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人脐带间充质干细胞联合褪黑素对化疗致早发性卵巢功能不全的治疗作用及机制

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中国组织工程研究 2024年

作者：魏璐晓黄冰雪杜静石拴霞王纪田王玲中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院生殖医学中心甘肃中医药大学第一临床医学院中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院甘肃省干细胞与基因药物重点实验室

背景：目前研究证明，人脐带间充质干细胞和褪黑素均可改善卵巢功能，但人脐带间充质干细胞联合褪黑素对化疗所致早发性卵巢功能不全的保护作用及机制尚未有研究报道。目的：探讨人脐带间充质干细胞联合褪黑素对化疗所致早发性卵巢功能... 详细信息

背景：目前研究证明，人脐带间充质干细胞和褪黑素均可改善卵巢功能，但人脐带间充质干细胞联合褪黑素对化疗所致早发性卵巢功能不全的保护作用及机制尚未有研究报道。目的：探讨人脐带间充质干细胞联合褪黑素对化疗所致早发性卵巢功能不全的保护作用及机制。方法：将动情周期正常的40只Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、人脐带间充质干细胞组、褪黑素组和人脐带间充质干细胞+褪黑素组，每组8只。除对照组外，其他组腹腔注射顺铂溶液构建早发性卵巢功能不全大鼠模型，人脐带间充质干细胞组和人脐带间充质干细胞+褪黑素组于造模后第1,6,11天分别尾静脉注射1×106个人脐带间充质干细胞，褪黑素组和人脐带间充质干细胞+褪黑素组每日腹腔注射10 mg/kg褪黑素，治疗期间监测大鼠体质量和动情周期变化。治疗14 d后，ELISA法检测血清雌二醇、卵泡刺激素、促黄体生成素、抗缪勒管激素水平，计算卵巢指数，苏木精-伊红染色观察卵巢组织学形态，透射电镜观察卵巢颗粒细胞超微结构，Western blot检测PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白和LC3、P62等自噬蛋白在卵巢组织中的表达。结果与结论：(1)与对照组相比，模型组大鼠体质量逐渐减轻、动情周期紊乱，卵巢指数显著下降(P <0.01)；雌二醇、抗缪勒管激素水平降低(P <0.01)，卵泡刺激素、促黄体生成素水平升高(P <0.01)；卵巢组织学形态和卵巢颗粒细胞超微结构严重破坏；p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和P62蛋白表达显著降低(P <0.01),LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著升高(P <0.001)。(2)与模型组相比，各治疗组大鼠体质量逐渐恢复，部分大鼠动情周期恢复正常，卵巢指数显著升高(P <0.01)；雌二醇、抗缪勒管激素水平升高(P <0.05)，卵泡刺激素、促黄体生成素水平降低(P <0.05)；卵巢组织学形态和卵巢颗粒细胞超微结构显著改善；p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和P62蛋白表达显著升高(P <0.001),LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著降低(P <0.01)。其中人脐带间充质干细胞+褪黑素组上述指标改善更为显著。结果表明，人脐带间充质干细胞联合褪黑素可能通过上调PI3K/AKT/mTOR信号通路，抑制卵巢颗粒细胞自噬来治疗早发性卵巢功能不全。

关键词：早发性卵巢功能不全人脐带间充质干细胞褪黑素雌激素自噬 PI3K AKT mTOR

肺血管靶向性细胞外囊泡的构建及其在急性肺损伤治疗中的作用研究

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肺血管靶向性细胞外囊泡的构建及其在急性肺损伤治疗中的作用研究

作者：顾铮岩中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

一、研究背景及目的急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)是一种常见的临床综合征,患者主要表现为肺顺应性降低、严重的低氧血症和进行性呼吸衰竭。机械通气和类固醇药物是临床常用的治疗手段。虽然上述疗法在一定程度上缓解ALI症状,但病... 详细信息

一、研究背景及目的急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)是一种常见的临床综合征,患者主要表现为肺顺应性降低、严重的低氧血症和进行性呼吸衰竭。机械通气和类固醇药物是临床常用的治疗手段。虽然上述疗法在一定程度上缓解ALI症状,但病死率仍居高不下。因此,寻找一种高效、低毒的治疗药物成为当前的研究热点。细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是一类由细胞分泌具有脂质双层结构的小囊泡。大量研究表明,多种天然细胞来源的EVs在ALI中发挥显著的疗效。然而,天然EVs存在组织靶向性差、活性物质含量低等缺陷,使其在临床转化中受限。为了克服上述问题,本课题设计了一种工程化EVs,即LET-EVs-miRNA-125b。利用内皮细胞来源的EVs作为修饰母体,通过基因工程手段将一段肺微血管内皮靶向肽(Lung microvascular endothelial cell targeting peptides,LET)修饰于EVs表面,提高肺组织靶向性。采用化学转染试剂将一段具有抗炎和血管修复作用的miRNA-125b(hasmiRNA-125b-5p)负载其中以提高生物活性。为了探究LET-EVs-miRNA-125b在ALI治疗中的可行性,分别在ALI动物模型和内皮细胞损伤模型进行LET-EVs-miRNA-125b靶向性和药效学评价。二、研究方法构建LAMP-2B-LET慢病毒载体转染内皮细胞,通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot,WB)验证细胞转染效率;采用尺寸排阻法分离获得LET-EVs,采用纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle tracking analysis,NTA)、透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)和WB对其进行表征;采用化学转染试剂将miRNA-125b负载于LET-EVs,通过q RT-PCR验证miRNA-125b的负载效率。LET-EVs与肺微血管内皮细胞(Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells,HPMVECs)共孵育评价LET-EVs的体外靶向性;利用小动物成像系统和组织免疫荧光(Immunofluorescence,IF)染色评价LET-EVs的肺组织靶向性;利用LPS构建ALI小鼠模型,通过给ALI小鼠静脉注射LET-EVs-miRNA-125b,检测肺组织病理变化、肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中炎性细胞及炎性因子数量、肺湿/干重比(Wet weight/dry weight,W/D)、BALF蛋白浓度等指标,探究LETEVs-miRNA-125b对ALI的治疗作用。为探究LET-EVs-miRNA-125b对ALI中内皮屏障的修复作用,对小鼠肺组织进行TUNEL、Ki67、内皮细胞连接蛋白IF染色,在动物水平上评价LET-EVs-miRNA-125b对内皮屏障的修复作用。在细胞水平上利用TNF-α构建内皮屏障损伤细胞模型,通过测定细胞跨膜电阻值(Trans-epithelial electrical resistance,TEER)、细胞活力、细胞凋亡、细胞增殖、细胞间连接蛋白等指标,进一步验证LET-EVs-miRNA-125b对内皮屏障的修复作用。为探究LET-EVsmiRNA-125b修复内皮屏障的作用机制,对小鼠肺组织进行了转录组测序分析,筛选出差异基因及关键信号通路。利用WB验证关键基因及相关通路的在蛋白水平的表达。通过生物信息学分析和双荧光素酶报告验证实验寻找miRNA-125b与关键基因的作用关系。三、研究结果1、成功构建LET-EVs-miRNA-125b。转染的内皮细胞表达绿色荧光标签蛋白且LAMP-2B在m RNA和蛋白水平表达上调,表明成功构建LET细胞株。分离获得的LET-EVs呈现杯状结构,直径在130 nm范围,表达EVs标志分子,符合国际EVs的鉴定标准。q RT-PCR实验表明,LET-EVs-miRNA-125b成功包载了miRNA-125b且包封效率为41.65%。细胞摄取、小动物成像和组织IF实验提示,LET-EVs具有优越的肺组织靶向性且可以直接作用于损伤的内皮细胞。2、LET-EVs-miRNA-125b能有效地减轻ALI。我们利用LPS成功构建了ALI小鼠模型。在ALI小鼠模型中,静脉注射LET-EVs-miRNA-125b后,小鼠肺组织中肺泡数增多、肺泡壁厚度降低、平均线性截距减少,表明LET-EVs-miRNA-125b可以改善肺损伤;BAL

关键词：急性肺损伤细胞外囊泡工程化细胞外囊泡肺微血管内皮屏障 miRNA-125b

仿生载rhBMP-2的骨修复材料的制备和功能研究

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仿生载rhBMP-2的骨修复材料的制备和功能研究

作者：齐军强中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

严重的骨损伤、骨缺损常需行骨移植术,自体骨和异体骨移植因存在二次手术、骨源有限、骨诱导性低等问题,临床应用受限。负载重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)的组织工程骨具有取材方便、来源广泛、可个性化制备等优点,已成为骨修复的重... 详细信息

严重的骨损伤、骨缺损常需行骨移植术,自体骨和异体骨移植因存在二次手术、骨源有限、骨诱导性低等问题,临床应用受限。负载重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)的组织工程骨具有取材方便、来源广泛、可个性化制备等优点,已成为骨修复的重要方式。但rhBMP-2的释放时间短,大剂量使用会导致骨囊肿等并发症。针对目前含rhBMP-2骨修复材料的缺点,我们利用聚乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸(PLGA-PEG-PLGA)温敏水凝胶作为rhBMP-2的缓释载体,实现rhBMP-2在骨修复期间的长时间释放,并避免大剂量使用导致的并发症。将其与多孔羟基磷灰石(HA)支架复合,仿生自然骨有机物-无机物组分、多孔分层网状结构、优良骨传导性和骨诱导性的特点,制备具有高效成骨诱导活性的仿生复合骨修复材料。目的:制备控释rhBMP-2的仿生复合骨修复材料,研究材料体外生长因子缓释性能、细胞相容性及促成骨分化能力,通过异位成骨和骨缺损修复模型,评价其体内骨修复能力。方法:1、材料制备及表征:以碳酸钙、磷酸氢钙为原料,通过固相反应法高温煅烧合成HA粉体,利用有机泡沫浸渍法和高温烧结制备HA多孔支架。以乙交酯和丙交酯为原料,通过开环聚合法合成PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶。低温下将载有rhBMP-2的25wt%PLGA-PEG-PLGA水凝胶与HA支架复合,升温后制得rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA仿生复合骨修复材料,通过XRD、TG-DSC、SEM、EDS、ELISA实验等研究其理化性质及体外缓释特点。2、体外生物活性评价:将材料分为HA组、PLGA-PEG-PLGA/HA组、rhBMP-2/HA组及rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组,通过SEM、CCK8实验及死/活荧光染色检测材料对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外相容性,通过ALP染色和活性测定、茜素红染色和钙结节含量检测评估各组材料对BMSCs的成骨诱导能力,通过q RT-PCR检测成骨基因ALP、OPN、OCN及Run X-2的m RNA表达,通过Western blot检测成骨相关蛋白Smad1、p-Smad1、Smad5、p-Smad5和Run X-2的表达,综合评估材料诱导BMSCs成骨分化性能。3、体内生物活性评价:选用66只新西兰兔,12只制备后肢肌袋异位成骨模型,54只制备股骨外侧髁临界骨缺损模型。将四组材料HA(A组)、PLGA-PEG-PLGA/HA(B组)、rhBMP-2/HA(C组)及rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA(D组)植入股部肌袋,术后12周观察材料周围及表面情况,通过夹持实验、Micro-CT重建分析,评估材料体内相容性和异位成骨性能。以市售磷酸钙人工骨(E组)、自体骨(F组)为对照,将各组材料植入股骨髁临界骨缺损处,术后4周、8周和12周取材,通过大体观察、影像学及组织形态学研究材料的骨修复效果。结果:1、HA支架具有大孔和微孔结构,孔隙率为77.80%±1.06%,抗压强度为4.54±0.33 Mpa。25wt%PLGA-PEG-PLGA水凝胶在温度低于31°C时呈液态,高于31°C时为固态凝胶。rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA具有双相释药特性,在初期呈爆发式释放,第1天,可释放rhBMP-2总量的26.3%,后期呈缓慢释放,28天时累积释放量为79.4%。该复合材料的理化性能与松质骨匹配,且能较好地满足骨修复过程对BMP-2的要求。2、将各组材料与BMSCs共培养1天后,rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组BMSCs的黏附数量和铺展面积大于rhBMP-2/HA组、PLGA-PEG-PLGA/HA组及HA组。第1天和第2天时,各材料组与纯细胞组的OD值和细胞增殖率无统计学差异,第3天时,rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组和rhBMP-2/HA组的OD值和细胞增殖率与其他两组存在统计学差异(p<0.05)。培养7天,rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组的活细胞数量最多。这些结果表明材料无明显细胞毒性。第7天时,各组ALP染色程度及活性无差异,rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组ALP染色程度及活性、茜素红染色程度及钙含量分别于第14和21天时高于其他组,且与PLGA-PEG-PLGA/HA组、HA组差异存在统计学意义(p<0.05)。第3天、7天及14天时,rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组ALP m RNA、Run X-2 m RNA的表达量均显著高于其他组,差异具有统计学意义(p<0.05)。第7天和14天,rhBMP-2/PLGA-PEG-PLGA/HA组OCN m RNA

关键词：骨缺损骨修复羟基磷灰石水凝胶骨形态发生蛋白复合材料

双离子释放3D打印多孔支架的构建及其修复椎板缺损的相关研究

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双离子释放3D打印多孔支架的构建及其修复椎板缺损的相关研究

作者：谭逸轩中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

研究目的当今中国人口基数大,且人口老龄化严重。因腰椎管狭窄、黄韧带肥厚、椎体严重骨折、椎管内肿瘤以及腰椎滑脱等疾病都可以引起脊髓压迫。此时往往需要手术干预来行椎管减压治疗。椎板切除术可以很好地解除脊髓压迫、扩大椎管容... 详细信息

研究目的当今中国人口基数大,且人口老龄化严重。因腰椎管狭窄、黄韧带肥厚、椎体严重骨折、椎管内肿瘤以及腰椎滑脱等疾病都可以引起脊髓压迫。此时往往需要手术干预来行椎管减压治疗。椎板切除术可以很好地解除脊髓压迫、扩大椎管容积以及有效缓解患者症状,因此该技术在临床被广泛运用。然而,部分患者术后会产生一些并发症,如腰椎手术失败综合征（failed back surgery syndrome,FBSS）等。人工椎板（artificial lamina）,可重建椎管后部结构,维持脊柱稳定,同时可起到机械屏障的作用,减少硬膜外瘢痕的形成。因此人工椎板已成为外科学领域的一个热门话题。骨组织工程学（bone tissue engineering）是一门迅速发展的学科,它为人工椎板的构建提供了新的可能。生物材料支架除了具备可重建椎管后部结构、维持脊柱稳定和减少硬膜外纤维瘢痕形成的优势外,还可增加相应的修饰因子以促进成骨,最终达到完全修复骨组织缺损的目的。修饰因子中,如镁（magnesium）是人体内的重要元素,能调节骨组织代谢,影响骨组织中矿物形成和结晶过程;如锶（strontium）不仅具备促进成骨的作用,同时具有促进血管新生的作用。因此本研究设想可否设计一种复合人工椎板材料,通过合理的镁离子和锶离子释放,从而提供更好的骨诱导活性和促进组织血管生成活性。同时,在生物相容性的设计上也要满足骨组织工程材料的一般要求。方法与结果第一部分:负载磷酸锶矿化丝素蛋白水凝胶的3D打印掺镁PCL支架的制备及表征研究方法:将碱性磷酸酶（ALP）作为催化剂,将镁粉（Mg）、聚己内酯（PCL）、丝素蛋白、氯化锶六水合物（Sr Cl2·6H2O）和三磷酸腺苷二钠盐（Na2ATP）等作为原材料,合成新型复合支架。采用扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶红外光谱仪（FTIR）、降解实验、离子释放实验、接触角实验、材料力学实验对复合支架的理化性质进行表征分析。结果:通过三个步骤,合成了我们研制的新型复合支架---负载磷酸锶矿化丝素蛋白水凝胶的3D打印掺镁PCL（SrP@SilMA-Mg/PCL）支架。第一步,通过熔融沉积成型法（FDM）,将聚己内酯和镁粉制备成单纯PCL多孔支架和掺镁PCL多孔支架。第二步,通过对普通丝素蛋白进行甲基丙烯酰化改性,得到可光固化的甲基丙烯酰化丝素蛋白（SilMA）。然后通过将3D打印掺镁PCL多孔支架浸入SilMA溶液,紫外光照,浸入75%酒精后,使SilMA与支架进一步交联。第三步,将碱性磷酸酶、三磷酸腺苷、氯化锶六水合物混合在HEPEs缓冲液中,得到矿化体系。最后将支架放入矿化体系中反应,最终得到填充有磷酸锶矿化丝素蛋白水凝胶的掺镁3D打印PCL支架。光学显微镜下观察单纯PCL多孔支架和掺镁PCL多孔支架,支架中间都有大致均匀的孔,且掺镁PCL多孔支架的表面有许多点状凸起。光学显微镜下观察复合支架的水凝胶表面,可观察到有磷酸锶颗粒的形成。EDS证明水凝胶表面有少量的磷原子和锶原子,以及FTIR证实水凝胶表面含有磷酸根离子。降解实验证明复合支架在两个月时间里几乎不降解。离子释放实验证明在两个月的时间里,镁离子和锶离子均可以缓释,并且镁离子释放量由少到多,锶离子释放量由多到少。通过接触角实验证明加入水凝胶可以提升复合支架的亲水性能。通过相关的材料力学实验,证实单纯PCL多孔支架和掺镁PCL多孔支架均具有良好的生物力学强度。第二部分:负载磷酸锶矿化丝素蛋白水凝胶的3D打印掺镁PCL支架的体外生物学研究研究方法:首先通过活死染色实验、CCK-8实验研究SrP@SilMA-Mg/PCL支架对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的毒性和增殖的影响;通过活死染色实验、CCK-8实验、细胞划痕实验研究SrP@SilMA-Mg/PCL支架对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的毒性、增殖、迁移的影响;在成骨性能方面,通过碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红（ARS）染色、RT-qPCR等生物学方法来研究SrP@SilMA-Mg/PCL支架对BMSCs成骨分化的影响;通过成管实验、RT-qPCR等生物学方法来研究SrP@SilMA-Mg/PCL支架对HUVECs成血管分化的影响。结果:SrP@SilMA-Mg/PCL支架对于BMSCs无毒性,对BMSCs增殖和成骨分化功能有促进作用:通过活死染色实验证明SrP@SilMA-Mg/PCL支架对BMSCs无明显毒性;通过CCK-8实验验证SrP@SilMA-Mg/PCL支架对BMSCs有良好的促增殖作用;通过ALP染色实验、ARS染色实验和RT-qPCR证明SrP@SilMA-Mg/PCL支架有显著的促成骨活性以及可以上调相关成骨基因的表达。SrP@SilMA-Mg/PCL支架对HUVECs无明显毒性,

关键词：人工椎板聚己内酯镁锶生物矿化

免疫激活型近红外二区光敏嵌合外泌体用于肿瘤治疗的效应与机制研究

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免疫激活型近红外二区光敏嵌合外泌体用于肿瘤治疗的效应与机制研...

作者：杨钰龙中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

研究背景与目的癌症是一种严重威胁人类生命健康的疾病,因其高转移性和易复发性已经成为导致人类死亡最主要的原因之一。传统的癌症治疗方法往往对晚期癌症患者效果不佳,甚至会给患者带来剧大的痛苦,严重影响其生活质量。为了克服上述... 详细信息

研究背景与目的癌症是一种严重威胁人类生命健康的疾病,因其高转移性和易复发性已经成为导致人类死亡最主要的原因之一。传统的癌症治疗方法往往对晚期癌症患者效果不佳,甚至会给患者带来剧大的痛苦,严重影响其生活质量。为了克服上述传统癌症治疗方法的局限性,近年来发展了很多新兴的癌症治疗手段,如免疫治疗、光热治疗、基因治疗等。但单一疗法往往疗效有限,且存在不能有效清除原发肿瘤以及易出现复发和转移的问题。因此,利用纳米功能材料将多种癌症治疗方法联合起来的治疗策略越来越受到人们的广泛关注。其中,利用近红外材料实现光热治疗与免疫治疗相结合的光免疫治疗已经在癌症治疗方面取得了重大的进展。在可预见的未来,联合疗法将开启癌症治疗的新纪元,从而实现在提高肿瘤治疗效果的同时减少不良反应,改善晚期患者预后。光热治疗可以通过热消融直接杀伤和清除肿瘤,但是通常不能完全根除,也不能很好地预防复发和转移;免疫治疗虽然可以有效抑制癌症的复发和转移,但仍存在价格昂贵、普适性差以及对体积巨大的原发肿瘤疗效有限等缺点。光免疫疗法的提出恰好解决了这一困境,一方面可以通过光热治疗直接清除原发肿瘤,另一方面也可以通过免疫治疗抑制肿瘤的复发和转移。但是由于近红外材料本身的局限性,目前有关光免疫治疗的研究和成果主要集中在头颈部鳞状细胞癌等浅表肿瘤,而对肝癌、胰腺癌、胃癌等深部肿瘤却少有涉及。这主要是由于近红外一区材料虽然生物相容性好且生物毒性低,但是其组织穿透能力不足,有效距离通常小于1cm,故基于近红外一区材料的光敏剂药物不能应用于深部肿瘤的治疗。于是我们把目光投向了近红外二区材料,它充分克服了近红外一区材料组织穿透能力不足的缺点,有效距离甚至可以达到7cm,但是由于其通常水溶性差且没有靶向性的缘故,所以限制了在光免疫治疗中的应用。此外,光免疫治疗是一种特异性靶向治疗,如何寻找肿瘤表面特异性抗原作为靶点也是一大挑战。因此,我们希望能够构建一种基于近红外二区材料的光敏剂药物用于治疗深部肿瘤,从而扩展光免疫治疗的应用范围。首先,我们发现并验证了 PPTTQ-2T是一种具有良好光热转换性能的近红外二区材料,并采用构建人工脂质体包裹的方式解决了其水溶性问题。但是,由于脂质体通常不具有靶向性,于是我们想到了另一种广泛存在于生物体液中,同样具有双分子层结构的囊泡-外泌体。近年来,外泌体因其出色的生物相容性、优异的生物稳定性及低免疫原性已经在药物运输载体方面扮演着越来越重要的作用。尤为重要的是,外泌体还可以通过基因工程技术改造而具有细胞特异性靶向功能。如此一来,我们就可以通过融合包含PPTTQ-2T的脂质体和具有靶向性的外泌体,从而获得一种脂质体-外泌体嵌合囊泡来解决近红外二区材料的生物相容性和靶向性问题。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种恶性程度极高的肿瘤,特别是对于晚期患者,由于术后复发率和转移率高的缘故,近几十年来患者的长期生存率没有明显改善。在这种情况下,开发一种基于近红外二区材料的光敏剂药物用于HCC的光免疫治疗是一个很有前景的突破口。我们课题组前期对HCC的CAR-T治疗有较为深入的研究,已经发现并验证了 GPC3是其特异性肿瘤标志物。所以可以以GPC3为靶点,通过在外泌体表面表达抗GPC3抗体从而获得能够特异性靶向表达GPC3的HCC的外泌体。综上,本课题设计了一种依赖PPTTQ-2T并可以用于治疗表达GPC3的HCC的光敏剂药物:光敏嵌合外泌体(αGPC3-cExo)。然后分别通过体内外实验来验证光敏嵌合外泌体(αGPC3-cExo)用于HCC光免疫治疗的疗效并探索其分子机制,旨在为治疗临床上易复发和转移的肿瘤提供一种新的治疗策略。第一部分:光敏嵌合外泌体的构建及验证研究方法1、用相同功率1208nm近红外光照射不同浓度的PPTTQ-2T溶液,再用不同功率1208nm近红外光照射相同浓度的PPTTQ-2T溶液,检测材料的光热转换性能。2、反复用1208nm近红外光间歇性照射PPTTQ-2T溶液,检测材料的光热稳定性。3、在1208nm近红外光和PPTTQ-2T溶液之间设置不同厚度的琼脂糖阻隔,检测近红外光穿透组织后加热材料的能力。4、采用薄膜分散-滤膜挤出法制备包含PPTTQ-2T的脂质体。5、设计包含PDGFRSP-αGPC3 scFv-PDGFRTM序列的质粒,并采用慢病毒感染的方式改造外泌体的PDGFR分子,使其表面表达抗GPC3抗体。再通过超速离心法从转染的Lenti-X-293细胞中提取表达抗GPC3抗体的外泌体。对照组则使用包含天然PDGFR分子序列的质粒,其余相同。6、使用超声法融合包含PPTTQ-2T的脂质体和GPC3靶向外泌体。对照组用无GPC3靶向外泌体依同法制备。

关键词：光免疫治疗近红外二区肝细胞癌光敏嵌合外泌体免疫原性细胞死亡

细胞来源脱细胞基质延缓髌下脂肪垫干细胞复制性衰老实验研究

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细胞来源脱细胞基质延缓髌下脂肪垫干细胞复制性衰老实验研究

作者：牛大伟中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

一、背景及目的间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）是一类起源于中胚层的多能干细胞,因具有自我更新、多系分化和免疫调节等特性,受到来自组织工程和再生医学研究领域的广泛关注[1]。髌下脂肪垫来源MSCs（infrapatellar fat p... 详细信息

一、背景及目的间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）是一类起源于中胚层的多能干细胞,因具有自我更新、多系分化和免疫调节等特性,受到来自组织工程和再生医学研究领域的广泛关注[1]。髌下脂肪垫来源MSCs（infrapatellar fat pad-MSCs,IPFP-MSCs）因兼具良好增殖活力、免疫调节特性以及成软骨分化潜力,被定义是一种有益于关节软骨修复的组织特异性MSCs[2]。探索和开发基于IPFP-MSCs及其衍生物的软骨修复治疗策略,具有十分重要的临床价值和社会意义。MSCs走向规模化应用,首先需要获得足够数量和良好质量的种子细胞。然而,随着体外培养时间延长和传代次数增加,细胞难以摆脱最终走向复制性衰老（replicative senescence）的命运[3]。细胞衰老除作为一种高度保守的细胞生理程序外,还受到各种内、外源性因素刺激,例如癌基因激活、电离辐射、氧化应激等因素均会引发细胞过早衰老,致使细胞增殖、分化和免疫调节等行为受到影响[4]。尽管细胞进入衰老程序后始终处于增殖停滞状态,但自身代谢依然活跃,可分泌一系列促炎细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶等可溶性因子,亦称衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype,SASP）。SASP参与介导衰老细胞周围组织慢性炎症,加速邻近正常细胞进入衰老程序,最终形成恶性循环[5]。因此,探究延缓细胞复制性衰老的策略十分重要。生理条件下,MSCs所处生理性微环境又被称为干细胞生态位（niche）,对细胞稳态维持、增殖和分化等行为具有重要调节作用。然而在体外扩增条件下,由于细胞缺乏固有生态位的物理机械支持和生化信号引导,将加速MSCs衰老进程[6]。在本研究中,我们将目光聚焦于细胞来源脱细胞基质（cell-derived decellularized matrix,C-d ECM）,它是通过离体细胞分泌和沉积后,经脱细胞处理而获得复合生物成分,具有天然的纤维结构,且在生化组成方面与细胞具有良好生物相容性。据报道,C-d ECM能模拟细胞生长的天然生态位,具有支持细胞增殖、分化,参与抑制细胞炎症反应等特性[7]。然而,C-d ECM能否通过重塑细胞体外扩增微环境达到延缓IPFP-MSCs的复制性衰老进程,尚未完全证实。本研究的主要目的:（1）揭示常规体外培养模式下IPFP-MSCs细胞形态、群体倍增数、群体倍增时间以及细胞衰老相关标志物变化,探究IPFP-MSCs体外发生复制性衰老生物学特点,并确立细胞模型;（2）制备C-d ECM并对其形态、结构和主要成分进行表征;（3）探究C-d ECM对IPFP-MSCs细胞黏附、增殖、迁移、分化等细胞行为的影响,重点阐述C-d ECM对延缓细胞复制性衰老作用的影响;（4）分析C-d ECM对衰老细胞转录谱影响,对未来研究方向进行展望。二、研究方法（1）培养原代IPFP-MSCs,观察细胞生长状态、绘制细胞生长曲线;（2）利用流式细胞术鉴定IPFP-MSCs表面特异性抗原（CD73、CD90、CD105、CD-34、CD45和HLA-DR）;（3）利用成脂、成骨和成软骨诱导实验以及茜素红S染色、油红O染色和阿利新蓝染色鉴定IPFP-MSCs分化潜力;（4）观察IPFP-MSCs体外连续传代自P1至P10代细胞形态特征,测算群体倍增时间（CPDT）、群体倍增数（NCPD）变化趋势;（5）通过细胞衰老相关-β-半乳糖苷酶染色、蛋白免疫印迹实验、逆转录实时定量聚合酶链反应表征P3、P6和P9代IPFP-MSCs细胞衰老相关标志物,确定衰老细胞模型;（6）利用IPFP-MSCs体外沉积ECM,并通过化学法联合酶解法脱细胞制备C-d ECM;（7）通过相差显微镜、免疫荧光染色、扫描电镜表征C-d ECM主要结构及成分;（8）通过CCK-8实验检测C-d ECM对IPFP-MSCs增殖能力影响;（9）通过CFU-F实验检测C-d ECM对IPFP-MSCs集落形成能力影响;（10）通过Transwell实验检测C-d ECM对IPFP-MSCs细胞迁移能力影响;（11）通过细胞衰老相关-β-半乳糖苷酶染色、流式细胞术检测细胞周期、细胞活性氧水平检测C-d ECM对IPFP-MSCs衰老表型影响;（12）利用相对定量q PCR法比较C-d ECM对IPFP-MSCs端粒长度影响;（13）利用蛋白免疫印迹实验、逆转录实时定量聚合酶链反应检测C-d ECM对细胞衰老相关标志物表达影响;（14）利用成脂、成骨和成软骨诱导实验以及茜素红S染色、油红O染色、阿利新蓝和Ⅱ型胶原免疫组织

关键词：髌下脂肪垫间充质干细胞细胞来源脱细胞基质复制性衰老软骨修复细胞扩增

成纤维细胞活化蛋白靶向性CAR-T细胞来源的外泌体在宫腔粘连中的治疗作用研究

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成纤维细胞活化蛋白靶向性CAR-T细胞来源的外泌体在宫腔粘连中的...

作者：钱珂文中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

一、研究目的宫腔粘连（intrauterine adhesion,IUA）是一种以子宫内膜纤维化为主要病理特征的生殖系统疾病。临床上,宫腔操作可导致子宫内膜基底层受损,上皮细胞再生受阻,而纤维结缔组织增生,子宫腔或子宫颈因纤维粘连而部分或完全关闭... 详细信息

一、研究目的宫腔粘连（intrauterine adhesion,IUA）是一种以子宫内膜纤维化为主要病理特征的生殖系统疾病。临床上,宫腔操作可导致子宫内膜基底层受损,上皮细胞再生受阻,而纤维结缔组织增生,子宫腔或子宫颈因纤维粘连而部分或完全关闭,严重影响患者的生殖健康。目前,IUA手术治疗只能从物理层面消除粘连,复发率较高。为实现子宫内膜的功能性恢复,还需要探索IUA治疗新方法。在前期工作中,课题组利用自主构建的工程化免疫细胞组库在IUA小鼠模型体内进行筛选,确定成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activated protein,FAP）为潜在治疗靶点,并制备了能够同时以高亲和力结合人鼠FAP抗原的单克隆抗体C21D5。FAP是活化成纤维细胞的特异性标志物,基于单克隆抗体C21D5的sc Fv序列,能够构建FAP靶向性的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）,在对T细胞进行工程化后,得到FAP靶向性CAR-T（FAP-CAR-T）细胞。FAP-CAR-T细胞能够直接识别和结合靶细胞表面的FAP,杀伤靶细胞。此外,课题组在2019年发现并报道,CAR-T细胞来源的外泌体同样携带特异性CAR,并具备亲本CAR-T细胞类似的生物靶向性和细胞杀伤活性,并且,相比于CAR-T细胞,CAR外泌体作用更加温和,不会引发炎性细胞因子的释放。因此,FAP-CAR-T细胞来源的外泌体可能对FAP阳性成纤维细胞有靶向杀伤作用,能够用于子宫内膜纤维化的治疗。在本研究中,首先构建了FAP-CAR-T细胞,并对其体外靶细胞杀伤和体内抗纤维化作用进行了评估,然而,实验结果表明,FAP-CAR-T细胞治疗会引发小鼠体内细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome,CRS）,导致小鼠死亡。接着,制备了FAP-CAR-T细胞来源的外泌体（FAP-CAR-Exos）,探究FAP-CAR-Exos在体外对FAP阳性NIH 3T3成纤维细胞的杀伤活性,以及在IUA小鼠模型中对子宫内膜纤维化的治疗作用,为基于CAR的免疫靶向疗法在IUA及其他纤维化疾病中的治疗研究提供新的依据。二、研究方法***-CAR-T细胞构建基于C21D5单克隆抗体sc Fv序列,设计FAP-CAR基因序列,插入p MP71-EGFP逆转录病毒载体,构建FAP-CAR-p MP71-EGFP重组质粒;利用HEK 293T细胞进行逆转录病毒的包装,并浓缩病毒;利用免疫磁珠法分选小鼠脾脏CD4+T和CD8+T细胞,并调整细胞比例为1:1;利用逆转录病毒感染T细胞,制备FAP-CAR-T稳转细胞株。***-CAR-T细胞对靶细胞的体外杀伤、对IUA小鼠的体内治疗作用研究10 ng/m L TGF-β1刺激NIH 3T3成纤维细胞,将FAP-CAR-T细胞与FAP阳性NIH 3T3成纤维细胞共孵育;检测T细胞活化分子CD25、CD69的表达;Cr51释放法检测梯度效靶比下FAP-CAR-T细胞对FAP阳性NIH 3T3成纤维细胞的体外杀伤。机械损伤法构建IUA小鼠模型,经尾静脉注射FAP-CAR-T细胞,剂量为1×10～6个/只;记录48 h内小鼠体重变化和生存率;获取小鼠外周血,ELISA检测IL-2、IL-6水平;获取小鼠子宫组织,利用HE和Masson染色观察宫腔粘连和子宫内膜纤维化情况;流式细胞术检测子宫内膜组织FAP阳性细胞数量;利用IL-6抗体治疗CRS,经尾静脉同时注射FAP-CAR-T细胞和IL-6抗体,剂量分别为1×10～6个/只和10 mg/kg;记录48 h内小鼠体重变化和生存率;获取小鼠子宫组织,利用HE和Masson染色观察宫腔粘连和子宫内膜纤维化情况;流式细胞术检测小鼠子宫内膜组织FAP阳性细胞数量和外周血FAP-CAR-T细胞数量。***-CAR-Exos制备和鉴定扩大培养FAP-CAR-T细胞,采用超速离心法从培养上清中富集制备FAP-CAR-Exos;在透射电子显微镜下观察外泌体形态;利用纳米颗粒跟踪分析技术检测外泌体粒径大小和颗粒浓度;采用western blot鉴定外泌体标志物及FAP-CAR表达情况;利用竞争法ELISA鉴定FAP-CAR-Exos对FAP的靶向结合活性。***-CAR-Exos对靶细胞的体外杀伤、对IUA小鼠的体内治疗作用研究Cr51释放法检测梯度外泌体总蛋白浓度下,FAP-CAR-Exos对FAP阳性NIH 3T3成纤维细胞的体外杀伤情况。机械损伤法构建IUA小鼠模型,将小鼠分为四组,高剂量治疗组于IUA造模后第7天开始,高剂量预防组于IUA造模当天开始,分别每间隔一天经尾静脉注射150mg/kg FA

关键词：宫腔粘连纤维化嵌合抗原受体T细胞成纤维细胞活化蛋白外泌体

环状RNA与m6A修饰调控恶性肿瘤作用研究进展

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中国普通外科杂志 2024年第2期33卷 273-283页

作者：王寅格李丹秀张文尧杨桃靳海峰河北工程大学临床医学院河北邯郸056009 中国人民解放军联勤保障部队第九八〇医院消化内科河北石家庄050081 中国人民解放军第四军医大学西京消化病医院/国家消化系统疾病临床医学研究中心和消化系肿瘤整合防治全国重点实验室陕西西安710032 贵州中医药大学第一附属医院肛肠科贵州贵阳550001

N6-甲基腺嘌呤(m6A)是真核生物RNA中最常见的表观遗传修饰,由甲基转移酶、去甲基化酶和阅读蛋白共同调控实现生物体内动态平衡及甲基化的可逆变化,影响RNA的剪接、加工、定位、转运、翻译和降解等过程,从而调控肿瘤的进展。环状RNA(circ... 详细信息

N6-甲基腺嘌呤(m6A)是真核生物RNA中最常见的表观遗传修饰,由甲基转移酶、去甲基化酶和阅读蛋白共同调控实现生物体内动态平衡及甲基化的可逆变化,影响RNA的剪接、加工、定位、转运、翻译和降解等过程,从而调控肿瘤的进展。环状RNA(circRNA)作为一种新型多功能非编码RNA,具有结构稳定、进化保守、高度丰富、组织特异性等特征,同时它可通过充当microRNA(miRNA)分子海绵、结合蛋白质、翻译蛋白和调控基因转录和剪接等方式参与调节多种生理病理活动,有望为肿瘤早期诊断和治疗提供新的分子标志物及潜在药物靶点。大量研究表明,m6A与circRNA可分别调控癌基因表达,且两者之间存在相互调节作用,m6A修饰可调节circRNA生物发生、核输出、降解、翻译和先天免疫,circRNA也可通过miRNA分子海绵或结合m6A修饰酶等机制调控m6A修饰,共同参与肿瘤细胞的增殖、迁移侵袭、干性、耐药性和免疫微环境等过程,这将有助于发现更多肿瘤研究的调节机制和治疗靶点。然而,鉴于m6A修饰和circRNA生物学的复杂性,许多研究仍有待阐明,如m6A检测技术尚不精确、m6A修饰的circRNA数据库仍为空缺、circRNA高效生产方法的开发和递送系统优化仍处于初级阶段等。因此,m6A修饰和circRNA相互作用网络尚需更深入研究。本文综述了circRNA的特征、形成机制及生物学功能,并综合阐述了m6A甲基化修饰基本概念和研究现状,总结分析m6A修饰和circRNA间的相互作用,及其对恶性肿瘤发生发展的影响,对两者临床应用价值和应用前景进行讨论,以期为肿瘤早期诊断、精准诊疗、预后判断与药物研发提供新思路。

关键词： RNA,环状甲基化 N6-甲基腺嘌呤肿瘤综述

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环肽cGY-8对小鼠急性缺氧脑损伤的保护作用及转录组学分析

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空军军医大学学报 2024年

作者：马智慧李雪雁张梅孟盼盼李亮唐汉琴轩莹莹杨玉田陈克明兰州理工大学生命科学与工程学院解放军联勤保障部队第九四〇医院基础医学实验室甘肃省干细胞与基因药物重点实验室

目的探讨环肽GYHHQYTG（cGY-8）对小鼠急性缺氧脑损伤的保护作用以及其可能的发生机制。方法将BALB/c小鼠随机分为对照组和不同剂量cGY-8给药组，观察各组在常压密闭缺氧条件下小鼠存活时间，筛选出最佳药物浓度。随后将BALB/c小鼠随... 详细信息

目的探讨环肽GYHHQYTG（cGY-8）对小鼠急性缺氧脑损伤的保护作用以及其可能的发生机制。方法将BALB/c小鼠随机分为对照组和不同剂量cGY-8给药组，观察各组在常压密闭缺氧条件下小鼠存活时间，筛选出最佳药物浓度。随后将BALB/c小鼠随机分为常氧组（Nor），模型组（M），乙酰唑胺组（ACZ），低、中、高剂量cGY-8给药组，每组6只，使用低压低氧处理后观察各组小鼠脑损伤情况。将15只BALB/c小鼠随机分为常氧组（Nor组）、缺氧组（Hy组）和缺氧给药组（cGY-8组），采用常压密闭缺氧处理后取全脑组织提取RNA进行转录组测序，筛选出差异表达基因（DEGs）后进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，并通过qRT-PCR验证测序数据的准确性。结果 cGY-8延长小鼠常压缺氧条件下的存活时间，且使低压低氧条件下小鼠脑组织含水量减少、氧化应激反应减轻。转录组学分析发现Hy组与Nor组相比共有678个DEGs（变化大于2倍；P＜0.05），而cGY-8处理可回调91个DEGs。GO富集分析91个DEGs主要聚类在信号转导、炎症反应、氧化还原酶活性等；KEGG富集分析可得91个DEGs主要富集在cGMP-PKG信号通路、钙离子信号通路等。结论 cGY-8可能通过调节能量代谢、减轻脑细胞Ca2+超载等途径保护小鼠缺氧脑损伤。本研究为预防及治疗高原脑水肿的药物开发提供了新思路。

关键词：环肽cGY-8 急性缺氧脑损伤 RNA-seq 小鼠