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PEDV结构蛋白颉颃IFN-Ⅰ应答的分子机制研究进展

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黑龙江畜牧兽医 2024年第9期 30-34,118页

作者：陈兰韦秒粘张蓉陈泽周碧君王开功单春兰朱二鹏程振涛贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室贵阳550025

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)具有很高的发病率和死亡率,尤其是在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)高致病性变异株(GⅡ型毒株)出现以来,更是对全球养猪业构成了巨大威胁。病毒感染宿主之后,宿... 详细信息

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)具有很高的发病率和死亡率,尤其是在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)高致病性变异株(GⅡ型毒株)出现以来,更是对全球养猪业构成了巨大威胁。病毒感染宿主之后,宿主会激活抗病毒天然免疫应答机制。干扰素(interferon,IFN)作为一类抵御病毒感染的关键分子,特别是Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)可通过激活各种免疫细胞和共刺激分子来颉颃病毒的增殖。与此同时,为实现在宿主内的持续复制,许多病毒建立了颉颃宿主机体IFN-Ⅰ应答的多种分子机制,进而实现免疫逃逸。PEDV编码的多种结构蛋白可以颉颃宿主IFN-Ⅰ免疫应答。文章综述了PEDV结构蛋白颉颃IFN-Ⅰ免疫应答的分子机制,以期为深入阐释PEDV免疫逃逸的分子机制与开发PEDV新型靶向药物和建立防控新策略提供科学参考。

关键词：猪流行性腹泻病毒结构蛋白免疫逃逸 Ⅰ型干扰素分子机制

羊肺炎支原体感染对贵州不同品种羊TLRs MyD88通路因子转录水平的影响

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中国动物传染病学报 2024年第1期32卷 26-35页

作者：李梅杨源王军陈静杨鹏成虹松岳筠张双翔程振涛贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室贵阳550025 贵州省动物疫病预防控制中心贵阳550008

羊肺炎支原体(Mo)可引起山羊、绵羊发生支原体肺炎。本研究旨在分析Mo感染对贵州不同品种羊Toll样受体(TLRs)MyD88通路因子基因转录水平的影响,进而分析不同品种羊对Mo感染的差异性。本研究以Mo人工感染贵州5个主要品种羊,应用TaqMan RT... 详细信息

羊肺炎支原体(Mo)可引起山羊、绵羊发生支原体肺炎。本研究旨在分析Mo感染对贵州不同品种羊Toll样受体(TLRs)MyD88通路因子基因转录水平的影响,进而分析不同品种羊对Mo感染的差异性。本研究以Mo人工感染贵州5个主要品种羊,应用TaqMan RT-qPCR方法对不同品种试验羊肺脏和血液样本TLRs MyD88通路因子基因转录水平进行定量检测与分析。结果显示,不同品种羊感染Mo后,MyD88、TRAF6、NF-κB、FOS、JUN基因mRNA相对表达量均显著上调(P贵州黑山羊、贵州白山羊血液和肺脏样本中MyD88、FOS基因转录水平上调倍数均显著高于感染未死亡的波尔山羊、湖羊(P研究结果表明,贵州不同品种羊对Mo的易感程度与TLRs MyD88通路因子转录水平有关,为研究Mo对于不同品种羊的致病机制提供基础研究资料。

关键词：羊肺炎支原体 Toll样受体 MyD88通路因子转录分析

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鸡毒支原体P31蛋白原核表达及膜定位鉴定

中国动物传染病学报 2024年第4期32卷 85-90页

作者：李梅杨美岳筠王柏林宋春朱二鹏单春兰文明程振涛贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室贵阳550025 贵州省动物疫病预防控制中心贵阳550008

为筛选鸡毒支原体(MG)膜蛋白,利用生物信息学软件对其进行序列分析后,选择不含跨膜区的714 bp基因片段作为靶标蛋白进行原核表达(因其分子量约31 kDa,故而命名为P31蛋白),表达P31蛋白并进行纯化后制备兔多克隆抗体,运用ELISA方法检测抗... 详细信息

为筛选鸡毒支原体(MG)膜蛋白,利用生物信息学软件对其进行序列分析后,选择不含跨膜区的714 bp基因片段作为靶标蛋白进行原核表达(因其分子量约31 kDa,故而命名为P31蛋白),表达P31蛋白并进行纯化后制备兔多克隆抗体,运用ELISA方法检测抗体效价,提取MG液体培养物总蛋白、胞浆蛋白、膜蛋白,利用Western blot进行亚细胞定位。结果显示,P31蛋白具有跨膜结构和良好的B细胞抗原表位,原核表达后获取融合蛋白rP31,大小约为31 kDa,ELISA检测兔血清效价为1∶25600,Western blot分析显示,rP31蛋白分布在MG膜表面。本研究证实了P31蛋白确为MG膜蛋白且抗原性良好,可做为研发MG新型诊断方法、基因工程疫苗及治疗药物的候选蛋白。

关键词：鸡毒支原体 P31蛋白原核表达膜定位

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绵羊肺炎支原体贵州临床分离株GZ1 p109基因序列分析与原核表达

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黑龙江畜牧兽医 2024年第5期 61-65页

作者：曾庆行申艳娟冉芳菲杨鹏成虹松韦秒粘李英余潆朱二鹏程振涛贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室贵阳550025

为了探究绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)贵州临床分离株GZ1 p109基因生物信息及重组蛋白p109的免疫原性,试验采用PCR扩增Mo p109部分基因并克隆至T克隆载体pMD-19T中,经DNA测序后进行生物信息学分析;将双酶切后的p109基... 详细信息

为了探究绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)贵州临床分离株GZ1 p109基因生物信息及重组蛋白p109的免疫原性,试验采用PCR扩增Mo p109部分基因并克隆至T克隆载体pMD-19T中,经DNA测序后进行生物信息学分析;将双酶切后的p109基因片段与原核表达载体pColdⅠ连接,然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,用IPTG诱导重组蛋白表达,然后进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。结果表明:扩增得到的Mo贵州临床分离株GZ1 p109部分基因片段大小为576 bp,编码蛋白的分子量为21.33 ku,由192个氨基酸组成;p109蛋白的二级结构主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,第1~17,24~35,52~63,72~122,138~148,150~153,161~173,182~192位的氨基酸区段抗原指数相对较高;Mo贵州临床分离株GZ1与Mo 274株(登录号为CP079199)的亲缘关系很近;试验成功构建了pColdⅠ-p109原核表达重组质粒,表达的目的蛋白大小为27 ku,该重组蛋白p109能够与抗Mo阳性血清发生特异性结合。说明试验制备的重组蛋白p109具备良好的免疫原性。

关键词：绵羊肺炎支原体 p109基因原核表达免疫原性序列分析生物信息学分析

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牛支原体贵州株黏附相关蛋白的初步鉴定

畜牧兽医学报 2024年第4期55卷 1672-1683页

作者：罗小芬谢晓东赵超胡茜王永璇冉芳菲胡鹏飞文明朱二鹏程振涛贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室贵阳550025 盘州市动物疫病预防控制中心盘州553500

牛支原体(Mycoplasma bovis,***)是引起牛乳腺炎和小牛肺炎等多种牛病的重要病原体。黏附蛋白通常被认为在该生物体的致病机制中起着核心作用。因此,本研究旨在以牛支原体株贵州株(GZ-2)的4个假定蛋白为研究对象,分别命名为M27、M32、M... 详细信息

牛支原体(Mycoplasma bovis,***)是引起牛乳腺炎和小牛肺炎等多种牛病的重要病原体。黏附蛋白通常被认为在该生物体的致病机制中起着核心作用。因此,本研究旨在以牛支原体株贵州株(GZ-2)的4个假定蛋白为研究对象,分别命名为M27、M32、M498、M663;分别在大肠杆菌感受态细胞DE3(BL21)中进行原核表达及纯化、亚细胞定位及黏附性研究。结果显示:成功表达和纯化重组M27、M32、M498和M663蛋白;M27、M32和M498蛋白均在牛支原体总蛋白、胞膜蛋白与胞质蛋白中均出现特异印迹条带,而M663未被检测到;共聚焦激光扫描显微镜下的免疫染色结果显示,M27、M32、M498和M663蛋白和牛支原体都能黏附在胚胎牛肺细胞(EBL)上,兔抗M27、M32、M498和M663血清抗体能够抑制蛋白M27、M32、M498和M663对EBL细胞的黏附,也能抑制牛支原体对EBL细胞的黏附。流式细胞术分析结果与其一致,得到了进一步证实。综上所述,M27、M32和M498蛋白是牛支原体的黏附相关蛋白,而M663在Western blot中未被检测到,但它仍能黏附在EBL细胞上,并且其抗血清可抑制牛支原体对EBL细胞的黏附。这为诊断牛支原体相关疾病和开发预防性疫苗选择目标蛋白提供参考依据。

关键词：牛支原体黏附蛋白原核表达筛选

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贵州地方品种鸡ALV流行病学调查

中国动物传染病学报 2024年第4期32卷 132-138页

作者：张小波陈广温贵兰张喜懿胡璇刘蔓蔓孙芸贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点试验室贵阳550025

为了解2019—2021年贵州地方品种鸡AL病毒(Avian leukosis virus,ALV)流行情况。采用DF-1细胞对贵州9个地方品种鸡331份血浆进行ALV的分离;利用ALV p27抗原ELISA检测法对贵州地方品种鸡708份血样、180份蛋清、61份泄殖腔棉拭子进行检测... 详细信息

为了解2019—2021年贵州地方品种鸡AL病毒(Avian leukosis virus,ALV)流行情况。采用DF-1细胞对贵州9个地方品种鸡331份血浆进行ALV的分离;利用ALV p27抗原ELISA检测法对贵州地方品种鸡708份血样、180份蛋清、61份泄殖腔棉拭子进行检测。结果表明:贵州地方品种鸡331份血浆样品分离出6株ALV,总阳性率1.81%(6/331);2019—2021年采集贵州省不同品种鸡血样708份进行ALV p27抗原ELISA检测,共检测出289份阳性,总阳性率40.81%(289/708);180份蛋清中检测出39份阳性,总阳性率21.7%(39/180)。61份泄殖腔棉拭子中检测出16份阳性,总阳性率26.20%(16/61);说明贵州地方不同品种鸡存在不同程度的ALV感染,本研究为丰富贵州地区品种鸡感染ALV情况资料和贵州地方品种鸡AL的防控奠定基础。

关键词：贵州地方品种鸡禽白血病病毒流行病学调查

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鸡滑液囊支原体LP78蛋白重组腺病毒载体的构建及雏鸡免疫原性评价

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中国兽医学报 2024年第4期44卷 677-684,705页

作者：赵超宋春单春兰胡茜王永璇韩帅博肖琨文明朱二鹏程振涛贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室贵州贵阳550025 六盘水市动物疫病预防控制中心贵州六盘水553001

选取鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)LP78蛋白,将LP78基因克隆至pMD19-T载体上后,采用腺病毒Ad-Max系统将pMD-LP78重组克隆质粒连接到穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP上构建重组穿梭质粒pDCLP78,将pDC-LP78重组穿梭质粒与腺病毒大骨架pBHGlox(delta)E1、3cre共转染HEK 293A细胞包装成重组腺病毒pBH-LP78,RT-PCR及Western blot鉴定HEK 293A细胞系包装的重组腺病毒pBH-LP78。测定病毒滴度;再通过腿部肌肉免疫接种构建的重组腺病毒pBH-LP78,并用ELISA方法检测免疫鸡血清中的特异性抗体和细胞因子(IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-6)的分泌情况。PCR、双酶切鉴定和测序结果显示,成功构建了重组克隆质粒pMD-LP78和重组穿梭质粒pDC-LP78;RT-PCR及Western blot结果显示,目的基因在HEK 293A细胞中稳定表达;ELISA结果显示,血清中LP78特异性抗体和细胞因子(IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-6)的分泌量极显著升高(P<0.01),表明pBHLP78重组腺病毒能刺激鸡机体产生体液和细胞免疫应答。结果表明,成功构建了MS重组腺病毒载体疫苗pBHLP78,其可有效引起鸡机体产生体液和细胞免疫应答,为MS新型重组腺病毒载体疫苗的研发奠定了基础。

关键词：鸡滑液囊支原体 LP78蛋白重组腺病毒

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不同方法提取的山茱萸多糖品质特征

南方农业学报 2024年第07期55卷 2031-2043页

作者：石云鑫杨家潘诗琴曾诚郭荣荣李晓蝶宋旭琴杨剑宋亚贵州大学动物科学学院茅台学院食品科学与工程系贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室

【目的】研究不同提取方法对山茱萸多糖品质特征的影响，为山茱萸多糖的深加工及其开发利用提供参考依据。【方法】分别以热水提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、酸提取法、碱提取法和复合酶提取法等6种方法提取山茱萸多糖，... 详细信息

【目的】研究不同提取方法对山茱萸多糖品质特征的影响，为山茱萸多糖的深加工及其开发利用提供参考依据。【方法】分别以热水提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、酸提取法、碱提取法和复合酶提取法等6种方法提取山茱萸多糖，比较不同提取方法对山茱萸多糖的提取率、总糖含量、抗氧化能力、理化性质和结构表征的影响。【结果】不同提取方法所得的山茱萸多糖品质特征具有差异性。其中，碱提取法提取的山茱萸多糖提取率（15.13%）、总糖含量（93.43%）、铁离子还原能力（1.31 mmol/g），以及多糖中的C=O和C-H含量均高于其他方法；微波辅助提取法提取的山茱萸多糖吸油性（19.00 mL/g）和泡沫稳定性（41.67%）均高于其他方法；复合酶提取法提取的山茱萸多糖体外胆固醇吸附能力（621.80 mg/g）最强，且对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的平均清除率（60.06%）明显高于其他方法；而热水提取法提取的山茱萸多糖质量浓度为0.2 mg/mL时，其对2,2-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基清除率（61.20%）明显高于其他方法；超声辅助提取法提取的山茱萸多糖起泡性（17.00%）显著高于其他方法（P<0.05）。傅里叶变换红外光谱显示，不同方法提取的山茱萸多糖中官能团含量不同；扫描电镜分析结果显示，热水提取法和微波辅助提取法提取的山茱萸多糖表面光滑平整，结构排列紧密，超声波辅助提取法和复合酶提取法提取的山茱萸多糖分子间排斥力强；X射线衍射分析结果显示，碱提取法提取的山茱萸多糖在32o和45o时有明显且强烈的吸收峰，而热水提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、酸提取法和复合酶提取法提取到的山茱萸多糖有相似结构；热稳定分析中，碱提取法提取的山茱萸多糖热稳定性高于其他方法，在800℃时质量损失率为50.92%。【结论】不同方法提取的山茱萸多糖结构、抗氧化活性和理化性质各不相同，但不同方法对其热力学特征影响较小，呈相似的变化趋势。可根据不同方法提取的山茱萸多糖特点进行开发利用。

关键词：山茱萸多糖提取方法品质特征

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猪流行性腹泻病毒贵州流行株N基因的克隆、测序与生物信息学分析

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黑龙江畜牧兽医 2024年第7期 23-29页

作者：韦秒粘陈兰张蓉陈泽赵学武何广霞周碧君王开功单春兰朱二鹏程振涛贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室贵阳550025 兴义市威舍镇畜牧兽医站贵阳兴义562412

为了了解贵州省猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)的流行情况,试验对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)贵州流行株(GZ2022)N基因序列进行克隆、测序,并利用DNAStar、ProtParam、ProtScale等生物信息学分析软件对PEDV-GZ2022株N基因的同源性和遗传进化地位,以及N蛋白的分子特征和潜在功能进行分析预测。结果表明:PEDV-GZ2022株N基因大小约为1364 bp,编码441个氨基酸;PEDV-GZ2022株N基因核苷酸序列与GenBank中的PEDV参考毒株N基因的相似性为95.5%~99.8%,与PEDV经典毒株CV777 N基因核苷酸序列的相似性为95.6%,与SDLY2020毒株N基因核苷酸序列的相似性高达99.8%,PEDV-GZ2022毒株与经典毒株CV777关系相隔较远,与PEDV变异株GⅡ-b位于同一分支;PEDV-GZ2022株N蛋白中含有较多的疏水性氨基酸,为疏水性蛋白;该蛋白质存在4个N糖基化位点和37个O糖基化位点,有31个丝氨酸、14个苏氨酸及3个酪氨酸可能被磷酸化,并且抗原指数较好。说明PEDV-GZ2022株为GⅡ-b变异株,PEDV-GZ2022 N蛋白可能具有良好的抗原性,可以作为潜在的诊断抗原。

关键词：猪流行性腹泻病毒 N基因基因克隆生物信息学分析抗原性