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从江香猪附睾发育中自噬相关分子的表达与分布

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农业生物技术学报 2022年第12期30卷 2354-2362页

作者：王涵蒙利洁龚婷贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室贵州大学动物科学学院

自噬作为一种主要的降解/再循环途径，在维持细胞内稳态和生殖发育中发挥了重要作用。为探讨自噬在公猪(Sus scrofa)附睾发育过程中发挥的潜在作用，本研究以从江香猪附睾为对象，利用Western blot、免疫组织化学染色和qRT-PCR方法，分... 详细信息

自噬作为一种主要的降解/再循环途径，在维持细胞内稳态和生殖发育中发挥了重要作用。为探讨自噬在公猪(Sus scrofa)附睾发育过程中发挥的潜在作用，本研究以从江香猪附睾为对象，利用Western blot、免疫组织化学染色和qRT-PCR方法，分析了附睾在出生后15 d (初情期前)、30 d (初情期)、60 d (初情期后)和180 d (性成熟期) 4个时期自噬相关分子的表达和分布。Western blot结果显示，Beclin1在60 d表达量最高、180 d表达量最低；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)在30 d表达量最高、180 d最低；微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, MAP1LC3/LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ在180 d最高，在30和60 d最低。免疫组织化学染色结果显示，Beclin1在15、30和180 d集中分布于附睾上皮主细胞和微绒毛，在60 d主要分布于附睾上皮周围的肌样细胞；LC3在15、30和60 d附睾中集中分布于主细胞和微绒毛，但180 d在上皮窄细胞有特异性表达。qRT-PCR结果显示，自噬相关基因Beclin1表达量在15 d最高、180 d最低，15和30 d差异不显著；MAP1LC3B基因表达量在180 d最高、60 d最低，各日龄段差异显著(P<0.05)。自噬相关蛋白12 (autophagy related protein 12, Atg12)和Unc-51样激酶1 (Unc-51-like kinase 1, ULK1)基因表达量变化趋势一致，在180 d最高、60 d最低，各日龄段差异显著(P<0.05);mTOR基因表达量在30 d最高、15 d最低，各日龄段差异显著(P<0.05)。上述结果提示，从江香猪附睾发育过程中可能存在mTOR介导的自噬调节通路。本研究为探讨自噬参与附睾发育的调节机制提供基础资料。

关键词：从江香猪附睾发育自噬

鸡E2F1和TBP蛋白的相互作用及其基因组织表达特性分析

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农业生物技术学报 2023年第5期31卷 1022-1031页

作者：唐宏王燕碧赵采芹王小亚石海英邢静如段志强贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室贵州大学动物科学学院

E2F转录因子1 (E2F transcription factor 1, E2F1)和TATA结合蛋白(TATA-binding protein, TBP)共同参与了基因转录调节。为探究鸡(Gallus gallus) E2F1和TBP蛋白的相互作用及其基因组织表达特性，本研究通过构建鸡E2F1和TBP基因的重组... 详细信息

E2F转录因子1 (E2F transcription factor 1, E2F1)和TATA结合蛋白(TATA-binding protein, TBP)共同参与了基因转录调节。为探究鸡(Gallus gallus) E2F1和TBP蛋白的相互作用及其基因组织表达特性，本研究通过构建鸡E2F1和TBP基因的重组真核表达载体，共同转染人胚胎肾细胞(HEK-293T)后，利用间接免疫荧光和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)实验验证两者的相互作用；采用qPCR检测鸡E2F1、TBP基因在胚胎发育14 d (E14 d)、出壳后1日龄(H1 d)、7日龄(H7 d)和14日龄(H14 d)不同组织中的表达情况。结果表明，成功构建了鸡E2F1和TBP基因的重组真核表达载体pCMV-HA-E2F1、pCMV-Myc-TBP，其在细胞中得到正确表达且两者均主要定位在细胞核。Co-IP结果表明，鸡E2F1和TBP蛋白存在相互作用。组织表达特性分析表明，鸡E2F1和TBP基因在4个阶段的不同组织中均有表达，且其表达水平存在显著差异(P<0.05)；在E14 d时，E2F1和TBP基因在肺脏中表达较高，在脑组织中的表达较低；H1 d时，两者在肝脏中表达较高，在脑组织中的表达较低；H7 d时，两者在脑组织中表达较高，在腿肌中的表达较低；H14 d时，两者在肺脏、肝脏和心脏中表达较高，在胸肌、腿肌中的表达较低。鸡E2F1和TBP蛋白在细胞核中存在相互作用，E2F1和TBP基因在4个阶段的多种组织中均有表达，但以肺脏和肝脏中的相对表达较高。本研究为E2F1和TBP蛋白互作调控鸡肺脏和肝脏组织发育的作用机理提供参考。

关键词：鸡转录因子E2F1 (E2F1) TATA结合蛋白(TBP) 蛋白相互作用亚细胞定位

从江香猪AR在附睾组织发育过程中的表达模式

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农业生物技术学报 2021年第6期29卷 1103-1112页

作者：蒙利洁王维勇徐永健李子清万素芳牟琪杨艺龚婷贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室贵州大学动物科学学院

附睾是精子运输、成熟和储存的主要场所,其结构、功能及基因表达高度依赖雄激素/雄激素受体(androgen receptor, AR)调控。AR在多种动物附睾高表达,调控附睾上皮和管腔液的功能,对于精子成熟具有重要意义。为探究AR在出生后从江香猪(Sus... 详细信息

附睾是精子运输、成熟和储存的主要场所,其结构、功能及基因表达高度依赖雄激素/雄激素受体(androgen receptor, AR)调控。AR在多种动物附睾高表达,调控附睾上皮和管腔液的功能,对于精子成熟具有重要意义。为探究AR在出生后从江香猪(Sus scrofa)附睾中的表达特征,本研究利用qRT-PCR、免疫组化和Western blot技术检测AR在从江香猪初情期前(15 d)、初情期(30 d)、初情期后(60 d)和性成熟期(180 d)四个关键时期附睾组织的表达变化。qRT-PCR结果显示,AR基因在15、30、60和180 d从江香猪附睾组织均有表达,且伴随日龄的增加而增高,在180 d表达最高;在不同区段中,AR基因在Ⅳ区(附睾尾)表达最高、Ⅰ区(附睾头)表达量最少(P<0.05);除Ⅰ区与Ⅲ区(附睾体)表达差异不显著外,其余区段间均呈显著差异(P<0.05)。Western blot结果显示,AR在不同日龄及附睾5个区段中的蛋白表达丰度与mRNA水平呈现一致的变化趋势。免疫组化染色也呈现一致的变化趋势,AR主要定位于附睾上皮细胞的细胞核及精子上,并呈现附睾区段差异表达模式。总之,本研究发现AR的表达从15 d增强至60 d,并维持高表达至180 d,主要分布于附睾上皮细胞的细胞核和精子,表明附睾AR表达呈阶段特异性和区段特异性;此外,AR在180 d的高表达可能与该时期附睾内存在大量精子有关。本研究为深入探讨从江香猪附睾内精子成熟机制提供参考依据。

关键词：从江香猪附睾雄激素受体(AR) 时空表达特异性表达

沙棘黄酮对广西小麻鸭生长性能、肉品质、血清生化指标及免疫器官指数的影响

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动物营养学报 2023年第3期35卷 1638-1648页

作者：姚炳浓廖富友杨娇一王姣祝保国杨胜林贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室贵阳550025 贵州大学动物科学学院贵阳550025

本试验旨在研究饲粮中添加沙棘黄酮对广西小麻鸭生长性能、肉品质、血清生化指标及免疫器官指数的影响。试验选取4周龄广西小麻鸭(雌鸭)120只,随机分为4组,每组6个重复,每个重复5只。对照组饲喂基础饲粮,3个试验组分别饲喂在基础饲粮基... 详细信息

本试验旨在研究饲粮中添加沙棘黄酮对广西小麻鸭生长性能、肉品质、血清生化指标及免疫器官指数的影响。试验选取4周龄广西小麻鸭(雌鸭)120只,随机分为4组,每组6个重复,每个重复5只。对照组饲喂基础饲粮,3个试验组分别饲喂在基础饲粮基础上添加0.05%、0.10%、0.15%沙棘黄酮的试验饲粮。试验包括预试期和正试期,其中预试期7 d,正试期70 d。结果显示:1)饲粮中添加0.05%~0.15%的沙棘黄酮对广西小麻鸭的末重、平均日增重、平均日采食量、料重比均无显著影响(P>0.05)。2)与对照组相比,饲粮中添加0.05%和0.10%沙棘黄酮显著降低胸肌的滴水损失率(P<0.05),添加0.10%沙棘黄酮显著降低腿肌的pH 45 min(P<0.05)。3)试验第35天,与对照组相比,0.05%组血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著提高(P<0.05),0.10%组血清丙二醛(MDA)含量显著降低(P<0.05),0.15%组血清总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-L)含量显著降低(P<0.05),0.05%组、0.01%组和0.15%组血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-L)含量与总超氧化物歧化酶(T-SOD)、铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)活性均显著提高(P<0.05);试验第70天,与对照组相比,0.10%组和0.15%组血清T-SOD活性均显著提高(P<0.05),0.15%组血清甘油三酯(TG)和LDL-L含量显著降低(P<0.05),0.05%组、0.01%组和0.15%组血清CuZn-SOD活性均显著提高(P<0.05),0.05%组、0.01%组和0.15%组血清MDA含量均显著降低(P<0.05)。4)饲粮中添加0.05%沙棘黄酮可显著提高广西小麻鸭的胸腺指数和脾脏指数(P<0.05)。试验第35天,与对照组相比,0.05%组血清免疫球蛋白G(IgG)含量显著提高(P<0.05),0.05%组、0.01%组和0.15%组血清免疫球蛋白M(IgM)含量均显著提高(P<0.05),0.10%组和0.15%组血清免疫球蛋白A(IgA)含量均显著降低(P<0.05);试验第70天,与对照组相比,0.05%组血清IgA和IgM含量显著提高(P<0.05),0.10%组和0.15%组血清IgG含量均显著降低(P<0.05)。综上所述,饲粮中添加沙棘黄酮可改善广西小麻鸭的肉品质,调节脂质代谢,提高抗氧化能力和免疫力。综合来看,在5~14周龄广西小麻鸭饲粮中添加0.05%沙棘黄酮最适宜。

关键词：沙棘黄酮广西小麻鸭生长性能肉品质免疫指标脂质代谢抗氧化指标

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新城疫病毒M蛋白在病毒毒力和复制中的作用研究进展

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微生物学报 2021年第9期61卷 2663-2674页

作者：段志强周磊韩一帆赵佳福嵇辛勤贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室贵州贵阳550025 贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025

M蛋白是新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基因组编码的一种非糖基化膜相关蛋白,主要位于病毒囊膜内表面,构成病毒囊膜与核衣壳连接的支架。研究表明,M蛋白是一种细胞核-细胞质穿梭蛋白,在抑制细胞基因转录和蛋白质合成以及协助... 详细信息

M蛋白是新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基因组编码的一种非糖基化膜相关蛋白,主要位于病毒囊膜内表面,构成病毒囊膜与核衣壳连接的支架。研究表明,M蛋白是一种细胞核-细胞质穿梭蛋白,在抑制细胞基因转录和蛋白质合成以及协助病毒粒子组装和出芽方面发挥了重要作用。目前,国内外对NDV毒力和复制的关系研究主要集中在病毒的F、HN和V蛋白以及RNP复合体,但是近年来研究人员利用反向遗传操作技术研究发现M蛋白与NDV毒力和复制也存在一定的联系。因此,本文主要对NDV M蛋白的结构特征、M蛋白对NDV毒力和复制的影响及其作用机制进行综述,以期为NDV M蛋白的功能研究提供新的理论参考。

关键词：新城疫病毒 M蛋白毒力病毒复制

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黔北麻羊HSD3B1基因真核表达载体构建及其对卵巢颗粒细胞的影响

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农业生物技术学报 2020年第9期28卷 1604-1613页

作者：洪磊陈祥敖叶周志楠唐文韦仕南贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室贵州大学动物科学学院

3β-羟基类固醇脱氢酶-1 （3β-hydroxysteroid dehydrogenase 1, HSD3B1）是类固醇激素家族中的关键成员之一,与动物的繁殖性状密切相关。为了克隆黔北麻羊（Capra hircus） HSD3B1基因,构建真核表达载体,探究其对产羔性状相关基因在... 详细信息

3β-羟基类固醇脱氢酶-1 （3β-hydroxysteroid dehydrogenase 1, HSD3B1）是类固醇激素家族中的关键成员之一,与动物的繁殖性状密切相关。为了克隆黔北麻羊（Capra hircus） HSD3B1基因,构建真核表达载体,探究其对产羔性状相关基因在卵巢颗粒细胞表达的影响,本研究采集黔北麻羊卵巢组织进行卵巢颗粒细胞培养并提取组织中的总RNA,反转录为cDNA,克隆黔北麻羊HSD3B1基因（GenBank ***;01135932.1） CDS区全长序列,并进行生物信息学分析;同时将构建的HSD3B1基因真核表达载体,转染至卵巢颗粒细胞,qRT-PCR检测HSD3B1、山羊产羔性状相关的骨形成蛋白15基因（bone morphogenetic protein 15, BMP15）、生长分化因子9基因（growth differentiation factor 9, GDF9）、骨形态发生蛋白受体1B基因（bone morphogenetic protein receptor type 1B, BMPR-1B）的mRNA表达水平。结果发现:T-克隆的黔北麻羊HSD3B1基因CDS区为1 122 bp,编码373个氨基酸,与NCBI上登录的绵羊（Ovis aries）的mRNA序列相同;蛋白预测结果显示:黔北麻羊HSD3B1蛋白的分子式为C1940H3002N506O543S15,相对分子质量为42.583 14 kD;等电点为7.96;遗传进化树分析得出,黔北麻羊HSD3B1基因与牛（Bos taurus）的遗传距离最近;qRT-PCR结果显示,转染实验组HSD3B1表达量极显著高于空白组（P<0.01）,产羔性状相关的GDF9基因表达量极显著高于空白对照组（P<0.01）,BMP15基因的表达量显著高于空白对照组（P<0.05）,表明HSD3B1基因的超表达可以促进产羔相关的GDF9基因和BMP15基因在卵巢颗粒细胞的表达。本研究成功构建pEGFP-N3-HSD3B1真核表达载体,检测HSD3B1基因对黔北麻羊产羔性状相关基因的表达影响,为进一步研究HSD3B1基因对黔北麻羊产羔性状的影响提供基础资料。

关键词：黔北麻羊 3β-羟基类固醇脱氢酶-1 (HSD3B1) T-克隆生物信息学分析真核载体构建

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鸡Prox1蛋白核定位信号的预测与鉴定

农业生物技术学报 2020年第11期28卷 2011-2022页

作者：袁超高洪波周磊韩一帆段志强贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室/动物科学学院

Prox1 (prospero-related homeobox protein 1)作为转录因子,在胚胎发育与癌症发生中具有重要作用。为预测和鉴定鸡(Gallus gallus) Prox1蛋白核定位信号(nuclear localization signal, NLS),首先对鸡Prox1蛋白进行截短表达,通过荧光观察和亚细胞定位分析确定其NLS所在区域。运用在线软件预测鸡Prox1蛋白截短体中假定的NLS (putative NLS, pNLS),构建鸡Prox1蛋白pNLS缺失体重组真核表达载体并转染细胞,通过观察缺失体重组蛋白的亚细胞定位确定NLS;进一步将鉴定的鸡Prox1蛋白NLS进行保守性分析,并检测其对外源蛋白的核输入能力;另外,利用NLS点突变鉴定鸡Prox1蛋白NLS中的关键碱性氨基酸位点。结果表明,鸡Prox1蛋白N端(1～220 aa)具有细胞核定位特征,NLS预测结果显示其N端存在2个pNLS,分别为pNLS1 (KRRR)和pNLS2 (RAKRAR)。对pNLS缺失体重组蛋白的亚细胞定位分析发现,pNLS1和pNLS2共同决定了鸡Prox1蛋白的细胞核定位。另外,鸡Prox1蛋白NLS1和NLS2基序在其他禽类、人(Homo sapiens)和不同哺乳动物间均保守,并且与SV40大T抗原NLS具有相同的核输入能力。此外,碱性氨基酸点突变实验证实,K15、R16、R18和K165、R166、R168分别是NLS1和NLS2的关键碱性氨基酸位点,这些位点共同决定了鸡Prox1蛋白的细胞核定位。本研究证实鸡Prox1蛋白存在2个高度保守的NLS,两者共同决定细胞核定位,为后续研究鸡Prox1蛋白细胞核定位的分子机制及功能提供参考依据。

关键词：鸡 Prox1(prospero-related homeobox protein 1) 核定位信号亚细胞定位

CYP17A1基因敲低对山羊睾丸间质细胞睾酮合成和睾丸发育相关基因表达的影响

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农业生物技术学报 2023年第12期31卷 2535-2544页

作者：张远陈祥张艳付开斌唐文陈家靖嵇桃桃杨沛方贵州大学动物科学学院/高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室

细胞色素P450c17(cytochrome P450c17, CYP17A1)是胆固醇合成雄激素途径中的限速酶，在雄激素生物合成中具有关键作用。明确CYP17A1对山羊(Capra hircus)睾酮合成和睾丸发育的影响，对于提高公羊繁殖力具有重要意义。本研究以黔北麻羊... 详细信息

细胞色素P450c17(cytochrome P450c17, CYP17A1)是胆固醇合成雄激素途径中的限速酶，在雄激素生物合成中具有关键作用。明确CYP17A1对山羊(Capra hircus)睾酮合成和睾丸发育的影响，对于提高公羊繁殖力具有重要意义。本研究以黔北麻羊为研究对象，构建CYP17A1的RNA干扰载体并转染至睾丸间质细胞，以qRT-PCR和Western blot技术检测CYP17A1基因敲低效果，以CCK-8(Cell Counting Kit-8)检测CYP17A1敲低对睾丸间质细胞增殖的影响；利用qRT-PCR检测增殖相关基因、睾酮合成相关基因以及睾丸发育相关基因的表达水平。结果显示，CYP17A1在各月龄的睾丸和附睾组织中均有表达，其基因敲低效果明显，CYP17A1基因和蛋白表达均极显著下调(P繁殖性状的影响提供基础资料。

关键词：细胞色素P450c17(CYP17A1) 黔北麻羊睾丸间质细胞细胞增殖睾丸发育

与鸡斑点型锌指结构蛋白互作的细胞蛋白筛选及其功能分析

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农业生物技术学报 2022年第5期30卷 944-956页

作者：王燕碧赵采芹唐宏周磊韩一帆邢静如石海英段志强贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室/动物科学学院

斑点型锌指结构蛋白(speckle-type POZ (pox virus and zinc finger protein) protein, SPOP)是E3泛素连接酶Cullin 3家族中的一员，通过与底物蛋白的互作促进底物的泛素化和降解，从而影响底物蛋白的生物学功能。本研究构建了鸡(Gallus... 详细信息

斑点型锌指结构蛋白(speckle-type POZ (pox virus and zinc finger protein) protein, SPOP)是E3泛素连接酶Cullin 3家族中的一员，通过与底物蛋白的互作促进底物的泛素化和降解，从而影响底物蛋白的生物学功能。本研究构建了鸡(Gallus gallus) SPOP基因的重组真核表达载体pCMV-HA-SPOP，并将其和空载体pCMV-HA分别转染鸡胚成纤维细胞系(DF-1)，提取细胞总蛋白，利用免疫共沉淀(coimmunoprecipitation, Co-IP)联合质谱分析技术筛选和鉴定与鸡SPOP蛋白互作的细胞蛋白，并对其进行基因本体(Gene Ontology, GO)功能注释、KEGG信号通路和蛋白互作网络分析。进一步利用荧光共定位和Co-IP实验，对鸡SPOP蛋白和筛选的细胞蛋白26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基11 (26S proteasome non ATPase regulatory subunit 11, PSMD11)进行相互作用验证。结果显示，重组蛋白HA-SPOP在细胞内得到正确表达，并且主要定位在细胞核和细胞质。利用Co-IP联合质谱分析技术共筛选到158个与鸡SPOP蛋白相互作用的细胞蛋白，主要分布在细胞核、细胞骨架和细胞质，参与了酶活性、核酸结合和蛋白质加工等生物学过程及代谢、核糖体组成和生物调节等信号通路。蛋白互作网络图分析发现，与鸡SPOP蛋白互作的细胞蛋白之间存在复杂的相互作用网络，其中蛋白酶体激活物复合物亚单位3 (proteasome activator complex subunit 3, PSME3)、PSMD11和H2A组蛋白家族成员Z (H2A histone family, member Z,H2AFZ) 3个蛋白可能与鸡SPOP蛋白具有直接的相互作用。荧光共定位和Co-IP实验结果表明，鸡SPOP蛋白与PSMD11蛋白存在相互作用，并且可以改变PMSD11蛋白的细胞内定位。本研究为进一步探究鸡SPOP蛋白在细胞内的生物学功能提供参考。

关键词：鸡斑点型锌指结构蛋白(SPOP) 免疫共沉淀(Co-IP) 功能分析