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新型隐球菌临床菌株中CNAG＿01032基因的鉴定和功能研究

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菌物学报 2019年第8期38卷 1341-1349页

作者：邱文兰咏哲王迪黄劲廖万清康颖倩贵州医科大学基础医学院微生物学教研室贵州贵阳550025 贵州省微生物与人类健康关系研究人才基地暨贵州省普通高校病原生物学特色重点实验室贵州贵阳550025 贵州医科大学生物化学与分子生物学教研室贵州贵阳550025 第二军医大学上海长征医院真菌学研究所上海200003

新型隐球菌是一种具有荚膜的重要临床致病真菌。本课题组在前期工作中发现CNAG01032基因可能引起不同来源菌株的表型差异,本研究在此基础上以新型隐球菌临床来源菌株IFM56800(C1)、IFM56769(C2)为背景构建CNAG01032基因敲除突变体,并检... 详细信息

新型隐球菌是一种具有荚膜的重要临床致病真菌。本课题组在前期工作中发现CNAG01032基因可能引起不同来源菌株的表型差异,本研究在此基础上以新型隐球菌临床来源菌株IFM56800(C1)、IFM56769(C2)为背景构建CNAG01032基因敲除突变体,并检测突变株和野生型菌株经典毒力因子变化情况;使用API 20C AUX测试系统测试突变株和野生型菌株对19种糖的利用情况;使用尾静脉注射法感染BALB/c雌性小鼠进行致病性检测。结果显示:成功构建以临床株C1、C2为背景的CNAG-01032基因敲除突变株;突变株在37℃生长、黑色素产生与野生型菌株无显著差异,但荚膜厚度分别比C1、C2减少16.4%、18.2%;两基因敲除菌株均不能分解利用纤维二糖;致病性与野生型菌株无显著差异。新型隐球菌CNAG01032基因可能参与临床来源菌株IFM56800、IFM56769的荚膜合成和纤维二糖的代谢。

关键词：病原性真菌基因敲除荚膜纤维二糖

白纹伊蚊自噬基因ATG8蛋白多克隆抗体的制备及应用

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中国病原生物学杂志 2023年第7期18卷 787-792页

作者：何珊肖秋秋石梦婷李威仪彭哲慧程金芝吴家红贵州医科大学公共卫生与健康学院环境污染与疾病监控教育部重点实验室贵州贵阳550025 贵州医科大学基础医学院现代病原生物学特色重点实验室贵州医科大学基础医学院人体寄生虫学教研室安顺市人民医院检验科

目的通过原核表达系统制备白纹伊蚊(Aedes albopictus,Aa)ATG8,免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,并验证抗体的实用性。方法从白纹伊蚊Aa23细胞中提取cDNA,通过PCR扩增AaATG8基因片段,然后与载体pET30a连接,构建原核表达载体pET30a-AaATG8... 详细信息

目的通过原核表达系统制备白纹伊蚊(Aedes albopictus,Aa)ATG8,免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,并验证抗体的实用性。方法从白纹伊蚊Aa23细胞中提取cDNA,通过PCR扩增AaATG8基因片段,然后与载体pET30a连接,构建原核表达载体pET30a-AaATG8并转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞,挑取单克隆进行PCR鉴定,提取质粒进行测序鉴定。再将重组质粒转化到大肠埃希菌BL21感受态细胞,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白rAa-ATG8,纯化透析后免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体,采用ELISA检测抗体效价,并以该抗体为一抗采用Western blot检测不同物种ATG8蛋白的表达。结果成功构建原核表达载体PET30a-AaATG8并在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白。重组蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,ELISA检测其血清抗体效价为1∶640000;Western blot显示rAa-ATG8多克隆抗体可用于检测埃及伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊、三带喙库蚊、家蝇ATG8蛋白,反应条带位于18、16或14 ku处。结论成功获得高效价的rAa-ATG8多克隆抗体,该抗体不仅可用于检测白纹伊蚊ATG8蛋白,还可用于检测埃及伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊、三带喙库蚊、家蝇ATG8蛋白,为研究自噬在蚊虫以及其他物种中的作用奠定了基础。

关键词：白纹伊蚊自噬相关蛋白8/ATG8 原核表达抗体制备

人呼吸道合胞病毒感染致小鼠急性肺损伤动物模型的建立

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中国病原生物学杂志 2022年第9期17卷 993-998,1004页

作者：杨筱萌罗语思郭名扬陈芳沈胡艳牟荣沈祥春张科李金福贵州医科大学基础医学院现代病原生物学特色重点实验室人体寄生虫学教研室贵州贵阳550025 贵州医科大学附属医院急诊科贵州医科大学药学院贵州省特色天然药物资源高效利用工程中心

目的筛选人呼吸道合胞病毒高毒株并经下呼吸道感染BALB/c小鼠,建立小鼠急性肺损伤动物模型。方法将呼吸道合胞病毒野生株HRSV-A-GZ08-0在8月龄BALB/c雌鼠中进行连续传代,筛选得到高毒株R96-5。分别经下呼吸道攻毒野生株HRSV-A-GZ08-0和... 详细信息

目的筛选人呼吸道合胞病毒高毒株并经下呼吸道感染BALB/c小鼠,建立小鼠急性肺损伤动物模型。方法将呼吸道合胞病毒野生株HRSV-A-GZ08-0在8月龄BALB/c雌鼠中进行连续传代,筛选得到高毒株R96-5。分别经下呼吸道攻毒野生株HRSV-A-GZ08-0和高毒株R96-5感染BALB/c小鼠,建立急性肺损伤动物模型,通过对小鼠体重变化、存活情况、肺灌洗液病毒滴度、肺切片免疫荧光检测,以及肺组织病理损伤、炎性反应和肺气血屏障损伤等方面对模型进行评价。结果与野生株HRSV-A-GZ08-0感染组小鼠比较,同等剂量高毒株R96-5感染组小鼠存活率显著下降,攻毒后6日R96-5感染组小鼠存活率降至0,而野生株HRSV-A-GZ08-0感染组存活率为100%,且R96-5感染组肺灌洗液中病毒滴度显著升高,在感染后第2、3天病毒基因拷贝数显著升高,且肺切片免疫荧光检测同样验证此结果,hRSV F蛋白平均荧光强度明显增高。高毒株R96-5感染组小鼠炎症反应显著,TNF-α、IFN-γ和CCL-3相对表达水平均有所升高,肺气血屏障破坏明显,白蛋白浓度及肺指数均升高,肺组织病理损伤显著。结论高毒株R96-5感染小鼠具有典型的重症呼吸道病毒感染致急性肺损伤病理特征,重症呼吸道病毒感染致急性肺损伤动物模型构建成功,此模型可用于该类型感染致急性肺损伤进展为急性呼吸窘迫综合征的病理生理机制及药物干预研究。

关键词：人呼吸道合胞病毒急性肺损伤高毒株动物模型急性呼吸窘迫综合征

家蝇抗真菌肽-1A体外抗白念珠菌的细胞内作用机制

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贵州医科大学学报 2021年第12期46卷 1365-1369页

作者：邓思波黄敏慧张迎春吴建伟崔古贞陈峥宏王涛贵州医科大学基础医学院贵州贵阳550025 贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室贵州贵阳550025

目的探讨家蝇抗真菌肽-1A(MAF-1A)体外抗白念珠菌(***)的细胞内作用机制。方法取***冻存物划线接种、培养并制备浓度为2×10^(9) cfu/L的菌悬液;分别以0、625、1250及2500 mg/L的MAF-1A作用24 h,采用荧光指示剂法检测各处理细胞内活性氧... 详细信息

目的探讨家蝇抗真菌肽-1A(MAF-1A)体外抗白念珠菌(***)的细胞内作用机制。方法取***冻存物划线接种、培养并制备浓度为2×10^(9) cfu/L的菌悬液;分别以0、625、1250及2500 mg/L的MAF-1A作用24 h,采用荧光指示剂法检测各处理细胞内活性氧(ROS)含量的变化;取0、781及1560 mg/L抗氧化剂维生素C(V_(c))和还原型谷胱甘肽(GSH))预处理***细胞30 min,采用微量稀释法检测MAF-1A抗***的最小抑菌浓度(MIC);采用荧光指示剂法检测0、625、1250及2500 mg/L的MAF-1A作用24 h后***细胞线粒体膜电位的变化;取***脱氧核糖核酸(DNA)与等体积不同浓度(0、625、1250及2500 mg/L)MAF-1A共孵育6 h,采用琼脂糖凝胶阻滞实验分析MAF-1A对*** DNA的影响。结果与0 mg/L MAF-1A相比,不同浓度MAF-1A处理***细胞内ROS量明显增加(P0.05);凝胶阻滞实验结果显示,不同浓度MAF-1A与*** DNA孵育后,DNA条带出现滞后及变暗淡现象,且在加样孔有滞留,这种阻滞现象随着MAF-1A浓度升高越明显。结论MAF-1A不仅能诱导***细胞内大量产生ROS,还能通过与DNA的结合而发挥对***的抑制作用。

关键词：抗菌肽类念珠菌,白色抗氧化剂膜电位,线粒体家蝇抗真菌肽-1A 活性氧 DNA凝胶阻滞作用机制

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贵州省蜱种调查及遗传进化分析

黑龙江畜牧兽医 2024年第11期 72-77页

作者：李容庭李威仪刘志豪唐小敏吴家红贵州医科大学公共卫生与健康学院环境污染与疾病监控教育部重点实验室贵州贵安550025 贵州医科大学基础医学院现代病原生物学特色重点实验室贵州贵安550025 贵州医科大学基础医学院寄生虫学教研室贵州贵安550025

为了调查贵州省蜱虫的物种多样性及分布特征,阐明不同地理株蜱虫间的遗传进化关系,试验采用动物体表采集法与布旗法采集寄生蜱及游离蜱;使用超景深显微镜对蜱虫进行形态学鉴定。选取不同地域、种类及不能准确识别的蜱虫提取组织DNA,采用... 详细信息

为了调查贵州省蜱虫的物种多样性及分布特征,阐明不同地理株蜱虫间的遗传进化关系,试验采用动物体表采集法与布旗法采集寄生蜱及游离蜱;使用超景深显微镜对蜱虫进行形态学鉴定。选取不同地域、种类及不能准确识别的蜱虫提取组织DNA,采用PCR法扩增蜱虫16S rDNA和COI基因片段并测序,通过BioEdit 7.0软件进行多序列比对确认蜱虫物种;使用MEGA 11.0软件对序列信息进行分析,构建基于16S rDNA和COI基因的系统进化树,对不同地理株蜱虫进行遗传进化分析。结果表明:在贵州省8个市州23个区县共采集到蜱虫2 420只,其中牛寄生蜱2 193只,羊寄生蜱92只,犬寄生蜱36只,游离蜱99只。形态学和分子生物学方法共鉴定出2种蜱虫,其中微小扇头蜱1 560只,长角血蜱860只。在系统发育进化中,微小扇头蜱、长角血蜱的16S rDNA和COI基因都分别与对应的参考基因序列聚集成一簇,贵州省大部分微小扇头蜱序列总体上聚于一个分支,只有黔东南州QDNZ1株在两个进化树中都形成了独立分支;多数长角血蜱序列也聚于同一分支,仅基于COI基因构建的系统进化树中毕节市BJS1株与其他省地理株聚在另一分支。说明贵州省家畜常见蜱种为微小扇头蜱和长角血蜱;在贵州省黔东南州存在一株微小扇头蜱特有株系,且在毕节市的长角血蜱存在省外输入的情况,这可能会增加蜱媒疾病在贵州省传播的风险。

关键词：蜱线粒体16S rDNA基因细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因分子鉴定系统发育分析

SARS-CoV-2 ORF7a通过靶向IKKβ激活NF-κB信号通路促进细胞炎症因子释放

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中国免疫学杂志 2024年第4期40卷 714-719页

作者：牟露敏龙启舟邓东青程金芝聂映吴家红贵州医科大学公共卫生与健康学院环境污染监测与疾病控制重点实验室贵阳550025 贵州中医药大学第一附属医院贵阳550002 贵州医科大学基础医学院现代病原生物学特色重点实验室贵阳550025

目的:探究SARS-CoV-2辅助蛋白ORF7a介导NF-κB激活,进而诱导炎症因子产生的分子机制。方法:双荧光素酶报告基因试验检测ORF7a对NF-κB激活的影响,qRT-PCR检测ORF7a对细胞中炎症因子表达的影响,Western blot、核质分离及免疫荧光技术检测... 详细信息

目的:探究SARS-CoV-2辅助蛋白ORF7a介导NF-κB激活,进而诱导炎症因子产生的分子机制。方法:双荧光素酶报告基因试验检测ORF7a对NF-κB激活的影响,qRT-PCR检测ORF7a对细胞中炎症因子表达的影响,Western blot、核质分离及免疫荧光技术检测ORF7a蛋白对p65磷酸化及入核的影响,免疫共沉淀及免疫荧光技术检测ORF7a的作用靶标蛋白。结果:报告基因试验表明ORF7a显著激活NF-κB启动子活性,并呈剂量依赖性(P实验发现ORF7a与NF-κB信号通路分子IKKβ蛋白存在相互作用,免疫荧光实验也证实ORF7a与IKKβ具有共定位。结论:SARS-CoV-2 ORF7a通过靶向IKKβ激活NF-κB信号通路,进而促进细胞中炎症因子的释放。

关键词： SARS-CoV-2 ORF7a NF-κB信号通路炎症因子

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朱砂根抗肿瘤作用研究进展

中国比较医学杂志 2024年第1期34卷 165-170页

作者：任群利罗倩刘华倩吴发明何芋岐刘建国王倩遵义医科大学口腔医学院贵州省普通高等学校微生物资源及药物开发特色重点实验室贵州遵义563000 遵义医科大学基础医学院贵州遵义563000 遵义医科大学药学院贵州遵义563000

朱砂根是中国传统中药,属于紫金牛科植物,其主要成分为香豆素类、皂苷类、黄酮类和挥发油等。随着对朱砂根抗肿瘤作用的深入研究,其活性抗癌化合物有岩白菜素、朱砂根皂苷A、B、百两金皂苷A、B和蒽贝素,主要通过诱导肿瘤细胞凋亡、增加... 详细信息

朱砂根是中国传统中药,属于紫金牛科植物,其主要成分为香豆素类、皂苷类、黄酮类和挥发油等。随着对朱砂根抗肿瘤作用的深入研究,其活性抗癌化合物有岩白菜素、朱砂根皂苷A、B、百两金皂苷A、B和蒽贝素,主要通过诱导肿瘤细胞凋亡、增加肿瘤细胞毒性抑制细胞增殖、抑制肿瘤细胞转移和迁徙等多种途径在口腔癌、鼻咽癌、肝癌、结肠癌、膀胱癌、宫颈癌和白血病等肿瘤中显示出很高的抗肿瘤潜力。然而,朱砂根的抗肿瘤机制临床前实验数据缺乏高质量、多样本、多重复的随机对照试验,临床研究数据缺乏肿瘤预后及药效学和药代动力学相关试验数据,应设计精准研究实验和临床试验进一步探索挖掘朱砂根的药理作用。

关键词：朱砂根岩白菜素肿瘤抗癌化合物

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胃内尿素酶阳性细菌对幽门螺杆菌感染诊断的影响

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中国病原生物学杂志 2018年第2期13卷 127-130页

作者：郭长城熊妍吴芳草潘科张永宏刘芳崔古贞朱莉王琼印琳陈峥宏贵州医科大学基础医学院微生物学教研室贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室贵州贵阳550025 贵阳市儿童医院消化内科贵州省黔南布依族苗族自治州医院消化内科贵州医科大学附属医院消化内科

目的探讨胃内可分解尿素酶菌群对基于尿素酶阳性诊断幽门螺杆菌(***,Hp)感染的影响。方法胃镜下取疑为Hp感染患者的胃黏膜,行快速尿素酶检测(Rapid urease test,RUT)及细菌培养,根据培养物的菌落形态、革兰染色、RUT及Hp特异性16SrRNA... 详细信息

目的探讨胃内可分解尿素酶菌群对基于尿素酶阳性诊断幽门螺杆菌(***,Hp)感染的影响。方法胃镜下取疑为Hp感染患者的胃黏膜,行快速尿素酶检测(Rapid urease test,RUT)及细菌培养,根据培养物的菌落形态、革兰染色、RUT及Hp特异性16SrRNA基因片段PCR进行Hp的鉴定;提取胃黏膜组织DNA,通过Hp特异性PCR进行Hp感染快速诊断。对Hp阴性(Hp培养或特异性PCR阴性)而RUT阳性胃黏膜培养的非Hp(nonHp)进行常规尿素酶生化试验,选取20株尿素酶阳性non-Hp利用细菌16SrRNA通用引物进行PCR扩增并测序,利用NCBI系统进行序列比对,鉴定细菌种类。结果 606例患者胃黏膜RUT阳性率为58.4%(354/606),Hp培养阳性率29.7%(180/606)。Hp培养阴性胃黏膜特异性PCR阳性113例,Hp感染率为48.35%(293/606)。胃黏膜RUT阳性率高于胃黏膜Hp感染(χ2=1,2.337,P实验诊断。

关键词：幽门螺杆菌非幽门螺杆菌快速尿素酶试验胃内菌群

人呼吸道合胞病毒qRT-PCR绝对定量检测法的建立

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中国病原生物学杂志 2020年第9期15卷 1033-1037页

作者：刘春源杨筱萌罗语思何淼张勇刘鉴牟荣沈祥春李金福张科贵州医科大学基础医学院现代病原生物学特色重点实验室寄生虫学教研室贵州贵阳550025 贵州医科大学附属医院急诊科贵州贵阳550004 贵州医科大学贵州贵阳550025 贵州医科大学药学院贵州省特色天然药物资源高效利用工程中心贵州贵阳550025

目的建立检测人呼吸道合胞病毒(human Respiratory Syncytial Virus, hRSV)实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)绝对定量检测法。方法提取人呼吸道合胞病毒mRNA并逆转录为cDNA,以cDNA为模板,用hRSV的N基因作为目的基因设计的引物进行PCR扩增,扩增产物连接到pMDTM 18-T载体,构建标准检测质粒。以构建的标准检测质粒进行qRT-PCR,建立绝对定量检测的标准曲线。结果 PCR扩增获得714 bp产物,与pMDTM 18-T载体连接构建的标准检测质粒测序验证成功。qRT-PCR检测目的基因扩增效率E为105.2%,R^2=0.998,在1.0×10^2~1.0×10^8拷贝范围内具良好线性关系,最低检测限为100拷贝/反应。结论成功建立了hRSV qRT-PCR绝对定量检测法,该方法快速、特异、灵敏,为hRSV诊断试剂盒的研制奠定了基础。

关键词：人呼吸道合胞病毒实时荧光定量PCR N基因绝对定量检测法