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甘蓝型油菜BnMAPK1的原核表达、亚细胞定位及酵母双杂交文库筛选

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作物学报 2020年第9期46卷 1312-1321页

作者：王珍姚梦楠张晓莉曲存民卢坤李加纳梁颖西南大学农学与生物科技学院/油菜工程研究中心/西南大学现代农业科学研究院重庆400715

植物的丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinases,MAPKs)级联是生长进程中多种信号跨膜传递的共同通路,它可以将外源刺激转入细胞内并引发细胞应答。目前C族MAPKs在甘蓝型油菜中的研究报道还很有限。本研究通过1个甘蓝型... 详细信息

植物的丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinases,MAPKs)级联是生长进程中多种信号跨膜传递的共同通路,它可以将外源刺激转入细胞内并引发细胞应答。目前C族MAPKs在甘蓝型油菜中的研究报道还很有限。本研究通过1个甘蓝型油菜的C族BnMAPK1基因的生物学进程聚类分析发现,BnMAPK1可能参与蛋白磷酸化、生长素介导的信号途径、逆境应答、细胞周期及转录等过程。BnMAPK1具有369个氨基酸残基,其相对分子质量约为42.5 kD,其可溶性蛋白可在原核系统中被诱导表达。BnMAPK1的亚细胞定位结果显示,BnMAPK1主要在细胞核内表达。Bait质粒pGBKT7-BnMAPK1在酵母双杂交系统中无毒性及自激活活性。为深入研究BnMAPK1蛋白参与的生物学进程,从甘蓝型油菜中油821苗期根、茎、叶中分别提取总RNA,分离得到mRNA,利用SMART技术合成并纯化双链cDNA后建立甘蓝型油菜混合cDNA文库。以共转化法筛选与BnMAPK1相互作用的蛋白,对其分析与鉴定显示,BnMAPK1在生长发育、非生物及生物逆境、转录、蛋白合成及代谢、翻译及翻译后修饰等过程中起作用。研究结果为MAPKs级联,尤其是C族MAPKs的研究提供了新的视野,为甘蓝型油菜抗性的机理研究及分子育种奠定了重要的理论依据。

关键词：甘蓝型油菜 BnMAPK1 原核表达亚细胞定位酵母双杂交

锌胁迫下甘蓝型油菜发芽期下胚轴长的全基因组关联分析

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作物学报 2021年第2期47卷 262-274页

作者：魏丽娟申树林黄小虎马国强王曦彤杨怡玲李洹东王书贤朱美晨唐章林卢坤李加纳曲存民西南大学农学与生物科技学院/油菜工程研究中心/西南大学现代农业科学研究院重庆400715

锌(Zn)是重要的微量元素之一,但土壤中过量的锌累积会影响植物的生长发育。本研究以不同遗传来源的140份甘蓝型油菜为材料,利用芸薹属60K SNP芯片对锌胁迫下(30 mg L-1)甘蓝型油菜发芽期相对下胚轴长(RHL)进行全基因组关联分析,筛选与... 详细信息

锌(Zn)是重要的微量元素之一,但土壤中过量的锌累积会影响植物的生长发育。本研究以不同遗传来源的140份甘蓝型油菜为材料,利用芸薹属60K SNP芯片对锌胁迫下(30 mg L-1)甘蓝型油菜发芽期相对下胚轴长(RHL)进行全基因组关联分析,筛选与甘蓝型油菜发芽期下胚轴长度显著关联的SNP位点及候选基因。群体结构分析表明,供试的140份甘蓝型油菜被分为2个亚群,其中89%材料间亲缘关系小于0.1,说明供试群体材料亲缘关系比较远。GWAS分析共检测到8个与RHL显著关联的SNP位点,单个SNP位点分别可解释22.0%~33.2%的表型变异。转录组分析获得的差异基因GO富集分析结果表明,上调表达基因主要参与氧化还原反应、离子转运、胁迫反应、防御反应和硫化合物转运。综合全基因组关联分析和转录组测序结果,共鉴定到19个与锌胁迫相关的候选基因,包括编码锌指蛋白家族成员(B-box型和ZFP1)、谷胱甘肽转移酶GSTU21、过氧化物酶家族蛋白、ABC和MFS转运蛋白及细胞壁相关激酶蛋白和一些重要的转录因子(BnaA07g27330D、BnaA02g30270D、BnaA07g27840D、BnaA07g31860D和BnaA07g28000),为深入解析油菜锌胁迫分子机制提供了参考。

关键词：甘蓝型油菜重金属锌胁迫全基因组关联分析发芽期

甘蓝型油菜开花相关基因的鉴定及进化与表达分析

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作物学报 2019年第8期45卷 1137-1145,I0002-I0056页

作者：王艳花谢玲杨博曹艳茹李加纳西南大学农学与生物科技学院/油菜工程研究中心重庆400715 西南大学现代农业科学研究院重庆400715

开花是开花植物繁衍后代的前提,控制开花时间对农作物获得高产稳产具有重要影响。然而,关于甘蓝型油菜基因组水平上开花相关基因的信息报道较少。本研究对甘蓝型油菜开花相关的基因进行了鉴定、特征分析、进化与表达模式分析。结果表明... 详细信息

开花是开花植物繁衍后代的前提,控制开花时间对农作物获得高产稳产具有重要影响。然而,关于甘蓝型油菜基因组水平上开花相关基因的信息报道较少。本研究对甘蓝型油菜开花相关的基因进行了鉴定、特征分析、进化与表达模式分析。结果表明,基因组水平上共鉴定到甘蓝型油菜1173个开花相关基因,这些基因分为9类,且不均匀地分布在染色体上;与白菜(AA,2n=20)和甘蓝(CC,2n=18)相比,甘蓝型油菜(AACC,2n=38)经过自然杂交和染色体加倍后,使开花相关基因的数目显著扩增;选择压力分析表明,糖代谢信号途径的基因比自发途径的开花相关基因受到的选择压力更大;仍有一些开花相关基因在拟南芥和油菜基因组内非常保守。甘蓝型油菜基因数目的扩增和功能分化导致其开花调控机制更加复杂,本研究为油菜开花途径提供更多的信息,也为阐明拟南芥和油菜开花基因的进化关系指明了方向。

关键词：甘蓝型油菜开花基因进化调控途径表达分析

整合GWAS和WGCNA筛选鉴定甘蓝型油菜生物产量候选基因

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作物学报 2021年第8期47卷 1491-1510页

作者：王艳花刘景森李加纳西南大学农学与生物科技学院/油菜工程研究中心重庆400715 西南大学现代农业科学研究院重庆400715

生物产量是作物获得高产的重要基础,对于甘蓝型油菜(Brassica napus L.)尤其重要。本研究利用588份甘蓝型油菜材料构成的自然群体2年生物产量表型数据的全基因组关联分析,再结合高生物产量材料‘CQ45’和低生物产量材料‘CQ46’的转录... 详细信息

生物产量是作物获得高产的重要基础,对于甘蓝型油菜(Brassica napus L.)尤其重要。本研究利用588份甘蓝型油菜材料构成的自然群体2年生物产量表型数据的全基因组关联分析,再结合高生物产量材料‘CQ45’和低生物产量材料‘CQ46’的转录组测序(RNA-seq)结果,整合了6个甘蓝型油菜材料6个部位(茎秆、叶片、花后30 d主轴与侧枝种子、花后30 d主轴与侧枝角果皮)的转录组数据构建的加权共表达网络分析(WGCNA),筛选出与生物产量相关的候选基因。通过相关分析发现,2年间甘蓝型油菜自然群体中生物产量对大多数产量相关性状都具有正向效应;自然群体2年生物产量分析的最佳模型均为K+PCA模型,共检测到9个显著位点(P<1/385691或P<0.05/385691);根据CQ45和CQ46共36组转录组数据,选择MAD值为前5%的基因共计5052个用于构建WGCNA,通过筛选合并共得到了15个模块,其中5个基因共表达模块分别与叶片、茎秆和花后30 d种子显著性相关;整合了WGCNA中关键模块的hub gene、GWAS分析得到的显著SNP位点和极端表型差异基因确定候选基因,它们的拟南芥同源基因为HCEF1、HOG1、SBPASE、ACT2,这些基因在光合作用的卡尔文循环、碳同化、物质积累等方面发挥重要作用。

关键词： GWAS WGCNA RNA Seq 甘蓝型油菜

甘蓝型油菜茎高QTL定位及株高相关位点整合

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作物学报 2019年第6期45卷 818-828页

作者：魏丽娟刘瑞影张莉陈志友杨鸿霍强李加纳西南大学农学与生物科技学院/油菜工程研究中心重庆400715 西南大学现代农业科学研究院重庆400715

甘蓝型油菜主茎高度(茎高)是株型的构成因子之一,研究其遗传机理对油菜株型改良具有重要的理论指导意义。目前对甘蓝型油菜茎高研究的报道较少。本研究以2个油菜茎高差异较大的亲本构建的重组自交系群体为材料,利用SNP高密度遗传图谱,2... 详细信息

甘蓝型油菜主茎高度(茎高)是株型的构成因子之一,研究其遗传机理对油菜株型改良具有重要的理论指导意义。目前对甘蓝型油菜茎高研究的报道较少。本研究以2个油菜茎高差异较大的亲本构建的重组自交系群体为材料,利用SNP高密度遗传图谱,2年共检测到11个茎高QTL,分布在A04、A06、C04、A08和C01染色体上,位点的表型贡献率为7.25%~19.61%。同时,以455份来源不同的甘蓝型油菜为材料,结合重测序产生的SNP标记,对茎高进行全基因组关联分析,2年共检测到5个SNP与茎高性状显著关联,分布在A08、A10、C02和C06染色体上。根据茎高定位结果,找到一些与激素途径(生长素、赤霉素和油菜素内酯)、光形态建成及植物生长发育相关的候选基因。在此基础上,结合国内外株高相关性状定位研究结果,将株高相关性状位点整合到甘蓝型油菜参考基因组上,发现4个以上群体都在A01、A03、A07、C03和C06染色体上找到株高定位的区间,2个群体在A10染色体上找到主花序长度共同定位的区间,在A02和C03染色体上找到一次分枝高度共同定位的区间。本研究中的茎高定位结果与整合后的株高相关性状QTL定位区间有部分重叠,位于A04、A06、A08、C04和C06染色体上。上述结果为甘蓝型油菜理想株型育种提供了理论依据。

关键词：甘蓝型油菜茎高 QTL定位 GWAS 位点整合

甘蓝型油菜BnMAPK2基因的克隆及功能分析

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作物学报 2022年第4期48卷 840-850页

作者：袁大双邓琬玉王珍彭茜张晓莉姚梦楠缪文杰朱冬鸣李加纳梁颖西南大学农学与生物科技学院/油菜工程研究中心重庆400715 西南大学现代农业科学研究院重庆400715

从甘蓝型油菜中分离克隆了BnMAPK2(BnaA01g21880D)基因,cDNA及其编码序列长度分别为1516 bp、1113 bp,编码370个氨基酸。生物信息学分析表明,BnMAPK2蛋白分子量为42,497.0 kD,等电点为6.36,蛋白不稳定系数38.74,为疏水性蛋白,具有MAPKs... 详细信息

从甘蓝型油菜中分离克隆了BnMAPK2(BnaA01g21880D)基因,cDNA及其编码序列长度分别为1516 bp、1113 bp,编码370个氨基酸。生物信息学分析表明,BnMAPK2蛋白分子量为42,497.0 kD,等电点为6.36,蛋白不稳定系数38.74,为疏水性蛋白,具有MAPKs蛋白特有的STKc_TEY_MAPK_plant(cd07858)保守结构域;蛋白二级结构中α螺旋所占比例最大,为44.05%,无信号肽;与拟南芥C族AtMAPK2的亲缘关系更近。核心元件预测结果显示,BnMAPK2-P含有响应水杨酸激素、热胁迫和光照等相关顺式作用元件,包括TCA-element、HSE、AAAC-motif和MYB结合位点等。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明,BnMAPK2在甘蓝型油菜中的各个组织器官中均有表达,受到茉莉酸甲酯、水杨酸、H_(2)O_(2)、损伤、高温和核盘菌的诱导。转基因异源表达BnMAPK2拟南芥株系的表型数据发现,与野生型相比,超量表达BnMAPK2使拟南芥植株的抽薹期提前,株高、主花序有效长度和角果数显著增加,由此推测BnMAPK2基因参与调节植物生长发育过程。本研究为深入探究BnMAPK2调控甘蓝型油菜生长发育过程的分子机制提供了参考资料和数据支撑。

关键词：甘蓝型油菜 BnMAPK2 表达模式过表达生长发育

甘蓝型油菜丝裂原活化蛋白激酶7基因(BnMAPK7)上游调控因子的鉴定

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作物学报 2021年第12期47卷 2379-2393页

作者：王珍张晓莉孟晓静姚梦楠缪文杰袁大双朱冬鸣曲存民卢坤李加纳梁颖西南大学农学与生物科技学院/油菜工程研究中心重庆400715 西南大学现代农业科学研究院重庆400715

丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)级联途径在植物的生长发育、分裂分化、细胞凋亡以及抗逆等多种生命过程中发挥着极其重要的作用。本研究从甘蓝型油菜中分离克隆了1个C族BnMAPK7基因的启动子,序列长度为16... 详细信息

丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)级联途径在植物的生长发育、分裂分化、细胞凋亡以及抗逆等多种生命过程中发挥着极其重要的作用。本研究从甘蓝型油菜中分离克隆了1个C族BnMAPK7基因的启动子,序列长度为1612 bp,命名为ProBnMAPK7。启动子分析工具PlantCARE预测结果表明,ProBnMAPK7含有大量响应光照、激素、防御和损伤等相关顺式作用元件,包括ACE、MRE、ABRE、TGACG-motif和TC-rich repeats等。同时,我们对拟南芥及甘蓝型油菜MAPK7基因的表达模式进行分析发现,MAPK7对生长发育以及生物和非生物胁迫应答过程具有重要调控意义。将ProBnMAPK7逐步分段连接至pCambia1305.1-GUS表达载体筛选启动子的核心区段,GUS组织化学染色分析显示该启动子的核心区段定位于-467~-239 bp(ProBnMAPK7-rPE)。将核心区段3拷贝串联重复后整合至Y1H gold基因组,并进行AbA背景测试,结果显示AbA浓度为500 ng mL^(-1)时,ProBnMAPK7-rPE×3在酵母细胞中的本底表达被完全抑制。利用酵母单杂交技术对BnMAPK7的上游调控因子进行文库筛选,获得3个候选因子BnNAD1B(NADH dehydrogenase 1B)、BnERD6(early response to dehydration 6)和BnPIG3(quinone oxidoreductase PIG3-like)。表明BnNAD1B、BnERD6及BnPIG3蛋白可能通过结合ProBnMAPK7-rPE区段调控BnMAPK7的转录,使得BnMAPK7参与光合作用以及逆境胁迫应答等生物学过程,为进一步阐明甘蓝型油菜BnMAPK7基因的功能奠定了基础,也为MAPKs级联的研究提供了新的思路。

关键词：甘蓝型油菜 ProBnMAPK7 启动子上游调控因子酵母单杂交

基于QTL定位和全基因组关联分析筛选甘蓝型油菜株高和一次有效分枝高度的候选基因

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作物学报 2020年第2期46卷 214-227页

作者：霍强杨鸿陈志友荐红举曲存民卢坤李加纳西南大学农学与生物科技学院/油菜工程研究中心重庆400715 西南大学现代农业科学研究院重庆400715

株高和一次有效分枝高度是与甘蓝型油菜结荚层厚度、收获指数紧密关联的重要农艺性状,有关株高的数量性状位点(quantitative trait locus,QTL)和全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)已有很多报道,但对一次有效分枝高... 详细信息

株高和一次有效分枝高度是与甘蓝型油菜结荚层厚度、收获指数紧密关联的重要农艺性状,有关株高的数量性状位点(quantitative trait locus,QTL)和全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)已有很多报道,但对一次有效分枝高度的QTL和GWAS定位以及候选基因筛选的研究报道较少。本研究利用已构建的高密度遗传连锁图对2016和2017年2个环境的186个株系组成的重组自交系群体株高和一次有效分枝高度及其最佳线性无偏预测(best linear unbiased prediction,BLUP)值进行QTL定位共检测到8个株高的QTL,分别位于A03、A04和A09染色体,单个QTL解释4.60%~13.29%的表型变异,其中位于A04染色体上的QTL(q-2017PH-A04-2和q-BLUP-PH-A04-2)在2017年和BLUP中均被检测到;检测到9个一次有效分枝高度QTL,分别位于A01、A02、A05、A09、C01和C05染色体上,单个QTL解释5.12%~19.10%的表型变异,其中q-2017BH-A09-1、q-BLUP-BH-A09-2和q-BLUP-BH-A09-3有重叠区段。同时,利用课题组前期完成的588份重测序自然群体进行全基因组关联分析,2年共检测到与株高显著关联的50个SNP位点和与一次有效分枝高度显著关联的12个SNP位点;根据SNP的物理位置,筛选出参与细胞增殖、细胞扩增、细胞周期和细胞壁活动的13个株高候选基因,以及参与赤霉素、亚精胺等合成代谢途径、核糖体组成和在光合、萌发等过程中有一定作用的一次分枝高度的11个候选基因,并利用荧光定量PCR技术验证候选基因在极端材料中的表达情况。本研究结果将为油菜株型改良及后续基因的功能研究提供理论依据。

关键词：甘蓝型油菜株高一次有效分枝高度基因定位候选基因筛选

用全基因组关联分析筛选甘蓝型油菜叶片叶绿素含量候选基因

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作物学报 2020年第10期46卷 1557-1565页

作者：荐红举霍强高玉敏李阳阳谢玲魏丽娟刘列钊卢坤李加纳西南大学农学与生物科技学院重庆400715 西南大学现代农业科学研究院重庆400715

提高油菜产量是保障国家粮油安全的重要举措。作物“源”“流”“库”理论表明,充足的光合产物(源)是高产的前提,而叶绿素是直接参与光合作用的物质,因此,选育高叶绿素含量的甘蓝型油菜是提高产量的重要途径。本课题组前期对全球收集的... 详细信息

提高油菜产量是保障国家粮油安全的重要举措。作物“源”“流”“库”理论表明,充足的光合产物(源)是高产的前提,而叶绿素是直接参与光合作用的物质,因此,选育高叶绿素含量的甘蓝型油菜是提高产量的重要途径。本课题组前期对全球收集的588份优异油菜种质资源进行5X重测序,获得385,692个高质量SNP标记。利用SPAD-502叶绿素仪于2018—2019连续2年测定苗期完全伸展的叶片叶绿素总量,结合获得的SNP标记进行全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS),筛选与叶绿素含量显著关联的SNP位点。结果表明,2018年鉴定到5个显著关联的SNP位点,贡献率为5.51%~7.89%,其中S6_3493805位点贡献率最大;2019年检测到46个SNP位点,贡献率为7.29%~10.34%,其中S13_11413088位点贡献率最大。将显著关联SNP位点上下游各500 kb区间内的基因与参考基因组比对,初步筛选出2022个油菜基因。将其基因序列在拟南芥基因组内进行BLAST比对,结合前人已报道的拟南芥同源基因功能,筛选到23个候选基因,其中5个属于叶绿素合成途径同源基因。本研究结果为后续油菜叶片叶绿素含量的遗传改良奠定了基础。

关键词：甘蓝型油菜叶绿素含量全基因组关联分析候选基因