应对此胁迫,细胞会激活一系列机制以促进蛋白质正确折叠。在此过程中,p24家族蛋白通过参与蛋白质运输和... 详细信息

在逆境环境下,内质网(Endoplasmic Reticulum,ER)会累积大量错误折叠或未折叠蛋白,触发内质网胁迫(ER Stress),对细胞造成伤害。为应对此胁迫,细胞会激活一系列机制以促进蛋白质正确折叠。在此过程中,p24家族蛋白通过参与蛋白质运输和未折叠蛋白应答(UPR)途径,来帮助细胞应对内质网胁迫,促进细胞生存。但目前关于拟南芥中p24家族在内质网胁迫响应中的具体功能和作用机制,仍未完全明了。因此,本研究着重探索拟南芥中p24家族,尤其是家族成员AtESP08在内质网胁迫途径中的生物学功能和作用机制。主要研究结果如下:1、鉴定了11个p24家族成员,分布在拟南芥1至3号染色体上,其中delta10与delta7为唯一的一组串联复制基因。每个基因均只含有4个外显子,亚细胞定位预测显示它们主要富集在内质网和高尔基体。系统发育和蛋白质结构分析揭示了家族成员在功能和进化上高度保守。2、通过分析p24家族启动子区域的顺式作用元件,我们发现存在多个响应逆境胁迫的顺式作用元件,从而突显了p24家族在逆境胁迫反应中的潜在重要性。利用前期内质网胁迫处理的拟南芥RNA-seq数据,我们检查了p24家族成员在内质网胁迫条件下的表达情况,旨在筛选与逆境响应相关的关键基因。结果表明,p24家族的δ亚家族成员AtESP08在衣霉素(TM)诱导下表达显著上调,这一发现表明AtESP08可能参与内质网胁迫响应。3、通过q RT-PCR验证,AtESP08在内质网胁迫诱导剂TM和二硫苏糖醇(DTT)的诱导下表达上调,说明其能够响应内质网胁迫反应。然而,在bzip28单突变体中,其表达受到部分抑制,表明AtESP08的表达受到内质网胁迫调节因子b ZIP28的影响。进一步的酵母单杂交和凝胶阻滞(迁移)实验(EMSA)验证了b ZIP28直接结合AtESP08基因启动子的ERSE-I元件,并调控其表达。4、通过CRISPR-Cas9技术敲除AtESP08后,拟南芥对内质网胁迫的抗性降低,生长缓慢,叶绿素含量及鲜重明显下降。进一步的遗传互补实验证实了AtESP08缺失会导致植物抗逆性下降,表明AtESP08是参与内质网胁迫响应的正向调控因子。5、在内质网胁迫下,atesp08功能缺失突变体会导致经典的UPR基因Bi P1,2、Bi P3、CNX1、PDIL1、PDI6和CRT1表达下调,表明AtESP08通过正调控UPR基因的表达促进细胞生存。综上所述,拟南芥p24家族成员AtESP08对内质网胁迫表现出显著的响应性,其表达的上调依赖于转录因子b ZIP28的调控。此外,AtESP08通过正向调控经典的UPR基因,有效缓解了内质网胁迫促进细胞生存。这一发现不仅为理解植物如何应对内质网胁迫提供了新的视角,也为未来研究植物抗逆境机制提供了重要的理论基础。

关键词：拟南芥 p24家族 AtESP08 内质网胁迫未折叠蛋白反应

小立碗藓PpFLS2L基因介导类细胞程序性死亡的研究

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小立碗藓PpFLS2L基因介导类细胞程序性死亡的研究

作者：何心洁贵州师范大学

学位级别：硕士

维管束植物FLS2（Flagllin sensitive 2）是富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶（Leucine-rich repeats RLK,LRR-RLK）家族中最早发现具有抗病功能的蛋白,通过其胞外的LRR结构域识别细菌的鞭毛蛋白介导植物对细菌的免疫反应。在小立碗... 详细信息

维管束植物FLS2（Flagllin sensitive 2）是富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶（Leucine-rich repeats RLK,LRR-RLK）家族中最早发现具有抗病功能的蛋白,通过其胞外的LRR结构域识别细菌的鞭毛蛋白介导植物对细菌的免疫反应。在小立碗藓中发现有与FLS2同源的基因,其结构域与维管束植物高度相似,将其命名为PpFLS2L（Physcomitrella patens Flagllin sensitive 2-like）。本研究利用小立碗藓PpFLS2L敲除株和异源表达PpFLS2L拟南芥研究其如何介导下游信号通路和防御反应。得到以下结论:1、苔藓植物FLS2与维管束植物FLS2功能出现分化经过生物信息学分析发现小立碗藓PpFLS2L的蛋白定位于细胞膜上,其蛋白结构域包含富含亮氨酸重复序列、蛋白激酶域、具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性,与维管束植物的FLS2结构相似。系统发育进化关系反映PpFLS2L与维管束植物亲缘关系较远。用几丁质（chitin）和病原真菌灰霉菌处理后PpFLS2L基因转录表达上调,同时诱导下游MAPK的磷酸化及其相关的防御反应。这表明,苔藓植物的PpFLS2L其功能可能与维管束植物发生了较大的分化,非维管束小立碗藓PpFLS2L与真菌的抗性有关,而维管束植物FLS2与细菌的抗性有关。2、MAPK途径是PpFLS2L下游的信号通路首先通过生物信息学分析、酵母双杂一对一验证和双分子荧光互补实验证实PpFLS2L与Pp MAPKKK1a/b相互作用。然后利用ELISA和蛋白免疫印迹检测几丁质处理后小立碗藓和拟南芥的MAPK酶活性和磷酸化,发现在小立碗藓FLS2-KO敲除株中MAPK酶活性和MPK4a/b的磷酸化水平都高于WT野生型;在拟南芥FLS2-OE异源表达株中MAPK酶活性和MPK3/6的磷酸化水平都低于Col-0野生型。这表明,在几丁质的诱导下PpFLS2L基因通过与Pp MAPKKK1a/b互作后,影响了下游MAPK磷酸化。3、PpFLS2L抑制类细胞程序性死亡为了研究PpFLS2L与类细胞程序性死亡的关系,通过特异性染色、程序性细胞死亡相关基因的表达和ROS含量的变化,证实了PpFLS2L与类细胞程序性死亡呈负相关。首先利用DAPI染色、原位末端转移酶标记（TUNEL）检测几丁质处理后的小立碗藓,发现小立碗藓FLS2-KO敲除株中发生类细胞程序性死亡的程度大于WT野生型。其次检测几丁质处理后小立碗藓和拟南芥细胞程序性死亡（PCD）相关基因的表达,发现PCD的负调控因子LSD1在小立碗藓FLS2-KO敲除株中的表达低于WT野生型,在拟南芥FLS2-OE异源表达株中的表达高于Col-0野生型;PCD的正调控因子MC1在小立碗藓中FLS2-KO敲除株中的表达高于WT野生型,在拟南芥FLS2-OE异源表达株中的表达低于Col-0野生型;PCD的相关基因CAT在小立碗藓中FLS2-KO敲除株中的表达高于WT野生型,在拟南芥FLS2-OE异源表达株中的表达低于Col-0野生型,说明PpFLS2L与类细胞程序性死亡呈负相关。最后检测几丁质处理和灰霉菌侵染后小立碗藓和拟南芥RBOHD的表达、ROS的含量和染色,发现在小立碗藓FLS2-KO敲除株中RBOHD的转录表达、ROS的含量、H2O2和O2-的产生比WT野生型多,在拟南芥FLS2-OE异源表达株中RBOHD的转录表达、ROS的含量、H2O2和O2-产生比Col-0野生型少,说明PpFLS2L参与苔藓植物与真菌的互作,与ROS的产生呈负相关。综上所述,PpFLS2L参与苔藓植物对真菌的抗病反应,并在真菌的感染下通过与Pp MAPKKK1a/b相互作用,影响下游MPK4a/b的磷酸化,负向调节ROS产生及其下游类细胞程序性死亡的发生。

关键词：小立碗藓几丁质 PpFLS2L MAPK 类细胞程序性死亡

改性磷石膏赤泥复合材料对镉砷的吸附机理及复合污染土壤修复研究

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改性磷石膏赤泥复合材料对镉砷的吸附机理及复合污染土壤修复研究

作者：商成梅贵州师范大学

学位级别：硕士

随着工农矿业的快速发展,工业副产品的排放和堆积量日益增加,导致农田重金属污染问题日益严重。其中,镉（Cd）和砷（As）的污染尤为突出,且它们容易形成复合污染,对生态环境产生巨大的破坏。由于Cd-As复合污染中不同元素的化学特性和形... 详细信息

随着工农矿业的快速发展,工业副产品的排放和堆积量日益增加,导致农田重金属污染问题日益严重。其中,镉（Cd）和砷（As）的污染尤为突出,且它们容易形成复合污染,对生态环境产生巨大的破坏。由于Cd-As复合污染中不同元素的化学特性和形态差异,修复工作变得异常困难。为了解决工业副产品大量堆积和Cd-As复合污染问题,本研究根据两大工业副产品磷石膏（PG）和赤泥（RM）的特性,采用镧（La）浸渍法,将PG和RM改性为一种新型复合材料L-PR。通过批量吸附实验探究L-PR对水体中单一和二元As、Cd的吸附效果,并运用SEM、XRD、FTIR和XPS等表征技术揭示其吸附机理。同时,以水稻为供试植物,通过淹水培养验证L-PR对Cd和As的调控效果,并借助分子生物学技术探讨L-PR对水稻的生理生化、土壤理化性质及酶活性、根际微生物群落和根系代谢物的影响。该研究成果可为开发高效、低成本、环保的钝化材料提供思路,为废弃物资源化利用提供理论指导,并为相关环境中的Cd、As污染治理修复技术提供参考。主要结论如下:（1）与原材料相比,镧（La）改性PG-RM材料（L-PR）表面变得明显粗糙而蓬松,颗粒堆积更为松散,比表面积和孔体积显著增大,孔径变小;同时,引入La-O官能团,H-O、Si-O等含氧官能团也发生了改变,是一种具有矿物表面和吸附能力的介孔材料。（2）L-PR对Cd（II）的去除效率超过97.57%,较原材料提高了24.5倍;对As（V）的去除效率高达99.00%,较原材料提高了29.5倍。且吸附效果受p H影响较小。L-PR对Cd（II）和As（Ⅴ）的吸附更符合二级动力学模型,在Cd（II）和As（V）共存的情况下,达到平衡所需的时间缩短。L-PR对Cd（II）的吸附更符合Freundlich模型,最大吸附量(Qmax)为18.904 mg/g;而对As（V）的吸附更符合Langmuir模型拟合度更高,最大吸附量(Qmax)为12.508 mg/g。L-PR吸附前后的表征结果显示,其对Cd（II）和As（V）的吸附机理包括静电引力、离子交换、络合和沉淀作用。在单独吸附Cd（II）时,主要以离子交换和沉淀为主要机制;而在共同吸附时,则以络合和沉淀作用为主。对于As（V）的吸附,则主要涉及离子交换和络合作用。（3）土壤淹水培养条件下,L-PR能显著降低土壤中有效态Cd和有效态As的含量,较CK分别降低了82.04%和29.99%。基于土壤理化性质与有效态Cd和有效态As的相关性分析,土壤p H、CEC等理化性质与土壤有效态Cd、有效态As含量呈负相关。进一步说明L-PR可能通过改变土壤p H、CEC等理化性质,从而降低有效态Cd和有效态As的含量,并促使非稳定态Cd和As向更稳定的残渣态转化。值得注意的是,土壤Cd与As之间存在一定的协同修复作用。（4）L-PR能显著降低水稻中Cd和As含量,较CK分别降低了61.54%（地下）、71.90%（地上）、77.57%（地下）和77.55%（地上）。同时,与CK相比,水稻叶片中SOD、POD、CAT活性和MDA含量分别降低了12.40%、32.08%、3.29%和26.73%,这表明L-PR的施加有效缓解了Cd和As对水稻的胁迫。（5）经L-PR处理后,土壤微生物群落丰度与多样性与CK处理间无显著变化,但土壤微生物群落结构与CK相比存在显著差异,Myxococcota、Proteobacteria和Bacteroidota优势菌群的相对丰度上升。且与土壤酶活性呈显著正相关,而与有效态Cd和有效态As含量呈显著负相关。这意味着L-PR可能通过调控土壤有效态Cd和有效态As的含量优化土壤微生群落结构,从而提升土壤酶活性,改善土壤生物环境。（6）通对L-PR和CK处理组的水稻根系组织进行广靶代谢组学分析,共检测到783种代谢物,其中筛选到312种差异代谢物（125种上调,187种下调）。对差异代谢物进行KEGG注释分析,发现主要代谢途径有5条,分别为:丁酸代谢、柠檬酸循环、倍萜和三萜类生物合成、二萜类生物合成及胡萝卜素、单宁和蜡类生物合成,主要涉及有机酸、氨基酸、萜类和脂质类的代谢过程。

关键词：磷石膏赤泥改性镉砷复合污染吸附机理钝化

埃塞俄比亚芥SOD基因家族鉴定及BcaSOD1耐受镉胁迫功能验证分析

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埃塞俄比亚芥SOD基因家族鉴定及BcaSOD1耐受镉胁迫功能验证分析

作者：庞彪贵州师范大学

学位级别：硕士

随着城市化和工业化的发展,重金属镉（Cd）污染已成为土壤和水中最严重的污染问题。Cd通常以Cd2+的形式溶解在环境中,易被有机体吸收。动植物吸收过量的Cd会严重阻碍生长和发育。埃塞俄比亚芥（Brassica carinata）,又称埃芥,是十字花... 详细信息

随着城市化和工业化的发展,重金属镉（Cd）污染已成为土壤和水中最严重的污染问题。Cd通常以Cd2+的形式溶解在环境中,易被有机体吸收。动植物吸收过量的Cd会严重阻碍生长和发育。埃塞俄比亚芥（Brassica carinata）,又称埃芥,是十字花科芸薹属植物,由于驯化时间较短,相对于其它芸薹属作物,埃芥具有优良的抗旱、耐高温、抗病虫等特性。此外,实验室前期研究证明埃芥对Cd胁迫有很强的适应能力和富集能力,但其适应Cd胁迫的分子机制尚不明晰。从埃芥中挖掘耐Cd相关基因,解析其具体功能,有助于我们深入理解埃芥对Cd胁迫响应的分子机制,同时为有效利用埃芥进行生物修复提供指导。基于转录组数据及荧光定量分析（qRT-PCR）,在高浓度Cd胁迫下,埃芥的一个超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）基因（BcaSOD1）表达量显著提升,该基因可能增强了埃芥的耐Cd性。为证实该基因对Cd胁迫的耐受作用,本研究成功克隆BcaSOD1基因,并构建了该基因的拟南芥过表达株系,表型及生理生化分析证实了过表达BcaSOD1显著提高拟南芥对Cd的耐受性,转录组及qRT-PCR分析发现BcaSOD1可能通过调控重金属解毒相关基因的表达,同时促进精氨酸（Arg）合成基因的表达增强了对Cd的耐受性。本研究初步解析了埃芥SOD基因的耐Cd分子机制,为埃芥的Cd修复利用提供了理论基础。主要研究结果如下:（1）在埃芥中,鉴定出39个成员,并将它们分成了FeSOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD三个亚族。根据这些SOD成员在染色体上的位置分布顺序,给它们命名为Bca CSD1-17、BcaFSD1-11和Bca MSD1-11。顺式作用元件分析发现埃芥SOD家族基因可能在生长发育过程、响应逆境胁迫以及调节激素信号通路中发挥着重要作用。共线性分析证明了埃芥与黑芥、甘蓝亲缘关系密切。基于埃芥转录组数据分析SOD家族基因的表达水平发现SOD基因在Cd胁迫下的表达水平趋势不一致,其中BcaSOD1在Cd胁迫下根和地上部分中的表达量均显著升高。（2）成功克隆了埃芥BcaSOD1基因,其CDS序列全长639 bp。qRT-PCR结果分析表明,在Cd胁迫下,BcaSOD1在根和地上部分的表达量均上调。亚细胞定位分析结果表明,BcaSOD1定位于细胞核、质膜及线粒体。将BcaSOD1基因构建在pBI121植物表达载体上,并获得过表达BcaSOD1基因的拟南芥植株。在150μM CdCl2胁迫处理下,过表达转基因株系的发芽率显著高于野生型拟南芥株系（WT）;幼苗期在2.5 mM CdCl2胁迫处理下,WT植株表现出生长迟缓、叶片坏死和黄化现象,而转基因株系没有出现这些现象,此外,与WT植株相比,转基因株系的抗氧化酶活性、脯氨酸（Pro）及叶绿素含量显著升高,而丙二醛（MDA）含量显著降低,表明BcaSOD1能够显著提高拟南芥对Cd的耐受性。（3）本研究对转基因株系进行Cd含量测定发现,转基因株系根的Cd含量显著高于WT,但是转基因株系和WT的地上部Cd含量无显著差异。此外,qRT-PCR结果显示,在Cd处理下,重金属解毒相关基因（AtIREG2、AtMTP3、AtHMA3和AtNAS4）在转基因株系根系中显著上调表达,这些基因很可能参与了转基因株系根系对Cd的吸收。对转基因株系地上部分进行转录组分析以及qRT-PCR验证,证实外源BcaSOD1通过诱导2个精氨酸（Arg）生物合成基因（AtGDH1和AtGDH2）的表达,同时抑制Arg生物合成的负调控因子AtARGAH1的表达。随后证实在Cd处理下,与WT相比,转基因株系中Arg含量显著升高,这与Pro含量升高一致。表明BcaSOD1可能通过调控重金属解毒相关基因的表达,同时诱导Arg合成相关基因的表达以及促进Arg的生物合成,进而增强Cd耐受性。本研究证明了BcaSOD1能够增强转基因拟南芥对Cd的耐受性,并揭示了该基因的作用分子机制,为植物耐Cd的分子机制提供了有价值的见解。

关键词：埃塞俄比亚芥 BcaSOD1 镉胁迫转录组分析精氨酸

果胶裂解酶FvePL1和FvePL8在森林草莓中的表达和功能研究

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果胶裂解酶FvePL1和FvePL8在森林草莓中的表达和功能研究

作者：孙贵连贵州师范大学

学位级别：硕士

果胶裂解酶(Pectate lyase,PL,EC4.***.2.2)可通过果胶代谢直接调控细胞壁的动态平衡,从而通过影响细胞分化和分离来参与植物的形态发生、雌雄蕊发育、果实成熟、植物抗逆等过程。森林草莓(Fragaria vesca)已逐渐成为研究蔷薇科植物及果... 详细信息

果胶裂解酶(Pectate lyase,PL,EC4.***.2.2)可通过果胶代谢直接调控细胞壁的动态平衡,从而通过影响细胞分化和分离来参与植物的形态发生、雌雄蕊发育、果实成熟、植物抗逆等过程。森林草莓(Fragaria vesca)已逐渐成为研究蔷薇科植物及果实发育的模式植物,前期许多研究主要围绕关于PL在蔷薇科果实软化中的作用,而在花粉和叶片中的功能研究却鲜有报道,因此,本研究通过生信分析、基因表达、亚细胞定位和遗传转化等方法研究FvePL1和FvePL8对森林草莓植株、花粉发育和花粉管萌发的影响以及作用机制,为蔷薇科果树的遗传改良提供理论基础和分子靶标。主要研究结果如下:1.果胶裂解酶FvePL1和FvePL8均具有Amb＿all保守结构域;系统进化树显示它们与双子叶植物的栽培草莓、拟南芥和番茄的亲缘关系近。亚细胞定位显示FvePL1蛋白主要定位于细胞壁和细胞质,FvePL8蛋白则定位于细胞壁和细胞膜;全发育期时空表达谱和原位杂交结果显示FvePL1基因在叶片、花药和果实等多器官中表达,而FvePL8基因只在花粉和花药中特异表达。2.果胶裂解酶FvePL1基因在森林草莓中的生物学功能。利用遗传转化分别获得FvePL1的超表达和RNAi转基因植株,进一步通过q RT-PCR检测,FvePL1在FvePL1-OE植株中表达均上调,是野生型Yellow Wonder(YW)的2倍以上,最高达到9倍;在FvePL1-RNAi植株中,FvePL1表达均下调,是YW的0.15～0.2倍。通过对FvePL1-OE和FvePL1-RNAi植株进行形态学和细胞学观察,FvePL1-OE与YW相比无明显差异,而FvePL1-RNAi植株的花粉活性低,大部分花粉形态畸形,花粉萌发孔向内凹陷,花粉粒表面纹路紊乱,花粉粒细胞壁结构不完整。在花药Stage 9阶段,小孢子发育异常,四个药囊花粉数量少,发育到Stage 12阶段,绒毡层降解延迟,导致花粉畸形败育。通过体外萌发发现,FvePL1-RNAi的花粉萌发率低、花粉管长度显著缩短;体内萌发发现,FvePL1-RNAi的花粉管不能穿过柱头到达胚珠完成受精,导致种子败育,进而导致果实不能发育。此外,与YW相比较,FvePL1的沉默表达导致草莓叶片卷曲、质地变硬、果胶含量升高,且能增强森林草莓的抗旱性。3.为了研究FvePL8的生物学功能,通过遗传转化分别获得FvePL8的超表达和RNAi转基因植株,进一步通过q RT-PCR检测FvePL8在FvePL8-OE和FvePL8-RNAi植株的表达水平,FvePL8在FvePL8-OE植株中表达均上调,是YW的2～4倍,在FvePL8-RNAi植株表达均下调,是YW的0.05～0.2倍。形态学和细胞学观察表明FvePL8-OE与YW相比无明显差异,而FvePL8-RNAi的花粉活性低、花粉数量少、大部分花粉形态畸形、花粉萌发孔向内凹陷、花粉粒表面纹路紊乱,凹陷花粉粒细胞壁明显变厚,细胞内部的物质降解缺失。在花药Stage 9阶段,小孢子发育异常,发育到Stage 12阶段,绒毡层没有完全降解,导致花粉畸形败育;通过体外萌发发现,FvePL8-RNAi的花粉萌发率低、花粉管长度显著缩短;体内萌发发现,虽然FvePL8-RNAi的雌性发育正常,但花粉管不能穿过柱头到达胚珠完成受精,导致种子败育,进而导致果实不能发育。此外,通过酵母单杂实验证明FveNF-YB-7结合CCAAT顺式元件,调控FvePL8的表达,参与森林草莓花粉发育。

关键词：森林草莓果胶裂解酶基因功能花粉发育