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水疱性口炎病毒对小鼠乳腺癌4T1细胞荷瘤小鼠抗肿瘤免疫、移植瘤生长与肺转移的影响

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中国肿瘤生物治疗杂志 2024年第5期31卷 452-461页

作者：李玉迁徐庆胜魏洪王皞王硕石蒋立娜袁心怡贵州医科大学基础医学院微生物学教研室贵州贵阳550025 贵州医科大学基础医学国家级实验教学中心贵州贵阳550025 贵州医科大学临床医学院贵州贵阳550025 贵州省人民医院急诊外科贵州贵阳550005 贵州中医药大学第二附属医院红岩院区中心实验室贵州贵阳550003

目的:探究野生型水疱性口炎病毒印第安纳株(VSV-IN)对小鼠三阴性乳腺癌4T1细胞移植模型小鼠的免疫调节及肿瘤转移的影响。方法:VSV以MOI=1、MOI=10、MOI=100感染4T1细胞12、24、48 h后,CCK-8法检测4T1细胞死亡率,划痕愈合实验检测细胞... 详细信息

目的:探究野生型水疱性口炎病毒印第安纳株(VSV-IN)对小鼠三阴性乳腺癌4T1细胞移植模型小鼠的免疫调节及肿瘤转移的影响。方法:VSV以MOI=1、MOI=10、MOI=100感染4T1细胞12、24、48 h后,CCK-8法检测4T1细胞死亡率,划痕愈合实验检测细胞迁移能力,qPCR检测细胞中E-cadherin、MMP-2、MMP-9 mRNA的表达。于雌性BALB/c小鼠脂肪垫接种1×10^(6)个/mL的4T1细胞0.1 mL,构建4T1细胞荷瘤小鼠模型,待小鼠肿瘤体积达200 mm3,分别向移植瘤内注射PBS、紫杉醇(TAX)(15 mg/kg)、VSV-IN(1×10^(6)pfu/只),每周1次。给药4次后,处死小鼠、剥离完整移植瘤组织,测量肿瘤体积及质量,肺组织病理切片经H-E染色后观察肿瘤肺部转移结节,流式细胞术检测脾组织中T细胞亚群比例,ELISA法检测小鼠血清IL-6及TNF-α水平,利用GEPIA在线分析乳腺肿中迁移相关蛋白mRNA的表达,免疫组化法检测肿瘤中MMP-2、MMP-9与E-cadherin的表达,利用蛋白-蛋白对接技术预测VSV-IN的G蛋白、M蛋白与ERK2、E-cadherin的亲和力。结果:经MOI=10、100的VSV-IN处理48 h后,4T1细胞死亡率显著高于对照组(均P<0.01);与对照组相比,VSV-IN组(MOI=10)细胞迁移率明显降低(P<0.01),MMP-9 mRNA的相对表达量明显降低(P<0.05);与对照组小鼠相比,VSV-IN组移植瘤生长较对照组减缓且终点体积显著减小(P<0.05),VSV-IN组小鼠肺转移结节数量显著减少[(12.86±1.86)vs(24±3.67)个,P<0.01],脾内CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞比例显著升高(均P<0.05),血清TNF-α、IL-6含量显著升高(均P<0.01);GEPIA分析发现在乳腺癌中E-cadherin、MMP-9表达水平均高于癌旁组织(P<0.05);VSV-IN组小鼠肿瘤细胞内MMP-9表达明显低于对照组(P<0.05);VSV-IN的G、M蛋白与ERK2的结合自由能分别为–11.7 kcal/mol、–6.4 kcal/mol。结论:野生型VSV-IN可抑制4T1细胞荷瘤小鼠的移植瘤生长及转移,这可能与其促进抗肿瘤免疫及调控迁移相关蛋白表达有关。

关键词：野生型水疱性口炎病毒三阴性乳腺癌 4T1细胞迁移蛋白-蛋白对接

数据挖掘干预酒精性肝炎的潜在中药与实验验证

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中国实验方剂学杂志 2024年

作者：陈书灵刘逸韬吴骁张朵艾金慧袁桃花孙见飞贵州医科大学基础医学国家级实验教学示范中心

目的：通过数据分析和实验验证探究人参总皂苷改善酒精性肝炎(AH)的新靶点和中药，为AH的临床治疗提供新方向。方法：该研究前期从GEO数据库筛选GSE28619作为分析对象，选择GSE83148和GSE103580作为验证集。基于limma包和WGCNA方法识别A... 详细信息

目的：通过数据分析和实验验证探究人参总皂苷改善酒精性肝炎(AH)的新靶点和中药，为AH的临床治疗提供新方向。方法：该研究前期从GEO数据库筛选GSE28619作为分析对象，选择GSE83148和GSE103580作为验证集。基于limma包和WGCNA方法识别AH相关差异基因和模块基因；通过“Venny”软件取交集基因。构建蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction network， PPI network)，并进行富集分析，再进一步筛选核心基因评估其诊断价值。经过数据集验证后，综合分析出AH新潜在靶点并预测中药。对靶点和中药有效成分进行分子对接，并通过实验验证。将48只SD大鼠随机分出8只为空白组，剩下进行乙醇灌胃造模成功后随机均分为人参总皂苷低(10 mg·kg-1)、中(20 mg·kg-1)、高(40 mg·kg-1)剂量组、模型组和美他多辛阳性对照组(117 mg·kg-1)，空白组以等量生理盐水灌胃。灌胃3周后取血清测定血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平；取肝组织进行苏木素-伊红(HE)染色、蛋白免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR)，检测肝组织潜在靶点蛋白和基因表达水平。结果：数据分析预测出潜在基因：原癌基因FOS、Ⅰ型胶原蛋白α2链基因(COL1A2)，实验验证显示给药后肝脏损伤程度均较造模后减轻；血清AST、ALT水平在给药后降低；Western Blot和Real-time PCR结果显示给药后FOS蛋白和基因表达水平均明显增高，COL1A2则相反。结论：人参总皂苷能通过FOS和COL1A2改善酒精性肝炎。

关键词：生物信息学酒精性肝炎关键基因中药预测人参总皂苷

基于转录组学分析CD146在人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞条件培养液状态下的EAhy.926细胞中的基因表达差异

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基因组学与应用生物学 2024年第6期 1093-1110页

作者：王澜王子素李培霆曾家顺贵州医科大学临床医学院贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心贵州医科大学附属医院风湿免疫科

黑色素瘤细胞黏附分子CD146作为一种新的内皮细胞标志物，其表达与肿瘤、自身免疫性疾病的进展密切相关。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以对称性、慢性多关节炎症为特征表现的系统性自身免疫性疾病，滑膜血管翳作为RA... 详细信息

黑色素瘤细胞黏附分子CD146作为一种新的内皮细胞标志物，其表达与肿瘤、自身免疫性疾病的进展密切相关。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以对称性、慢性多关节炎症为特征表现的系统性自身免疫性疾病，滑膜血管翳作为RA的代表性病理产物在疾病的发生发展中起着重要作用。为了研究CD146分子在人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(human rheumatoid arthritis fibroblast like synovial cell, HFLS-RA)条件培养液状态下的人脐静脉内皮细胞株EAhy.926的基因表达差异及其影响机制，本研究通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制EAhy.926细胞中CD146的表达。培养并提取HFLS-RA上清液制备条件培养液。将转染后的EAhy.926细胞用HFLS-RA条件培养液培养24 h构建RA损伤模型，并对其进行转录组测序，筛选出差异表达基因(differentiallly expressed genes, DEGs),并通过GO、 KEGG通路分析，探索CD146调控的DEGs主要参与的相关信号通路及生物学过程。结果显示，与对照组细胞相比，HFLS-RA条件培养液状态下CD146敲低的EAhy.926细胞有341个DEGs,其中上调基因有173个，下调基因有168个；GO、 KEGG通路分析发现DEGs主要富集在Wnt信号通路、 PPAR信号通路、 TRP通道的炎症介质调节、脂肪细胞因子信号通路上，参与了细胞黏附、细胞运动、细胞定位、半胱氨酸生物合成过程等生物过程。本研究通过转录组学分析发现在HFLS-RA条件培养液状态下，CD146分子可能通过多条关键信号通路及多个基因影响EAhy.926。研究结果为探讨CD146分子在类风湿关节炎滑膜血管生成中的作用及机制的研究提供了理论依据。

关键词：转录组 CD146 类风湿关节炎 EAhy.926

基于网络药理学和动物体内试验验证云实感冒合剂对呼吸道合胞病毒作用

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中华微生物学和免疫学杂志 2024年第2期44卷 170-182页

作者：徐庆胜李玉迁蒋立娜魏洪迟茜文廖思睿陈维娇贵州医科大学基础医学院国家级实验教学中心微生物学教研室贵州省普通高校学校病原生物学特色重点实验室贵阳550025 贵州医科大学基础医学院微生物学教研室贵州省普通高校学校病原生物学特色重点实验室贵阳550025 贵州医科大学基础医学院国家级实验教学中心贵阳550025

目的基于网络药理学和体内试验探讨云实感冒合剂抗呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的作用机制。方法网络药理学预测:运用TCMSP、GeneCards等数据库预测云实感冒合剂干预RSV的活性成分及作用靶点。利用Cytoscape 3.2.1... 详细信息

目的基于网络药理学和体内试验探讨云实感冒合剂抗呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的作用机制。方法网络药理学预测:运用TCMSP、GeneCards等数据库预测云实感冒合剂干预RSV的活性成分及作用靶点。利用Cytoscape 3.2.1软件构建中药成分-疾病靶点网络图。通过STRING数据库分析蛋白质相互作用关系。借助Metascape数据库进行富集分析。采用分子对接技术分析验证网络药理学结果。云实感冒合剂干预RSV感染验证试验:滴鼻法建立RSV小鼠模型,灌胃合剂后检测血常规、肺指数,观察肺组织病理变化,流式细胞术检测外周血T细胞亚群,ELISA检测血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量,RT-PCR检测肺组织中TLR4、NF-κB和RSV-N基因mRNA相对水平。结果分析获得云实感冒合剂有效活性成分41个,抗RSV靶点111个,富集得到167条信号通路,主要是PI3K/AKT、MAPK、Toll-like等信号通路。分子对接结果显示,云实感冒合剂活性成分木犀草素、山奈酚、槲皮素与RSV-G、RSV-F、PI3K、AKT1、Bcl-2结合能均小于0 kcal/mol。体内试验结果显示,与RSV组相比,云实感冒合剂高剂量组白细胞、淋巴细胞计数升高、肺指数降低,差异有统计学意义(P学意义(P<0.05)。结论云实感冒合剂通过多成分、多靶点、多通路发挥调控RSV感染,主要通过缓解肺组织病理损伤,减轻炎症反应,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB通路激活有关。

关键词：云实感冒合剂网络药理学呼吸道合胞病毒体内试验分子对接

慢性间歇性低氧激活NLRP1炎性小体引起小鼠肝损伤

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细胞与分子免疫学杂志 2024年第4期40卷 327-332页

作者：余孝海孙敏琼汪金丽张森安徽医科大学基础医学院机能学实验中心安徽合肥230032 安徽城市管理职业学院健康养老学院公共管理教研室安徽合肥230011

目的探讨慢性间歇性低氧(CIH)是否能激活含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白1(NLRP1)炎性小体引起肝损伤。方法将C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组、 CIH组。CIH组小鼠放入CIH仓进行造模(每天8 h,连续4周)。造模后,采用H... 详细信息

目的探讨慢性间歇性低氧(CIH)是否能激活含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白1(NLRP1)炎性小体引起肝损伤。方法将C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组、 CIH组。CIH组小鼠放入CIH仓进行造模(每天8 h,连续4周)。造模后,采用HE染色观察肝组织细胞形态、试剂盒检测小鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平,二氢乙啶(DHE)标记检测肝组织活性氧(ROS)的水平,免疫组织化学染色法检测小鼠肝组织NLRP1、含胱天蛋白酶激活和募集结构域凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和胱天蛋白酶1(caspase-1)的表达和定位,Western blot法检测小鼠肝组织中NLRP1、 ASC、 caspase-1、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的蛋白表达,ELISA检测小鼠血清IL-1β、 TNF-α水平。结果与对照组相比,CIH组肝细胞病变明显,细胞出现破裂、坏死、炎症细胞聚集,ALT、 AST、 ROS、 IL-1β和TNF-α水平显著升高;NLRP1、 ASC、caspase-1、IL-1β和TNF-α的蛋白表达升高。结论 CIH通过激活NLRP1炎性小体引起肝损伤。

关键词：慢性间歇性低氧(CIH) 炎性小体(inflammasome) 肝损伤活性氧(ROS)

Tet-On系统中多西环素对MBD1诱导表达的调控研究

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生物技术通报 2024年

作者：卢茜袁月李丹张鹏基础医学院生物学教研室组织工程与干细胞实验中心功能核酸生物药研究重点实验室贵州医科大学

【目的】构建甲基结合蛋白1(MBD1)的Tet-On可诱导表达质粒和293T细胞，探讨多西环素（Dox）对MBD1表达的影响，并通过分析细胞中质粒启动子CpG甲基化水平反映MBD1调控机制。【方法】使用MBD1引物扩增293T的MBD1表达序列，将其连接于Tet... 详细信息

【目的】构建甲基结合蛋白1(MBD1)的Tet-On可诱导表达质粒和293T细胞，探讨多西环素（Dox）对MBD1表达的影响，并通过分析细胞中质粒启动子CpG甲基化水平反映MBD1调控机制。【方法】使用MBD1引物扩增293T的MBD1表达序列，将其连接于Tet-On诱导表达质粒的多克隆位点；将构建成功的质粒用电转染的方法转入MBD1 KO 293T，使用荧光显微镜及Western blot验证获得的MBD1恢复的293T(MBD1 RE 293T)；使用不同浓度Dox诱导MBD1表达，利用Western blot检测单克隆细胞中MBD1的表达情况；使用同一浓度Dox诱导MBD1表达，在12、24、48、96、144、192 h收集细胞，利用Western blot检测细胞中MBD1的表达情况；使用亚硫酸氢盐测序方法检测Dox诱导后细胞内可诱导质粒启动子CpG甲基化情况。【结果】成功构建Tet-On诱导表达MBD1质粒；和未诱导细胞相比，Dox诱导后转染细胞MBD1蛋白重新表达；随着Dox浓度的升高细胞中MBD1的表达逐渐增多；相同浓度Dox诱导后，从12-96 h细胞内MBD1的表达逐渐升高，但144 h后MBD1表达下降；细胞内质粒启动子CpG甲基化检测显示，与96 h相比，144和192 h质粒启动子甲基化水平逐渐升高；在诱导144 h加入甲基转移酶抑制剂地西他滨（Decitabine）后，质粒启动子甲基化水平降低，MBD1表达升高。【结论】Tet-On可诱导细胞中重新表达MBD1蛋白，并且表达量与Dox浓度正相关，但长时间诱导后细胞内质粒CpG甲基化水平升高，影响细胞中MBD1的表达。

关键词： Tet-On MBD1 MBD1ΔCXXC3 甲基化 HEK293T

钙结合蛋白S100A4通过TLR4/NF-κB信号通路调控胶质瘤细胞增殖、存活及迁移功能

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中国免疫学杂志 2024年第5期40卷 910-917页

作者：张丁山陶甜莫诗卉吴通前何菁菁余芳贵州医科大学附属医院临床检验中心贵州医科大学医学检验学院贵阳550004 贵州医科大学附属医院临床医学研究中心贵阳550004

目的:探索外源性钙结合蛋白S100A4对胶质瘤细胞增殖、存活及迁移功能的影响及机制。方法:利用UCSC数据库下载泛癌数据集,进行S100A4在泛癌中的表达及预后分析;从CGGA数据库中下载胶质瘤患者的转录组数据和临床数据,利用R软件进行分析S10... 详细信息

目的:探索外源性钙结合蛋白S100A4对胶质瘤细胞增殖、存活及迁移功能的影响及机制。方法:利用UCSC数据库下载泛癌数据集,进行S100A4在泛癌中的表达及预后分析;从CGGA数据库中下载胶质瘤患者的转录组数据和临床数据,利用R软件进行分析S100A4表达在胶质瘤患者中的预后与进展;利用在线分析工具GEPIA与STRING进行胶质瘤患者的S100A4蛋白质网络互作分析。体外培养人胶质瘤细胞系(U87与U251),实验分为3组:PBS组、S100A4组、S100A4+TAK242组[瑞沙托维(TAK242)为Toll-样受体4(TLR4)特异性抑制剂]。流式细胞术检测胶质瘤细胞的增殖与凋亡;细胞划痕实验、Transwell实验及克隆形成实验检测U87与U251细胞的迁移及增殖能力;Western blot检测TLR4蛋白、NF-κB相关信号分子蛋白水平。结果:生物信息学结果显示,S100A4在多种肿瘤中显著上调(P实验中,与PBS组相比,外源性S100A4处理后,胶质瘤U87和U251细胞增殖、迁移能力增强,TLR4、p-ERK1/2、p-p38、p-p65蛋白水平显著上调(P<0.05)。与S100A4组相比,S100A4+TAK242组胶质瘤细胞增殖、迁移能力减弱,TLR4、p-ERK1/2、p-p38、p-p65蛋白水平显著下调(P<0.05)。结论:S100A4可能通过TLR-4/NF-κB信号通路调控胶质瘤细胞增殖、迁移及存活功能。

关键词：胶质瘤 S100A4 增殖迁移 TLR-4/NF-κB信号通路

贵州省贵阳地区HPV分型及宫颈病变情况分析

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医学动物防制 2024年第6期40卷 521-526,530页

作者：刘蕊魏洪蒋立娜徐庆胜王硕石王皞贵州省普通高校学校病原生物学特色重点实验室贵州医科大学基础医学院贵州贵阳550025 贵州医科大学基础医学国家级实验教学中心贵州中医药大学第二附属医院贵州省人民医院急诊科

目的分析贵阳地区人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)流行病学特征及感染后宫颈病变情况,为此地区宫颈癌筛查、防治和疫苗接种提供临床依据。方法收集2017—2022年在贵州中医药大学某医院就诊,自愿行HPV分型检查女性为研究对象,... 详细信息

目的分析贵阳地区人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)流行病学特征及感染后宫颈病变情况,为此地区宫颈癌筛查、防治和疫苗接种提供临床依据。方法收集2017—2022年在贵州中医药大学某医院就诊,自愿行HPV分型检查女性为研究对象,采用实时荧光定量PCR对28种HPV进行检测,采用液基薄层细胞学检查(thin-prep cytology test,TCT)检测宫颈病变情况,应用Excel 2010和SPSS 22.0软件对数据进行整理和统计分析,组间比较采用χ^(2)检验,以P学意义。结果2017—2022年共检测妇科门诊就诊女性19426例,HPV检出率为20.45%(3972/19426),HPV单一型别感染率为15.15%(2944/19426),多重感染率为5.29%(1028/19426),高危型HPV感染率高于中危型和低危型,差异有统计学意义(χ^(2)=9.743,P=0.002)。不同年龄组均以单一高危型感染为主,其中<20岁年龄组常见感染亚型为HPV52、HPV16、HPV18,其余年龄组常见感染亚型为HPV16、HPV52、HPV58。宫颈病变情况分析显示,低级别鳞状上皮内病变组和高级别鳞状上皮内病变组均以单型别感染为主,主要的感染型别为HPV16和HPV52。结论本研究中HPV感染总检出率为20.45%,不同年龄组以单一高危型感染为主,HPV16和HPV52为各年龄组感染的优势亚型及导致该地区宫颈病变的主要型别。

关键词：人乳头瘤病毒宫颈癌基因型别 TCT 分析

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彗星实验方法的优化及影响因素的分析

安徽医科大学学报 2024年第2期59卷 219-223页

作者：范南英张鹏贵州医科大学基础医学院生物学教研室贵阳550025 贵州医科大学细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室组织工程与干细胞实验中心贵州省再生医学重点实验室贵阳550025

目的为了更有效地检测细胞DNA损伤,对彗星实验的影响因素进行优化并建立阳性对照。方法以传统碱性彗星实验为基础,对制胶方法、凝胶浓度、琼脂糖溶剂、裂解时间、细胞密度和电泳电压加以优化。以过氧化氢(H_(2)O_(2))作为DNA损伤诱导剂... 详细信息

目的为了更有效地检测细胞DNA损伤,对彗星实验的影响因素进行优化并建立阳性对照。方法以传统碱性彗星实验为基础,对制胶方法、凝胶浓度、琼脂糖溶剂、裂解时间、细胞密度和电泳电压加以优化。以过氧化氢(H_(2)O_(2))作为DNA损伤诱导剂诱导HL-60细胞作为该实验的阳性对照。结果优化后的实验结果显示,制胶方法由三步法进步为两步法,以PBS为琼脂糖溶剂,0.8%正常熔点琼脂糖制备底层胶,0.7%低熔点琼脂糖与细胞悬液混合作为第二层胶,制胶效果好,操作更简单省时,较好地解决了脱胶问题。裂解1 h,1 V/cm电压电泳,获得了具有代表性的彗星图像,结果易于判读,能有效避免假阳性结果。并对不同浓度H_(2)O_(2)诱导的HL-60细胞DNA损伤情况进行比较,成功建立了彗星实验的阳性对照。结论与传统方法相比,优化后的彗星实验方法成本更低,更简单、快速、准确,重复性也更好,能够快速检测细胞中的DNA损伤。

关键词：彗星实验 HL-60 DNA损伤模型