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家蚕热休克蛋白HSP90相互作用蛋白的筛选与鉴定

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中国农业科学 2022年第6期55卷 1253-1262页

作者：龙艳碧吴云飞张倩陈鹏潘敏慧西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室西南大学农业农村部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室

【目的】HSP90 是热休克蛋白家族的成员之一，在昆虫的抗逆性和变态发育中发挥重要作用，已有研究表明 HSP90能够促进家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)的增殖，但作用机制尚不清楚。本研究通过鉴定 BmHSP90... 详细信息

【目的】HSP90 是热休克蛋白家族的成员之一，在昆虫的抗逆性和变态发育中发挥重要作用，已有研究表明 HSP90能够促进家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)的增殖，但作用机制尚不清楚。本研究通过鉴定 BmHSP90 的相互作用蛋白，为其促进 BmNPV 增殖的作用机制解析提供参考。【方法】构建连接在 pIZ/V5-His 的BmHSP90HA真核过表达载体，在家蚕 BmN-SWU1 细胞中转染 48 h 后，感染 BmNPV 继续培养 48 h 后收集蛋白，保留总蛋白后将这些蛋白均分两管，进行免疫共沉淀，分别用抗 HA 抗体和 IgG 抗体钓取相互作用蛋白，对蛋白胶进行硝酸银染色后，获取差异条带并做质谱分析，将质谱结果与信息分析结合进行候选互作蛋白筛选，并克隆鉴定互作蛋白。通过免疫荧光验证 HSP90 与互作蛋白的共定位情况，并进一步采用免疫共沉淀试验确定其是否存在相互作用关系。【结果】硝酸银染色结果显示，试验组与对照组在 90、70 和 60 kD 附近处存在差异条带，并验证了 90 kD 处的差异条带为诱饵蛋白；将另外两条差异带进行质谱分析，共鉴定到 7 个候选相互作用蛋白，通过分析选择其中两个候选蛋白作后续研究，分别为Tubulin-specific chaperone E(Tbce)和 Golgin subfamily A member 5(Golga5)。BmTbce 的最大开放阅读框长度为 1 728bp，编码 576 个氨基酸，BmGolga5 的最大开放阅读框长度为 1 854 bp，编码 618 个氨基酸；同源比对和系统进化树显示 BmTbce的微管结合结构域(cytoskeleton-associated protein-glycine-rich,CAP-Gly)位于 N 端且在不同物种之间保守性较高，BmGolga5 的跨膜区(transmembrane domain,TMD)位于 C 端，也较为保守；荧光共定位显示 BmHSP90 与 BmTbce 和 BmGolga5在细胞质中发生共定位，并进一步通过免疫共沉淀证明 BmHSP90HA和 BmTbceFlag、BmHSP90HA和 BmGolga5Flag具有相互作用关系。【结论】经过筛选与鉴定，在 BmNPV 感染家蚕细胞的过程中，与家蚕热休克蛋白 HSP90 发生相互作用的蛋白为 BmTbce 和BmGolga5。

关键词：家蚕家蚕核型多角体病毒 HSP90 Tbce Golga5

生长前期光照强度对甘薯叶片光合生理和结薯的影响

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作物学报 2024年第10期50卷 2575-2585页

作者：蒋杨影唐铭均张林茜吕长文唐道彬王季春西南大学农学与生物科技学院/薯类生物学与遗传育种重庆市重点实验室重庆400702 重庆市农业科学院蔬菜花卉研究所重庆401329

探明甘薯生长前期不同光照强度对叶片光合生理和结薯性的影响,为甘薯合理套作高位作物提供高产理论依据和实践对策。于2021年,以不同干率和叶型的甘薯品种S1(潮薯1号)、S2(广薯87)和S3(渝苏162)为主区,以L200[(200±50)μmol m^(-2)s^(-... 详细信息

探明甘薯生长前期不同光照强度对叶片光合生理和结薯性的影响,为甘薯合理套作高位作物提供高产理论依据和实践对策。于2021年,以不同干率和叶型的甘薯品种S1(潮薯1号)、S2(广薯87)和S3(渝苏162)为主区,以L200[(200±50)μmol m^(-2)s^(-1)]、L500[(500±50)μmol m^(-2)s^(-1)]和L800[(800±50)μmol m^(-2)s^(-1)]不同光照强度为副区,开展双因素裂区试验,研究了叶片的光合特性、组织结构和植株结薯情况。结果表明,随着光照强度的减弱,甘薯叶片上表皮厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、叶片厚度、净光合速率(P_(n))、蒸腾速率(T_(r))、气孔导度(G_(s))、RUBP羧化酶活性、单株结薯数、单株薯重、块根干物质重逐渐降低,以高光照强度L800处理最优;而胞间CO_(2)浓度(C_(i))、叶绿素a含量、叶绿素b含量、类胡萝卜素含量、叶绿素a/b、块根干率,以低光照强度L200处理最优。通过因子分析综合评价,高干率S3品种在弱光环境下表现最好,低干率S1品种表现最差。甘薯叶片主要通过增加光合色素的含量与增加叶面积指数来提高对光能的捕获,协同叶片组织结构、光合生理及RUBP羧化酶活性的可塑性变化来适应弱光环境。

关键词：甘薯光照强度叶片组织结构光合特性产量

桑树1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(MnACO)启动子功能分析

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作物学报 2017年第6期43卷 839-848页

作者：余建刘长英赵爱春王传宏蔡雨翔余茂德西南大学生物技术学院/西南大学农业部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室重庆400715

1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)作为关键酶,能够催化1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)形成乙烯。为探究桑树MnACO基因在桑树生长发育和抵御外界胁迫中的功能,本研究构建了p MnACO::GUS的植物表达载体并转化拟南芥。采用GUS组织染色法鉴定转基... 详细信息

1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)作为关键酶,能够催化1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)形成乙烯。为探究桑树MnACO基因在桑树生长发育和抵御外界胁迫中的功能,本研究构建了p MnACO::GUS的植物表达载体并转化拟南芥。采用GUS组织染色法鉴定转基因拟南芥不同生长阶段及胁迫处理后的GUS活性。通过PCR克隆得到MnACO1和MnACO2启动子片段,它们分别为1518 bp和1429 bp,启动子区域有大量的TATA-box、CAAT-box和其他响应外界刺激的顺式作用元件。GUS活性分析显示MnACO启动子能驱动GUS在拟南芥中表达;MnACO1启动子能驱动GUS在拟南芥的根、叶片、花瓣、花药、花丝、柱头以及果荚中表达,且活性较MnACO2强;MnACO2启动子不能驱动GUS在果荚中无表达。转MnACO1和MnACO2植株经不同逆境处理后GUS表达活性不同,转MnACO1植株的GUS活性随处理延长时间而减弱,转MnACO2植株GUS活性随处理时间延长而增强。q RT-PCR检测2周苗龄的桑幼苗在经过胁迫处理后Ma ACO1和Ma ACO2的基因表达量,发现Ma ACO基因的表达模式与MnACO启动子GUS活性变化趋势一致。本研究结果表明,MnACO为诱导型启动子,MnACO1兼具组成型启动子特性,MnACO2兼具组织特异型启动子特性。MnACO1在转基因植株中对胁迫响应能力更强,预示着可将其用来调控改良桑树品种抗逆性靶基因;Ma ACO2可能与果实成熟有关,可将其启动子作为果实特异性启动子对桑椹品质进行合理改良。

关键词：桑树乙烯 ACO 启动子 GUS 功能分析

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椰糠施用量对土壤理化性状和甘薯产量的影响

作物学报 2023年第9期49卷 2517-2527页

作者：杨毅何志强林佳慧李洋陈飞吕长文唐道彬周全卢王季春西南大学农学与生物科技学院/薯类生物学与遗传育种重庆市重点实验室重庆400715 南充市农业科学院四川南充637000

研究不同施用量的椰糠对土壤理化性状和甘薯产量的影响,探索椰糠的施入量与土壤理化性状的相关关系,为农田土壤肥力的提高与保持以及鲜食型甘薯高产优质栽培提供理论依据和实际生产指导。本试验于2020年和2021年,采用随机区组试验设计,... 详细信息

研究不同施用量的椰糠对土壤理化性状和甘薯产量的影响,探索椰糠的施入量与土壤理化性状的相关关系,为农田土壤肥力的提高与保持以及鲜食型甘薯高产优质栽培提供理论依据和实际生产指导。本试验于2020年和2021年,采用随机区组试验设计,研究了椰糠(干重)施用量0、20,250、40,500和60,750 kg hm^(–2)共4个处理对土壤及甘薯的影响。结果表明,随着椰糠施用量的增加,土壤容重逐渐降低,而土壤孔隙度、土壤质量含水量、土壤有机质含量和土壤速效氮、磷、钾养分含量逐渐增加,其中土壤速效钾含量增加最多,碱解氮次之,速效磷最少;根际土壤细菌数量、真菌数量、放线菌数量都随椰糠施用量的增加而增加。增施椰糠能提高甘薯块根的单株结薯数,增加200~400 g、100~200 g和50~100 g块根的数量,提高甘薯的商品薯率;甘薯块根产量随椰糠施用量增加先增后减,以椰糠40,500 kg hm^(–2)施用量最高;甘薯块根淀粉率随椰糠施用量的增加而递减。施加椰糠能有效的改善土壤结构和培肥地力,有利于促进甘薯结薯和大薯的形成,提高块根产量和增加商品薯率。

关键词：甘薯椰糠土壤理化性状产量品质

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杆状病毒LEF-11蛋白自身相互作用关键区域的鉴定

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中国农业科学 2017年第20期50卷 4028-4035页

作者：蒋亚明董战旗陈婷婷胡楠董非凡黄亮唐良彤潘敏慧西南大学农业部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室重庆农业机械化学校

【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)是蚕业上最常见且危害最为严重的病原微生物之一,其晚期表达因子(late expression factor,lef)LEF-11对病毒的增殖具有重要作用,相关研究证明LEF-11蛋白能够发生... 详细信息

【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)是蚕业上最常见且危害最为严重的病原微生物之一,其晚期表达因子(late expression factor,lef)LEF-11对病毒的增殖具有重要作用,相关研究证明LEF-11蛋白能够发生自身相互作用形成寡聚体,本研究通过逐步截短探究LEF-11蛋白自身相互作用的关键区域。【方法】利用双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation)技术和荧光定位(fluorescent co-location)技术,首先根据Bm NVP lef-11及各个截短片段序列和荧光蛋白序列设计引物,通过PCR技术扩增回收得到所有片段以及荧光标签片段,并且通过限制性内切酶处理回收后,将荧光标签片段分别连接到昆虫细胞表达载体p IZ/V5-His上,构建p IZ-Ds Red和p IZ-EGFP质粒,然后用相同方法构建LEF-11全长和逐步截短的LEF-11红色荧光融合蛋白载体,分别与p IZ-LEF11-GFP共同转染到家蚕Bm N-SWU1细胞中,更换普通培养基48 h后固定细胞并制片,最后在荧光共聚焦显微镜下观察荧光融合蛋白表达及定位情况,鉴定LEF-11蛋白自身相互作用的关键区域;荧光双分子互补试验相关载体的构建步骤与荧光融合表达载体构建方法一致,转染处理及荧光观察方法也相同。【结果】杆状病毒LEF-11蛋白2—61和62—112端均能与LEF-11蛋白全长发生相互作用,分别共定位于细胞质和细胞核;逐步截短过程中,LEF-11蛋白N-端2—61、12—61、22—61、32—61、42—61和2—51均能与LEF-11蛋白全长共同定位于细胞质中,但其52—61、2—41未发生共定位;C-端截短片段能够与LEF-11蛋白全长发生共定位的有62—112、72—112、82—112、72—101和72—91,但92—112和72—81区域未发现共定位现象;双分子荧光互补试验结果验证LEF-11蛋白N-端片段与LEF-11蛋白全长相互作用的有2—61、12—61、22—61、32—61、42—61、2—51,而2—41、52—61截短突变体则不能,与N-端片段荧光共定位结果保持一致。【结论】鉴定到了杆状病毒LEF-11蛋白的42-51和82-91区域为其自身相互作用关键区域,可用于LEF-11相关功能研究。

关键词：家蚕 BmNPV LEF-11 双分子荧光互补自身相互作用

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家蚕安全转基因技术研究现状与展望

中国农业科学 2018年第2期51卷 363-373页

作者：龙定沛郝占章向仲怀赵爱春西南大学蚕学与系统生物学研究所/家蚕基因组生物学国家重点实验室/农业部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室

转基因技术是实现基因功能研究和生物遗传改良的重要工具。转基因生物安全问题主要包括转基因操作技术安全与转基因产品安全这两个方面。近年来业内对转基因生物的安全性研究主要集中于转基因农作物、水生动物和家禽、家畜等大型动物在... 详细信息

转基因技术是实现基因功能研究和生物遗传改良的重要工具。转基因生物安全问题主要包括转基因操作技术安全与转基因产品安全这两个方面。近年来业内对转基因生物的安全性研究主要集中于转基因农作物、水生动物和家禽、家畜等大型动物在医药、农业和食品工业等领域的安全评估,而对于具有重要科研与经济价值的农业昆虫安全转基因技术研究的报道则较为有限,而且农业部至今未有转基因昆虫安全性评估的先例。家蚕(Bombyx mori)是重要的鳞翅目模式昆虫和农业经济昆虫,家蚕安全转基因技术的深入研究对于促进基础遗传学发展和推动蚕丝产业发展均具有重要价值和意义。自2000年第一例转基因家蚕建立以来,转基因技术已广泛应用于家蚕基因功能鉴定的基础研究和品种改良的应用研究领域,但转基因家蚕的安全性问题却成了限制转基因家蚕实用化应用的主要瓶颈。因此,开展家蚕安全转基因技术体系研究对促进转基因家蚕安全性评估和产业化具有重要意义。本文系统地概述了基于条件基因打靶的家蚕安全转基因技术体系的建立与研究现状,讨论了家蚕安全转基因技术的发展趋势和应用前景,以期为转基因动物特别是农业转基因昆虫的安全转基因技术建立和完善提供参考。

关键词：家蚕生物安全安全转基因技术位点特异性重组标记基因删除基因定点修饰

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添食法制备改性蚕丝的研究进展

材料导报 2020年第23期34卷 23190-23198页

作者：蔡海华程岚李智陈李童晓玲代方银西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室西南大学生物技术学院农业部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室西南大学纺织服装学院重庆市生物质纤维材料与现代纺织工程技术研究中心

蚕丝是优异的天然蛋白质纤维,被广泛地应用在纺织、服装、生物医学等领域。蚕丝的形成需经历一个复杂的过程:家蚕首先在后部丝腺合成丝素蛋白,丝素蛋白液经过中部丝腺,与其合成分泌的丝胶液一起,通过腺腔内的压力进入到前部丝腺、吐丝管... 详细信息

蚕丝是优异的天然蛋白质纤维,被广泛地应用在纺织、服装、生物医学等领域。蚕丝的形成需经历一个复杂的过程:家蚕首先在后部丝腺合成丝素蛋白,丝素蛋白液经过中部丝腺,与其合成分泌的丝胶液一起,通过腺腔内的压力进入到前部丝腺、吐丝管,再通过榨丝区的肌肉活动对丝蛋白受到的剪切力进行调节,使其二级结构改变,最后在家蚕头部的牵伸摆动下,迅速固化,形成蚕丝。蚕丝虽然具有优异的性能,但仍存在抗菌性能及抗紫外性能差等缺陷,这在一定程度上限制了蚕丝的应用及蚕丝产业的进一步发展。通过对蚕丝进行改性并赋予其新的功能可拓展蚕丝的应用领域,促进蚕丝产业的发展。添食法具有简单、高效、环保及有利于规模化生产等优点,可在源头改性蚕丝的性能,是大量制备改性蚕丝的最有效方法。添食物质的选择至关重要。首先,添食物质不能有毒性;添食后,不能影响家蚕正常的生理及生命活动。其次,要注意添食物质颗粒的尺寸。此外,选择的添食物质需要有突出的性能。综合以上因素,纳米颗粒成为添食家蚕的首选物质。研究者们选择不同种类的纳米颗粒进行添食,取得了一定的成果。在保证蚕丝质地柔软光滑本质的同时,能大幅提升蚕丝的力学性能,且改善蚕丝的热稳定性能。目前,通过添食纳米颗粒制备的蚕丝的力学性能最高可提高111.25%。荧光蚕丝在生物医药工程、光学和光电子领域都具有巨大的应用价值。近年来,有多种方法已应用于制备荧光蚕丝,但大都不够环保且难以大规模持续生产。研究人员通过给五龄时期的家蚕添食具有荧光效应的染料或稀土荧光粉的方法可获得彩色荧光蚕丝。通过此方法所得的荧光蚕丝不仅具有良好的荧光性能,而且具有优异的荧光稳定性。但添食荧光材料会对家蚕的生理和生命活动造成一定影响,并使蚕丝的力学性能有所降低。为了制备具有不同功能的蚕丝,研究人员拓展了添食物质的种类,利用含氮物质、超细羽绒粉体、色素等进行添食,得到了质量突出的蚕茧及力学性能优异的改性蚕丝。本文以添食物质、添食后制备的改性蚕丝的结构及性能为重点,综述了近年来利用纳米物质、荧光物质及其他物质添食制备改性蚕丝的研究进展,客观分析了不同添食物质对蚕丝结构、力学性能及热性能等的影响,展望了添食法未来的研究及发展方向。

关键词：蚕丝改性添食法纳米颗粒荧光材料

家蚕Sox家族基因BmDichaete的克隆与表达分析

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昆虫学报 2017年第5期60卷 513-522页

作者：杨基贵彭丽娜刘太行吴云飞杜国玉张倩王炜潘敏慧西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室重庆400716 西南大学农业部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室重庆400716

【目的】Sox家族是一类转录调控因子,在多细胞动物的发育过程中起到了极其重要的作用。本研究旨在获得家蚕Bombyx mori Sox家族基因,并分析其在幼虫不同组织和发育阶段的表达模式及功能。【方法】采用cDNA末端快速扩增方法(rapid amplif... 详细信息

【目的】Sox家族是一类转录调控因子,在多细胞动物的发育过程中起到了极其重要的作用。本研究旨在获得家蚕Bombyx mori Sox家族基因,并分析其在幼虫不同组织和发育阶段的表达模式及功能。【方法】采用cDNA末端快速扩增方法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆家蚕Sox家族基因,并对其序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体,诱导原核表达并得到其蛋白的多克隆抗体,并以Western blot验证其蛋白在家蚕胚胎发育时期(产卵后24,48,72,96,120,144,168,192和216 h)和蚁蚕的表达特征。同时,使用半定量RT-PCR技术分析这一基因在家蚕整个发育过程以及5龄第3天幼虫不同组织(精巢、卵巢、神经节、头部、丝腺、脂肪体、马氏管、中肠、后肠、表皮、血液、气管)中的表达谱。【结果】克隆获得一个家蚕Sox家族基因,将其命名为BmDichaete(Gen Bank登录号:KY914554),其cDNA序列全长为1 541 bp,开放阅读框长741 bp,编码246个氨基酸,预测分子量大小为27.3 kD,等电点为9.89。同源序列比对和系统进化分析显示,BmDichaete具有Sox家族的典型HMG结构域,并与其他鳞翅目昆虫的Dichaete蛋白具有较高的同源性。对其表达模式分析发现,BmDichaete在家蚕整个发育时期都有表达,从胚胎发育后期到蛹前期持续高表达,在蛹后期及成虫期表达量有所下降,并且该基因在家蚕5龄第3天幼虫的卵巢、头部、丝腺及后肠组织中显著高表达。Western blot分析结果显示,BmDichaete在家蚕胚胎发育过程中持续而稳定地表达。【结论】家蚕BmDichaete具有典型HMG结构域,属于Sox家族成员。BmDichaete在家蚕胚胎发育的各个时期都发挥作用。本研究为进一步探索该基因在家蚕中的功能奠定了基础。

关键词：家蚕 BmDichaete 序列分析原核表达表达谱胚胎发育

家蚕超长链脂肪酸延长酶基因Bmelo424的克隆及功能分析

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生物工程学报 2019年第3期35卷 435-444页

作者：左伟东康宁李春林栾悦童晓玲代方银鲁成西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室农业农村部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室重庆400715 西南大学生物技术学院重庆400715

超长链脂肪酸延长酶家族基因影响生物体的多种生理功能。文中克隆了家蚕的一个该家族成员Bmelo424基因,其ORF为558 bp。该基因的蛋白序列预测有4个跨膜结构域,并有6个丝氨酸磷酸化位点、8个苏氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点,其亚... 详细信息

超长链脂肪酸延长酶家族基因影响生物体的多种生理功能。文中克隆了家蚕的一个该家族成员Bmelo424基因,其ORF为558 bp。该基因的蛋白序列预测有4个跨膜结构域,并有6个丝氨酸磷酸化位点、8个苏氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点,其亚细胞定位于内质网中,二级结构分析结果显示其α-螺旋和β-折叠股分别占26.7%和20%。荧光定量PCR结果显示Bmelo424基因在家蚕各组织均有表达,尤其在头部表达量最高。通过在酿酒酵母中异源表达Bmelo424基因的方法研究其对脂肪酸延伸的作用,GC-MS结果表明,携带pYES2-Bmelo424重组质粒的酿酒酵母的C16:1n-7脂肪酸含量有显著提高,而C16:0、C18:0和C18:1n-9的含量下降。温度胁迫结果显示,Bmelo424基因能够提高酿酒酵母的低温适应能力,但却降低其高温适应能力。这为探究家蚕Bmelo424基因的功能提供了参考。

关键词：家蚕超长链脂肪酸延长酶表达特征酿酒酵母温度胁迫