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基于RNA干扰的家蝇几丁质酶2的幼虫转录组测序

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应用与环境生物学报 2021年第1期27卷 177-184页

作者：苏佩佩国果赵欣宇杨隆兵朱丽娟田竺青朱贵明尚小丽贵州医科大学基础医学院现代病原生物学重点特色实验室贵阳550025 贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室贵阳550025 贵州医科大学食品科学学院贵阳550025

几丁质酶是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类,在昆虫整个生长发育过程中发挥着重要作用.为筛选及挖掘与防治有害医学昆虫相关的分子靶标,根据家蝇几丁质酶2(Musca domestica chitinase 2,MdCht2)基因序列设计并合成双链RNA(double-strand... 详细信息

几丁质酶是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类,在昆虫整个生长发育过程中发挥着重要作用.为筛选及挖掘与防治有害医学昆虫相关的分子靶标,根据家蝇几丁质酶2(Musca domestica chitinase 2,MdCht2)基因序列设计并合成双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA),采用微量注射法向家蝇2龄幼虫导入dsRNA,对对照组及干扰组的样本进行转录组测序,筛选差异表达基因,进行GO(gene ontology)功能注释和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析.结果显示,注射dsRNA 24 h后,幼虫MdCht2 mRNA的表达显著下降,提示导入的dsRNA干扰了MdCht2的表达.经转录组测序,与对照组相比,显著差异基因共213条,其中78条基因为上调表达,135条基因为下调表达.随机选取8条显著差异基因通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行验证,该结果与转录组结果趋势一致.根据功能注释发现这些差异基因与生长发育、脂类代谢、免疫调控等途径相关.本研究通过RNA干扰和转录组测序技术处理家蝇获得大量差异基因,结果可为后续几丁质酶相关基因的挖掘和鉴定及功能研究提供一定的数据基础.(图7表4参46)

关键词：家蝇 MdCht2 RNA干扰转录组测序

RNA干扰MDCht9基因的家蝇幼虫的转录组分析

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基因组学与应用生物学 2021年第2期40卷 569-577页

作者：李妍国果苏佩佩赵欣宇杨隆兵赵文静修江帆贵州医科大学基础医学院现代病原生物学重点特色实验室贵阳550025 贵州医科大学食品科学学院贵阳550025

家蝇(Musca domestica)属于双翅目昆虫,广泛分布于世界各地,目前家蝇抗药现象较为严重。为了筛选及挖掘与防治有害医学昆虫相关的分子靶标,本研究以家蝇幼虫为实验对象,采用RNAi方法沉默家蝇几丁质酶MDCht9基因后,分析幼虫mRNA转录组表... 详细信息

家蝇(Musca domestica)属于双翅目昆虫,广泛分布于世界各地,目前家蝇抗药现象较为严重。为了筛选及挖掘与防治有害医学昆虫相关的分子靶标,本研究以家蝇幼虫为实验对象,采用RNAi方法沉默家蝇几丁质酶MDCht9基因后,分析幼虫mRNA转录组表达变化,初步探讨MDCht9的功能。研究结果表明,在注射dsRNA 24 h后,幼虫MDCht9 mRNA的表达显著下降85%,提示干扰有一定效果。实验组与对照组相比共筛选出378个基因差异表达显著,其中上调基因162个,下调基因216个,占所有被检测到转录RNA基因的百分比为2.66%。通过GO和KEGG相关生物信息学分析,挖掘出涉及幼虫时期生长发育、蛋白质的消化与吸收、雄虫性成熟、物质代谢等相关通路基因。采用实时荧光定量PCR对差异基因进行验证,与转录组结果一致。本实验通过RNAi方法成功降低MDCht9基因mRNA表达,MDCht9基因参与幼虫时期生长发育、蛋白质的消化与吸收、雄虫性成熟、物质代谢等功能。本研究结果有助于后续生物信息学分析及为家蝇生长发育关键基因的挖掘提供基础数据,为害虫防治提供新的靶标途径。

关键词： MDCht9 RNA干扰转录组

家蝇几丁质酶MDCht2基因的序列分析、克隆与表达模式分析

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中国病原生物学杂志 2019年第6期14卷 679-685页

作者：苏佩佩赵欣宇李妍马慧玲杨隆兵刘鉴付萍国果贵州医科大学基础医学院现代病原生物学特色重点实验室贵州贵阳550025 贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室

目的从家蝇的基因组库中筛选几丁质酶2(MDCht2)基因,进行cDNA克隆及分子特性分析,对其时空表达模式进行初步探索。方法从家蝇基因组数据库中筛选MDCht2基因,以该基因的cDNA为模板进行PCR扩增,采用生物信息学相关软件对MDCht2基因及其编... 详细信息

目的从家蝇的基因组库中筛选几丁质酶2(MDCht2)基因,进行cDNA克隆及分子特性分析,对其时空表达模式进行初步探索。方法从家蝇基因组数据库中筛选MDCht2基因,以该基因的cDNA为模板进行PCR扩增,采用生物信息学相关软件对MDCht2基因及其编码蛋白质的基本理化性质、信号肽、蛋白质结构等进行分析,预测蛋白质功能。取家蝇不同生活史时期(卵,1龄幼虫,2龄幼虫,3龄幼虫,蛹,雌雄成虫)及3龄幼虫不同组织(体壁,气管,马氏管,唾液腺,脂肪体,肠道)标本,采用实时荧光定量PCR检测MDCht2基因表达情况。结果 MDCht2基因cDNA全长1 932 bp,ORF框全长1 530 bp,编码509个氨基酸,理论相对分子质量为57.8×10^3,pI 5.67,属于亲水性的酸性蛋白,有信号肽,功能结构域位于第37~385位氨基酸间,无几丁质结合域。二级结构分析显示存在无规则卷曲(Cc),α螺旋(Hh),β折叠(Ee)3种类型。PCR扩增得到MDCht2基因长为1 530 bp的序列片段。实时荧光定量PCR检测家蝇MDCht2基因在蛹期的表达量较卵期上调6.477 01倍(P3龄幼虫>1龄幼虫>2龄幼虫>卵>雄成虫>雌成虫。以体壁为参照,MDCht2基因在家蝇气管中的表达量较高,气管中的表达量较体壁上调1.816 51倍(P体壁>唾液腺>脂肪体>肠道>马氏管。结论成功克隆了家蝇的MDCht2基因并初步探索了其时空表达模式,即MDCht2基因在蛹期及气管组织高表达,为MDCht2的功能研究奠定了基础。

关键词：家蝇几丁质酶2 基因克隆生物信息学分析时空表达

白纹伊蚊唾液源34ku-1基因的克隆表达及鉴定

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中国病原生物学杂志 2022年第3期17卷 308-313页

作者：陈素素吴家红程金芝赵久刚商正玲聂映牟荣贵州医科大学基础医学院人体寄生虫学教研室贵州贵阳550025 贵州医科大学现代病原生物学特色重点实验室贵州医科大学基础医学院免疫学教研室

目的克隆表达白纹伊蚊唾液腺34ku-1蛋白(Aalb_34 ku-1),并制备鼠抗34ku-1多克隆抗体,用于蚊唾液34ku-1蛋白的检测。方法根据白纹伊蚊罗马株(GenBank:AY826117.1)34ku去除信号肽后的基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术从白纹伊蚊安... 详细信息

目的克隆表达白纹伊蚊唾液腺34ku-1蛋白(Aalb_34 ku-1),并制备鼠抗34ku-1多克隆抗体,用于蚊唾液34ku-1蛋白的检测。方法根据白纹伊蚊罗马株(GenBank:AY826117.1)34ku去除信号肽后的基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术从白纹伊蚊安顺株雌蚊体内扩增获得34ku-1基因。利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)、瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASy)等对该蛋白进行生物信息学分析。将该基因构建到原核表达质粒pET-32a(+)中,转染大肠埃希菌BL21(DE3)后经异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析表达结果。镍柱纯化34ku-1重组蛋白,采用Western blot验证纯化蛋白的免疫反应性。用纯化的34ku-1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫血清,采用间接ELISA法检测血清抗体效价,采用Western blot方法对抗体的特异性进行鉴定。收集雌蚊唾液,采用Western blot方法用制备的多克隆抗体检测蚊唾液34ku-1蛋白。结果成功克隆获得34ku-1基因,生物信息学分析该基因全长888 bp,编码295个氨基酸。编码蛋白的理论分子质量单位为33.6 ku,等电点为5.54。重组质粒pET-32a(+)-34ku-1经PCR、双酶切及测序验证构建正确。经IPTG诱导的BL21重组菌表达产物主要以包涵体形式存在。经亲和层析法获得高纯度的34ku-1重组蛋白,浓度为0.71 mg/mL。Western blot显示重组蛋白可被抗6-His tag抗体识别,制备的鼠抗34ku-1血清抗体效价为1∶625000,且特异性良好,用34ku-1多克隆抗体Western blot可检测到蚊虫唾液中的34ku-1蛋白。结论成功克隆并表达了白纹伊蚊34ku-1原核蛋白,制备了高效价、高特异性的鼠抗34ku-1多克隆抗体,应用该抗体可检测到雌蚊唾液中的34ku-1蛋白。

关键词：白纹伊蚊唾液腺 34ku-1重组蛋白原核表达多克隆抗体

基于网络药理学和动物体内试验验证云实感冒合剂对呼吸道合胞病毒作用

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中华微生物学和免疫学杂志 2024年第2期44卷 170-182页

作者：徐庆胜李玉迁蒋立娜魏洪迟茜文廖思睿陈维娇贵州医科大学基础医学院国家级实验教学中心微生物学教研室贵州省普通高校学校病原生物学特色重点实验室贵阳550025 贵州医科大学基础医学院微生物学教研室贵州省普通高校学校病原生物学特色重点实验室贵阳550025 贵州医科大学基础医学院国家级实验教学中心贵阳550025

目的基于网络药理学和体内试验探讨云实感冒合剂抗呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的作用机制。方法网络药理学预测:运用TCMSP、GeneCards等数据库预测云实感冒合剂干预RSV的活性成分及作用靶点。利用Cytoscape 3.2.1... 详细信息

目的基于网络药理学和体内试验探讨云实感冒合剂抗呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的作用机制。方法网络药理学预测:运用TCMSP、GeneCards等数据库预测云实感冒合剂干预RSV的活性成分及作用靶点。利用Cytoscape 3.2.1软件构建中药成分-疾病靶点网络图。通过STRING数据库分析蛋白质相互作用关系。借助Metascape数据库进行富集分析。采用分子对接技术分析验证网络药理学结果。云实感冒合剂干预RSV感染验证试验:滴鼻法建立RSV小鼠模型,灌胃合剂后检测血常规、肺指数,观察肺组织病理变化,流式细胞术检测外周血T细胞亚群,ELISA检测血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量,RT-PCR检测肺组织中TLR4、NF-κB和RSV-N基因mRNA相对水平。结果分析获得云实感冒合剂有效活性成分41个,抗RSV靶点111个,富集得到167条信号通路,主要是PI3K/AKT、MAPK、Toll-like等信号通路。分子对接结果显示,云实感冒合剂活性成分木犀草素、山奈酚、槲皮素与RSV-G、RSV-F、PI3K、AKT1、Bcl-2结合能均小于0 kcal/mol。体内试验结果显示,与RSV组相比,云实感冒合剂高剂量组白细胞、淋巴细胞计数升高、肺指数降低,差异有统计学意义(P学意义(P<0.05)。结论云实感冒合剂通过多成分、多靶点、多通路发挥调控RSV感染,主要通过缓解肺组织病理损伤,减轻炎症反应,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB通路激活有关。

关键词：云实感冒合剂网络药理学呼吸道合胞病毒体内试验分子对接

MAPK通路主要激酶抑制剂对亚洲带绦虫感染乳猪肝细胞生长抑制率和凋亡率的影响

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中国人兽共患病学报 2019年第9期35卷 797-804页

作者：门万琪杨汉蕾张科杨林许士刚牟荣贵州医科大学基础医学院人体寄生虫学教研室贵阳550025 贵州医科大学现代病原生物学特色重点实验室贵阳550025

目的了解MAPK特异性抑制剂干预后亚洲带绦虫感染乳猪肝细胞MAPK信号通路相关基因表达、细胞活力和细胞凋亡的变化。方法采集亚洲带绦虫成虫标本并收集虫卵制作悬液。将乳猪随机分为感染组、三种抑制剂干预组和正常对照组,感染组和抑制... 详细信息

目的了解MAPK特异性抑制剂干预后亚洲带绦虫感染乳猪肝细胞MAPK信号通路相关基因表达、细胞活力和细胞凋亡的变化。方法采集亚洲带绦虫成虫标本并收集虫卵制作悬液。将乳猪随机分为感染组、三种抑制剂干预组和正常对照组,感染组和抑制剂干预组均以定量虫卵15万个/头灌胃感染,灌胃后将抑制剂干预组乳猪分别腹腔注射U0126、SB203580和SP600125 1 mg/kg,隔天1次,连续7次。感染后第15 d麻醉处死各组乳猪获取肝脏。采用cck-8法和流式细胞仪分别检测肝细胞生长抑制率和肝细胞凋亡率,并用RT-PCR技术检测肝细胞ERK1、p38和JNK1基因mRNA的相对表达量。结果感染组和U0126、SB203580、SP600125干预组肝细胞生长抑制率分别为(23.1±1.26)%、(12.59±1.2)%、(16.48±0.7)%、(18.3±0.75)%,U0126组与感染组相比(t=9.223,P0.05)无显著性差异。与感染组相比,U0126干预组(t=3.462,P<0.05)ERK1 mRNA表达量下调;SB203580干预组(t=3.267,P<0.05)p38 mRNA表达量下调;SP600125干预组(t=3.363,P<0.001)JNK1 mRNA的表达量下调。结论亚洲带绦虫感染乳猪后,MAPK特异性抑制剂可以通过影响乳猪肝细胞MAPK相关基因的mRNA水平减轻肝细胞的生长抑制和凋亡。

关键词：亚洲带绦虫乳猪肝脏丝裂原活化蛋白激酶 MAPK抑制剂

微小膜壳绦虫感染对ICR小鼠小肠LY6A(Sca-1)及IFN-γ、STAT1表达的影响

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中国人兽共患病学报 2021年第7期37卷 611-617页

作者：赵敬杨汉蕾陈素素牟荣贵州医科大学基础医学院人体寄生虫学教研室贵阳550025 贵州医科大学现代病原生物学特色重点实验室贵阳550025

目的探讨微小膜壳绦虫感染ICR小鼠小肠组织中LY6A及IFN-γ、STAT1的表达情况。方法采集微小膜壳绦虫成虫标本并收集虫卵制作悬液。将ICR小鼠随机分为对照组和实验组,实验组以定量1 000个/只虫卵灌胃感染,于感染后第2 d和第8 d按照编号... 详细信息

目的探讨微小膜壳绦虫感染ICR小鼠小肠组织中LY6A及IFN-γ、STAT1的表达情况。方法采集微小膜壳绦虫成虫标本并收集虫卵制作悬液。将ICR小鼠随机分为对照组和实验组,实验组以定量1 000个/只虫卵灌胃感染,于感染后第2 d和第8 d按照编号处死小鼠获取小肠组织。采用HE染色进行小肠组织病理学观察,RT-PCR技术检测LY6A、IFN-γ和STAT1的mRNA相对表达量,免疫组织化学技术检测小肠中LY6A蛋白阳性细胞的表达,并用PRM技术对LY6A蛋白和STAT1蛋白进行相对丰度定量。结果 HE染色结果显示感染后第8 d在肠腔内发现成虫节片,并且虫体寄生处出现急性炎症反应。RT-PCR检测显示感染第2 d实验组LY6A(t=12.57,P实验组LY6A(t=10.01,P实验组LY6A阳性细胞百分比高于对照组(t=4.26,P实验组LY6A蛋白阳性细胞百分比高于对照组(t=8.18,P实验组LY6A蛋白相对表达量低于对照组(t=6.55,P实验组STAT1蛋白与对照组相比无统计学差异,感染后第8 d实验组LY6A蛋白(t=4.95,P<0.05)和STAT1(t=2.91,P<0.05)蛋白的相对表达量均高于对照组。结论微小膜壳绦虫感染ICR小鼠小肠后LY6A(Sca-1)的mRNA水平和蛋白水平在幼虫侵入早期呈低表达,成虫期呈高表达;IFN-γ对LY6A的表达不起主导作用,而STAT1可能对LY6A(Sca-1)的表达起诱导作用。

关键词：微小膜壳绦虫 LY6A/Sca-1 ICR小鼠 IFN-γ STAT1

贵州白纹伊蚊感染沃尔巴克氏体以及WO噬菌体的初步调查

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中国病原生物学杂志 2020年第1期15卷 69-73,77页

作者：王政艳梁秋果杨茜陈玲玲张霞胡容程金芝吴家红贵州医科大学基础医学院现代病原生物学特色重点实验室贵州贵阳550025 贵州医科大学基础医学院寄生虫学教研室黔南民族医学高等专科学校基础医学部病原生物学教研室贵州医科大学公共与卫生学院

目的了解贵州白纹伊蚊种群中沃尔巴克氏体(Wolbachia)以及WO噬菌体的感染情况。方法于2017年在贵州省贵阳市、都匀市、铜仁市、凯里市、遵义市、兴义市、贵安新区、毕节市采用勺舀法采集白纹伊蚊幼虫标本,实验室饲养至成蚊。提取雌蚊基... 详细信息

目的了解贵州白纹伊蚊种群中沃尔巴克氏体(Wolbachia)以及WO噬菌体的感染情况。方法于2017年在贵州省贵阳市、都匀市、铜仁市、凯里市、遵义市、兴义市、贵安新区、毕节市采用勺舀法采集白纹伊蚊幼虫标本,实验室饲养至成蚊。提取雌蚊基因组DNA,PCR扩增沃尔巴克氏体表面蛋白基因(Wolbachia surface protein,wsp)和WO噬菌体衣壳蛋白的核糖体S7基因(Ribosomal S7 gene,orf7)。分别从8个地区的阳性检测标本中随机选取10个样品进行测序,使用DNAStar 7.0软件分析基因的基本特征;采用MEGA 4.0软件对所获基因序列进行分析比对,并构建系统进化树;采用SPSS 20.0软件对WO噬菌体侵染wAlbA、wAlbB株沃尔巴克氏体的检测结果进行关联性分析。结果贵州省8个地区的白纹伊蚊wAlbA和wAlbB株沃尔巴克氏体超感染率为84.30%(322/382),wAlbA株、wAlbB株沃尔巴克氏体单感染率分别为4.97%(19/382)和3.66%(14/382),WO噬菌体的感染率为76.44%(292/382)。通过测序获得沃尔巴克氏体的wsp序列,其中wAlbA株(379 bp)80条,wAlbB株(501 bp)78条;获得WO噬菌体的orf7序列(263 bp)73条。比对分析显示贵州省8个地区获得所有wAlbA株、wAlbB株的wsp序列、orf7序列的同源性均为100%。确切概率法分析WO噬菌体侵染与wAlbA和wAlbB株沃尔巴克氏体超感染有关联性(P贵州白纹伊蚊种群普遍感染WO噬菌体和沃尔巴克氏体,且以超感染wAlbA和wAlbB株沃尔巴克氏体为主。WO噬菌体主要侵染的对象是超感染wAlbA和wAlbB株的沃尔巴克氏体。

关键词：白纹伊蚊沃尔巴克氏体 WO噬菌体

白纹伊蚊rAlb-34k2蛋白对C6/36细胞内的DENV2早期抑制作用

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中国病原生物学杂志 2021年第2期16卷 167-170,176页

作者：朱亚妮金芮代薇露李莹陈玲玲赵久刚吴家红商正玲贵州医科大学基础医学院免疫学教研室贵州贵阳550025 贵州医科大学基础医学院寄生虫学教研室贵州医科大学现代病原生物学特色重点实验室

目的探讨白纹伊蚊唾液rAlb-34k2蛋白在DENV2感染C6/36细胞中的作用。方法采用RT-qPCR检测不同浓度rAlb-34k2蛋白作用6 h、60 h后C6/36细胞内DENV2 NS1核酸的变化;采用Dot-ELISA检测rAlb-34k2蛋白与DENV2颗粒结合情况;采用ELISA及Western blot分别检测rAlb-34k2蛋白与C6/36细胞膜蛋白结合的差异。结果rAlb-34k2蛋白作用6 h后,C6/36细胞内DENV2 NS1 RNA的相对表达被抑制,其中10、25、100μg/ml浓度组NS1 RNA的相对表达(2^(-ΔΔCT))值分别为(0.6778±0.04827)、(0.5972±0.06369)和(0.4704±0.05297),差异有统计学意义(P学意义。Dot-ELISA检测rAlb-34k2蛋白(71、118.3、177.5μg/ml)可与DENV2病毒颗粒结合。间接ELISA检测rAlb-34k2蛋白与C6/36细胞疏水性膜蛋白和亲水性膜蛋白结合的A值分别为(1.1±0.26)和(3.1±0.047),差异有统计学意义(P=0.0016),Western blot检测亲水性膜蛋白的阳性结合条带数显著多于疏水性膜蛋白。结论白纹伊蚊雌蚊唾液特异性rAlb-34k2蛋白体外能与DENV2病毒颗粒及C6/36细胞膜蛋白结合,并抑制DENV2病毒早期在C6/36细胞中增殖。

关键词：白纹伊蚊 rAlb-34k2蛋白 DENV2 亲水性膜蛋白