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乙型肝炎病毒中国流行株C基因型稳定转染细胞模型的评价与应用

第十二次全国医学遗传学学术会议

作者：申本昌朱蔚云李佩琼谢天炽广州医学院基础学院生物技术系

目的探讨一种简单、快捷的不依赖于载体多克隆位点及目的序列的基因亚克隆PCR方法。方法设计一对针对目的序列及载体序列的PCR上、下游引物,扩增目的序列的引物末端分别和载体序列有18个碱基的重叠,使用高保真的DNA聚合酶进行目的序列... 详细信息

目的探讨一种简单、快捷的不依赖于载体多克隆位点及目的序列的基因亚克隆PCR方法。方法设计一对针对目的序列及载体序列的PCR上、下游引物,扩增目的序列的引物末端分别和载体序列有18个碱基的重叠,使用高保真的DNA聚合酶进行目的序列和载体序列的扩增,扩增产物混合后,利用DpnI消化降解目的序列及载体的PCR模板,混合物直接用于转化,挑取阳性克隆,测序证明方法的可靠性,提取阳性克隆的质粒,体外转录的mRNA纯化后注入非洲爪蟾卵,进行表达。结果利用本方法,亚克隆了很多人的尼古丁受体(nAChR)亚基α,α和β、5-羟色胺受体3A(5-HTA)到载体pGEMHE,人表皮细胞特异分子2基因到p3XFLAGCMV-14载体,人的Akt3vl、Akt3v2基因到pLXSN载体。pGEMHE载体含有非洲爪蟾β血红蛋白的5’及3’非翻译区,因此可以在非洲爪蟾卵中进行高效表达,利用上述方法,亚克隆的基因在非洲爪蟾卵中表达水平增加最高达200倍。结论利用该方法进行基因的亚克隆,不需要PCR产物的胶回收,而且不需要使用针对特定多克隆位点的特异的限制性内切酶,由于本方法使用高保真的DNA聚合酶,PCR扩增仅18个循环,降低了聚合酶所引起的错误扩增所引起的突变,利用该亚克隆方法,证明可以简单、快捷地将目的DNA片段或一个基因的cDNA亚克隆入质粒或载体,具有重复性好、实用的特点,因为该方法不依赖于序列,因此可以用于DNA嵌合体(chimera)的构建、120个碱基范围内的多点突变研究。

关键词：基因亚克隆聚合酶链反应

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乙型肝炎病毒中国流行株C基因型稳定转染细胞模型的评价与应用

作者：张婷玉河南中医学院

学位级别：硕士

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染及其引起的一系列相关疾病是一种严重影响人类健康的全球性疾病,世界各国的科学家们从不同的方面对HBV感染的有效防治进行了大量的相关研究、探索和尝试。乙肝疫苗、干扰素(Interferon,INF)和核... 详细信息

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染及其引起的一系列相关疾病是一种严重影响人类健康的全球性疾病,世界各国的科学家们从不同的方面对HBV感染的有效防治进行了大量的相关研究、探索和尝试。乙肝疫苗、干扰素(Interferon,INF)和核苷(酸)类似物(Nucleotide analogues,Nas)是现阶段防治慢性乙型肝炎病毒感染有效的主要手段,乙肝疫苗虽然可起到预防作用,但对已感染者、免疫耐受者和病毒逃逸株无效,而现阶段使用的抗病毒药物,存在副作用较大(干扰素)、易产生耐药(核苷类药物)、抗原血清转换率低等诸多缺点。建立细胞模型是研究病毒感染史、生物学特性、评价药物疗效、优化治疗方案、研究高效疫苗和开发新产品高效便捷的技术手段。现有的细胞模型包括病毒感染细胞模型、病毒瞬时转染细胞模型和病毒稳定转染细胞模型。对于病毒感染细胞模型,虽然近年发现了HBV的受体分子钠离子一牛磺胆酸共转运蛋白(Sodium taurocholate co-transporting polypeptide,NTCP),但其感染效率仍然较低并且操作复杂,另外由于HBV严格的物种和组织特异性属性,限制了此种细胞模型的应用,病毒的瞬时转染系统在肝癌细胞中的病毒复制很难长期保持稳定,不适合实验的标准化的需要,如药物敏感试验。20余年来国内外已经建立了可以复制和分泌HBV病毒颗粒的稳定细胞系,如国际上公认的Hep G2.2.15细胞和Hep AD38细胞。其他实验室为了满足抗病毒耐药变异研究的需求,也相继建立起了耐药突变的HBV稳定复制细胞株,但仍然缺少我国流行的(B和C基因型)HBV毒株稳定复制细胞系和多重耐药细胞株;另外一些细胞株人为诱导的HBV突变细胞株,不能反映出病毒的自然遗传特征。因此,建立HBV中国流行株B和C基因型稳定复制细胞模型,符合我国临床实际,对于抗病毒药物的评价及乙肝防治方案的本土化具有积极作用。本实验室在前期的工作中通过联合应用PB转座子及其他技术构建了中国流行株C基因型野生株和耐药株的稳定转染细胞,本研究旨在对此稳转细胞的各项指标进行分析,并将其初步应用在体外抗HBV药效学评价上,期望该稳转细胞能够为抗HBV新药药效评价提供理想的细胞模型。目的:检测分析本实验室前期构建的HBV中国流行株C基因型稳转细胞:Hep ***和Hep ***细胞系的各项复制指标,评价该稳转细胞特性与经典HBV稳转细胞模型的差异;用临床常用核苷类药物来评价稳转细胞系用于药物评价的可靠性;设计用于表达新型小发卡rna(shorthairpinrna,shrna)的慢病毒载体,并考察其用于抗乙型肝炎病毒的可行性。方法:1、hbv稳定转染细胞特征分析:1)化学发光法定量检测***和***细胞上清hbv表面抗原(hepatitisbvirussurfaceantigen,hbsag)的表达和e抗原(hepatitisbviruseantigen,hbeag)的表达;2)荧光定量rcr法检测***和***细胞上清hbvdna的含量;3)酶联免疫吸附法定性检测胞内乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原的表达;4)间接免疫荧光法检测胞内乙型肝炎病毒表面抗原的表达;5)间接免疫荧光法检测胞内乙型肝炎病毒核心抗原的表达;6)酶联免疫吸附法定性检测***和***细胞系细胞上清乙型肝炎病毒前s1抗原(hbvpres1)的表达。2、用临床常用核苷类药物来评价***和***细胞系用于药物评价的可靠性:选用我国三种临床常用核苷类药物:拉米夫定(lam)、恩替卡韦(etv)、阿德福韦酯(adv),稀释为0、0.001、0.01、0.1、1、10、100μm的一系列的浓度梯度,分别作用于hepad38(阳性对照)、***和***三种细胞系,连续正常培养九天后用荧光定量rcr法检测三种细胞上清乙型肝炎病毒dna的含量。3、新型小发卡rna慢病毒表达载体的构建及抗乙型肝炎病毒应用评价:对慢病毒载体骨架sapi位点进行突变,并将用于表达新型小发卡rna的结构亚克隆到改造后的慢病毒载体;设计靶向hbv保守序列的shrna并克隆到该慢病毒载体,包装含有shrna序列的重组慢病毒并进行定量,考察单个及多个shrna结构串联对慢病毒滴度的影响;将重组慢病毒感染hbv稳定转染肝细胞系***(moi=3),用氳稻霉素(blasticidin)筛选稳定克隆1周后,将其重新消化,并以1×105/孔接种于24孔板中,于铺板96h后取细胞上清检测hbsag、hbeag表达水平和hbvdna的含量。结果:1、稳定转染细胞特征分析结果:1)阳性对照hepg2.2.15细胞上清hb

关键词：乙型肝炎病毒中国流行株C基因型稳转细胞核苷类药物慢病毒载体 sh RNA

敲减 LMNA 后肾癌细胞786-O的基因表达谱分析

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遵义医科大学学报 2021年第5期44卷 625-634页

作者：辛慧唐余金燕红余从黄奉善潘有福遵义医科大学基础医学院医学遗传学教研室贵州遵义563099

目的研究敲减LMNA基因(编码lamin A/C)对肾癌细胞786-O的基因表达谱的影响,从而探讨LMNA在肾癌发生发展中的分子机制。方法在完全培养基RPMI 1640中培养肾癌细胞系786-O,将siRNA(siControl、siLMNA-2)转染786-O细胞,72 h后收集细胞,提取... 详细信息

目的研究敲减LMNA基因(编码lamin A/C)对肾癌细胞786-O的基因表达谱的影响,从而探讨LMNA在肾癌发生发展中的分子机制。方法在完全培养基RPMI 1640中培养肾癌细胞系786-O,将siRNA(siControl、siLMNA-2)转染786-O细胞,72 h后收集细胞,提取RNA,建立cDNA文库并利用Illumina测序平台进行RNA测序(RNA-seq)。测序结果经联川生物平台分析,鉴定DEGs。细胞经siControl、siLMNA-1、siLMNA-2转染后对部分基因进行实时荧光定量PCR(qPCR)验证。DEGs经Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes(KEGG)富集分析,并探讨了部分DEGs在临床样本中的表达水平与总生存期(Overall survival,OS)的相关性。结果鉴定到89个DEGs,46个上调,43个下调。GO分析表明转录调控(Regulation of transcription,DNA-templated)、肽修饰(Peptide modification)、真核生物的核糖体生物发生(Ribosome biogenesis in eukaryotes)、牛磺酸和低牛磺酸代谢(Taurine and hypotaurine metabolism)等显著富集。部分受LMNA调控的DEGs如MIEF1、UTP14C、SPIN1等基因在临床标本中较低表达,并与较差的OS相关。结论LMNA基因除了编码lamin A/C作为核纤层主要成分起着核骨架的作用外,还可能通过影响MIEF1、UTP14C、SPIN1等基因的表达,参与到肾细胞癌的发生发展过程。这些基因产物有可能为临床上LMNA扩增或高表达的病人类型,提供诊断标志和潜在的药物靶标。

关键词： 786-O LMNA 基因表达谱差异表达基因肾细胞癌

胎儿视网膜色素上皮细胞的原代培养和体外增殖能力的测定

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中华细胞与干细胞杂志（电子版） 2014年第1期4卷 13-16页

作者：袁松涛薛志刚林卿刘庆淮范国平江苏省人民医院眼科南京210029 同济大学苏州研究院同济大学医学院苏州瑞奇生物医药科技有限公司加利福尼亚大学洛杉矶分校人类遗传系

目的：建立胎儿视网膜色素上皮细胞（fRPE）的原代培养方法。方法分离流产胎儿RPE，并进行体外原代培养、传代，免疫荧光检测培养RPE细胞分子标志物。以β细胞增殖诱导剂（二芳基脲衍生物WS3）刺激RPE细胞增殖，并测量其生长曲线。3组... 详细信息

目的：建立胎儿视网膜色素上皮细胞（fRPE）的原代培养方法。方法分离流产胎儿RPE，并进行体外原代培养、传代，免疫荧光检测培养RPE细胞分子标志物。以β细胞增殖诱导剂（二芳基脲衍生物WS3）刺激RPE细胞增殖，并测量其生长曲线。3组细胞比较采用单因素F检验。结果源自不同胎儿的fRPE细胞在原代及体外增殖中并未表现出明显不同。在体外扩增的4代fRPE中，100﹪的细胞表现出了良好的细胞形态。免疫荧光染色证实了体外扩增的fRPE细胞可很好的表达RPE细胞标记物。WS3未见有刺激RPE细胞体外增殖的作用。培养后不同时间三组细胞差异均有统计学意义（F=119.437~234.368,P均=0.000）。结论 fRPE细胞可在非复杂的培养环境中实现体外大量增殖，这些体外增殖的fRPE细胞可以为RPE移植细胞治疗视网膜黄斑病变提供丰富的细胞来源。

关键词：视网膜上皮细胞细胞增殖细胞培养技术黄斑变性

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检验医学新技术发展的现状

临床和实验医学杂志 2011年第22期10卷 1792-1794页

作者：陆祖恒张银辉长沙医学院检验系湖南长沙410219 广东医学院附属深圳福田医院检验医学部广东深圳518033

当今由于分子生物学新技术、标记免疫分析技术、生物传感器技术、流式细胞技术、自动化与信息技术的发展及其在人类战胜各种疾病,如：传染性疾病、肿瘤、心脑血管疾病、遗传性疾病等方面的早期诊断中的应用,使得检验医学诊断技术的发展... 详细信息

当今由于分子生物学新技术、标记免疫分析技术、生物传感器技术、流式细胞技术、自动化与信息技术的发展及其在人类战胜各种疾病,如：传染性疾病、肿瘤、心脑血管疾病、遗传性疾病等方面的早期诊断中的应用,使得检验医学诊断技术的发展成为临床疾病诊断的先驱.

关键词：检验医学分子生物学技术聚合酶链反应标记免疫分析生物传感器流式细胞术自动化与信息技术

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人类线粒体DNA多态性及其应用的研究进展

国际遗传学杂志 2009年第6期32卷 431-435页

作者：朱颖婷程慧华金颖徐开轶夏之秋漆微韡骆晓枫中山大学中山医学院临床医学一系中山大学基础医学实验教学中心分子医学实验室

线粒体DNA是惟一分布于核外的遗传物质,呈严格母系遗传,突变率高且积累量大,因此人类线粒体DNA的遗传多态性对于个体识别、种族遗传关系分析、亲缘关系鉴定等具有重要意义,本文对人类线粒体DNA多态性应用于以上方面的研究进展以予综述。

关键词：线粒体DNA 多态性

HIV-1 Nef蛋白最新功能及其增强病毒感染性分子机理的研究进展

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病毒学报 2018年第1期34卷 113-120页

作者：时静张险峰郑永辉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所美国密歇根州立大学天然免疫联合实验室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069 美国密歇根州立大学微生物和分子遗传系天然免疫实验室东兰辛48824

Nef蛋白是人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）及其他灵长类动物慢病毒编码的一种附属蛋白,在获得性免疫缺陷综合症（AIDS）疾病进程和病毒的复制过程中起着重要作用。抑制附属蛋白活性的策略可以改善传统抗逆转录病毒方案的疗效,因此深入理... 详细信息

Nef蛋白是人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）及其他灵长类动物慢病毒编码的一种附属蛋白,在获得性免疫缺陷综合症（AIDS）疾病进程和病毒的复制过程中起着重要作用。抑制附属蛋白活性的策略可以改善传统抗逆转录病毒方案的疗效,因此深入理解这一附属蛋白的功能和其分子作用机制具有重要意义。Nef蛋白通过三个主要活性调节宿主细胞环境,增强病毒复制。下调细胞表面分子如CD4,MHC-Ⅰ,MHC-Ⅱ等的表达,使病毒逃逸宿主的免疫应答;通过调节T细胞的信号通路降低T细胞的活化,从而营造有利于病毒复制的环境;直接增强新生子代病毒粒子的感染性。这一功能的分子机制直到最近宿主限制性因子丝氨酸转运蛋白（SERINC5）的发现才得以明晰。本文总结了Nef的功能及其增强病毒感染性的最新研究进展,同时也归纳了SERINC5蛋白与Nef蛋白的相互作用的研究报道,为深入了解病毒复制机理,改善HIV-1防治方案提供新的理论线索。

关键词：人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1) Nef SERINC5 感染性

不同转移潜能人肝癌细胞系酪氨酸磷酸化蛋白质差异分析

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不同转移潜能人肝癌细胞系酪氨酸磷酸化蛋白质差异分析

中国蛋白质组学第二届学术大会

作者：张丽君宋海燕申华莉冯巨涛代智刘银坤复旦大学基础医学院分子遗传教研室复旦大学肝癌研究所复旦大学化学系

蛋白质的磷酸化是翻译后修饰的常见类型,能够敏感而可逆地调节蛋白质功能。其中蛋白质的酪氨酸磷酸化修饰在调控细胞增殖、分化、信号传导和代谢等生命过程以及某些疾病的发生发展中都起着非常重要的作用,在恶性肿瘤的转移和复发过程中...

蛋白质的磷酸化是翻译后修饰的常见类型,能够敏感而可逆地调节蛋白质功能。其中蛋白质的酪氨酸磷酸化修饰在调控细胞增殖、分化、信号传导和代谢等生命过程以及某些疾病的发生发展中都起着非常重要的作用,在恶性肿瘤的转移和复发过程中通常也发生改变。

关键词：

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几种常见泌尿生殖系统先天畸形的相关基因

国际遗传学杂志 2008年第2期31卷 139-142+154页

作者：张静淑李岭中国医科大学基础医学院遗传学教研室

泌尿生殖系统先天畸形系发生率较高的儿科疾病之一,对其分子机制的深入研究将有助于揭示人类泌尿生殖系统疾病的发生机制,并为早期基因诊断及遗传咨询提供依据。该文对多囊肾、尿道下裂、隐睾、先天性输精管缺如相关基因研究的最新进展... 详细信息

泌尿生殖系统先天畸形系发生率较高的儿科疾病之一,对其分子机制的深入研究将有助于揭示人类泌尿生殖系统疾病的发生机制,并为早期基因诊断及遗传咨询提供依据。该文对多囊肾、尿道下裂、隐睾、先天性输精管缺如相关基因研究的最新进展进行综述。

关键词：泌尿生殖系统先天畸形基因