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利用CRISPR/Cas9技术构建Pmepa1基因敲除的TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系

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生物技术通报 2024年第2期40卷 73-79页

作者：张宏民龙雯劳筱清陈雯妍商雪梅王洪连王丽粟宏伟沈宏萍沈宏春西南医科大学中西医结合学院泸州646000 西南医科大学附属中医医院泸州646000

【目的】利用CRISPR/Cas9技术构建Pmepa1基因敲除的TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系,并探讨Pmepa1敲除对TGF-β刺激下TCMK1细胞纤维化的影响,为研究Pmepa1在纤维化模型中的作用提供细胞模型。【方法】根据CRISPR/Cas9设计原则设计靶向小鼠Pme... 详细信息

【目的】利用CRISPR/Cas9技术构建Pmepa1基因敲除的TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系,并探讨Pmepa1敲除对TGF-β刺激下TCMK1细胞纤维化的影响,为研究Pmepa1在纤维化模型中的作用提供细胞模型。【方法】根据CRISPR/Cas9设计原则设计靶向小鼠Pmepa1基因组序列的sgRNA序列,构建pX333载体并转染进入TCMK1细胞,采用流式分选m Cherry阳性细胞、单克隆细胞扩增和测序鉴定Pmepa1敲除细胞,Western blot验证Pmepa1基因敲除情况。采用RT-PCR和Western blot分析Pmepa1敲除对TGF-β1诱导的R-Smad的活化和纤维化的影响。【结果】将sgRNA设计在Pmepa1第2个外显子,pX333-Pmepa1质粒转染TCMK1细胞48 h后,观察到mCherry荧光蛋白的表达,流式细胞分析转染效率约为17%,pX333-Pmepa1质粒转染阳性细胞经流式分选和单克隆扩增培养,得到19个细胞克隆,对Pmepa1基因位点上sgRNA靶点序列PCR扩增测序分析发现2个双等位基因移码突变细胞,Western blot验证Pmepa1蛋白表达缺失,表明Pmepa1基因敲除TCMK1细胞株构建成功,与未敲除细胞相比,Pmepa1敲除细胞在TGF-β1刺激下,p-Smad2和p-Smad3的表达显著升高,并且促进纤维化基因Fibronectin和Collagen I的表达。【结论】利用CRISPR/Cas9技术成功构建Pmepa1基因敲除TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系,为Pmepa1蛋白的功能研究建立了细胞模型以及Pmepa1在纤维化中的重要作用。

关键词： CRISPR/Cas9技术 Pmepa1 TCMK1细胞系纤维化

肾纤康通过调节Smad3介导的铁死亡缓解CKD小鼠肾纤维化

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中国病理生理杂志 2024年第6期40卷 1097-1104页

作者：倪玉芳张璐娜张琼王丽李健春西南医科大学附属中医医院中西医结合研究中心四川泸州646000 西南医科大学附属中医医院肾病科四川泸州646000

目的:观察肾纤康对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)引起的小鼠肾间质纤维化的缓解效果,并探讨其作用机制。方法:将小鼠随机分为假手术组、模型组、低剂量(150 mg·kg^(−1)·d^(−1))肾纤康组和高剂量(450 mg·kg^(... 详细信息

目的:观察肾纤康对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)引起的小鼠肾间质纤维化的缓解效果,并探讨其作用机制。方法:将小鼠随机分为假手术组、模型组、低剂量(150 mg·kg^(−1)·d^(−1))肾纤康组和高剂量(450 mg·kg^(−1)·d^(−1))肾纤康组,每组8只。除假手术组外,其余各组均通过单侧输尿管结扎法建立慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)模型。造模后,分别给予相应剂量的肾纤康,假手术组和模型组则灌胃等体积生理盐水,每天1次,连续7 d。实验结束后,收集小鼠肾脏组织进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色和Masson染色,观察肾脏组织损伤和纤维化程度;利用免疫组化和Western blot技术检测肾脏中纤维化、氧化应激及铁死亡相关蛋白水平的变化;蛋白质免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)评估肾纤康对转录激活因子3(activating transcription factor 3,ATF3)与Smad3相互作用的影响。结果:在未经治疗的UUO模型组中,小鼠肾脏出现了如肾小管明显扩张和胶原沉积等典型的病理变化,肾纤康干预组病理改变程度和纤维化明显减轻(P科学依据。

关键词：肾纤康慢性肾脏病铁死亡 Smad3蛋白转录激活因子3

不良生活方式与慢性肾脏疾病的孟德尔随机化研究

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现代预防医学 2024年第15期51卷 2808-2812+2823页

作者：李桦钟禹文罗浩粟宏伟西南医科大学中西医结合学院西南医科大学附属中医医院泌尿外科

目的利用孟德尔随机化（Mendelian randomization,MR）分析7种常见不良生活方式（吸烟、饮酒、糖消耗、添加盐的消耗、脂肪摄入、睡眠不足、工作中的久坐行为）与慢性肾脏疾病（chronic kidney disease,CKD）之间潜在的因果关系。方法... 详细信息

目的利用孟德尔随机化（Mendelian randomization,MR）分析7种常见不良生活方式（吸烟、饮酒、糖消耗、添加盐的消耗、脂肪摄入、睡眠不足、工作中的久坐行为）与慢性肾脏疾病（chronic kidney disease,CKD）之间潜在的因果关系。方法本研究通过全基因组关联分析（genome-wide association,GWAS）数据库获得工具变量，将逆方差加权（inverse-variance weighted,IVW）作为主要分析方法，MR-Egger回归和加权中位数（weighted-median,WM）作为补充方法分析暴露对结局的潜在因果关系，并对结果进行敏感性分析。结果 IVW分析结果显示脂肪摄入（OR:1.09,95%CI:1.01～1.19,P=0.027）与CKD有因果关系，敏感性分析结果未发现有显著的异质性（Q=18.00,P=0.12）或多效性（P=0.27）；吸烟、饮酒、糖消耗、添加盐的消耗、睡眠不足及工作中的久坐行为与慢性肾脏疾病IVW分析结果的P值均无统计学意义。结论脂肪摄入与CKD之间存在正相关风险关系，建议控制脂肪摄入量降低CKD发病风险。

关键词：孟德尔随机化不良生活方式慢性肾脏疾病全基因组关联分析脂肪摄入

基于转录组测序和WGCNA分析挖掘黄芪三七合剂治疗IRI急性肾损伤的关键基因

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中药药理与临床 2024年第2期40卷 40-47页

作者：李玉清王洪连胡琼丹樊均明王丽西南医科大学中西医结合学院泸州646000 西南医科大学附属中医医院中西医结合研究中心泸州646000 成都医学院成都610500

目的:基于高通量转录组测序以及加权基因共表达网络(Weighted gene co-expression network,WGCNA)分析挖掘黄芪三七合剂治疗肾缺血再灌注(IRI)急性肾损伤的关键靶基因。方法:将27只C57BL/6小鼠随机分成假手术对照组、模型对照组和黄芪... 详细信息

目的:基于高通量转录组测序以及加权基因共表达网络(Weighted gene co-expression network,WGCNA)分析挖掘黄芪三七合剂治疗肾缺血再灌注(IRI)急性肾损伤的关键靶基因。方法:将27只C57BL/6小鼠随机分成假手术对照组、模型对照组和黄芪三七合剂3.9 g/kg组,采用夹闭双侧肾蒂处肾动静脉血管45 min后恢复血供的方法建立急性肾损伤模型。术后给予黄芪三七合剂连续灌胃3d后检测肾功能、肾脏病理、炎症因子含量等综合评估黄芪三七合剂对IRI急性肾损伤的治疗效果。此外,每组各随机选取3个肾皮质样本,提取总RNA后进行高通量转录组测序。对测序获得的基因表达数据,使用R中的DESeq2包进行差异分析,WGCNA包执行加权基因共表达分析,确定与黄芪三七合剂治疗IRI急性肾损伤相关的共表达模块及关键基因。对挖掘出的关键核心基因进行荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)验证。同时,还对共表达模块中的核心基因进行基因本体(GO)和京都基因组百科全书注释系统(KOBAS)通路进行富集分析,描述关键核心基因的生物学功能,以揭示黄芪三七合剂治疗急性肾损伤的可能机制。结果:与模型对照组相比,黄芪三七合剂3.9 g/kg显著降低了IRI急性肾损伤小鼠血肌酐、尿素氮的含量和肾组织中白细胞介素-1β(Il1b)、Il6和肿瘤坏死因子-α(Tnfa)的mRNA表达(P<0.01),改善肾小管损伤评分。转录组测序差异分析显示,黄芪三七合剂3.9 g/kg组较模型对照组有259个基因发生显著变化,WGCNA分析共获得23个共表达模块,其中黑色共表达模块基因与黄芪三七合剂干预治疗IRI急性肾损伤(***)呈显著负相关(r=-0.78,P=7×10^(-4))。84个黑色共表达模块中的核心基因与黄芪三七合剂3.9 g/kg组较模型对照组的差异基因取交集得到关键核心基因β-1、4-半乳糖基转移酶5(B4galt5)。对黑色共表达模块核心基因进行蛋白质互作网络(PPI)分析得到关键核心蛋白26S蛋白酶体泛素受体(Adrm1)、泛素1(Ubqln1)、蛋白酶体26S亚基泛素受体(Psmd4)、26S蛋白酶体(Psmc2)。两种方法获得的5个关键核心基因的Real-time PCR验证结果与测序结果一致。对黑色共表达模块的核心基因进行GO分析和KOBAS通路富集分析发现关键核心靶点主要与蛋白糖基化修饰和蛋白酶体介导的代谢过程相关。结论:黄芪三七合剂可能通过靶向B4galt5、Adrm1、Ubqln1、Psmd4、Psmc2等关键核心靶点,参与糖基化修饰或蛋白酶体相关代谢途径治疗IRI急性肾损伤。

关键词：黄芪三七合剂急性肾损伤肾缺血再灌注转录组测序加权基因共表达网络分析

孟德尔随机化法探究新生儿高胆红素血症与抽动障碍的因果关联

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中国儿童保健杂志 2024年第10期 1116-1121页

作者：崔鹏源李贵平西南医科大学中西医结合学院西南医科大学附属中医医院新生儿科

目的采用两样本孟德尔随机化(TSMR)分析法，探讨新生儿高胆红素血症与抽动障碍(TD)的因果关联，以期为TD的机制研究提供线索。方法利用全基因组关联研究(GWAS)的数据，暴露因素为新生儿高胆红素血症，结局变量分别为TD、短暂性TD和发... 详细信息

目的采用两样本孟德尔随机化(TSMR)分析法，探讨新生儿高胆红素血症与抽动障碍(TD)的因果关联，以期为TD的机制研究提供线索。方法利用全基因组关联研究(GWAS)的数据，暴露因素为新生儿高胆红素血症，结局变量分别为TD、短暂性TD和发声性TD,通过MR分析，将逆方差加权(IVW)作为主要分析方法，MR-Egger回归和加权中位数(WM)补充方法分析二者之间的潜在关系，利用Cochran Q检验、MR-Egger回归截距进行敏感性分析。结果逆方差加权法分析显示，新生儿高胆红素血症与TD发病风险之间存在潜在因果关系(OR=1.053,95%CI:1.006～1.102,P=0.024),但与其他类型抽动无潜在因果关联。敏感性分析显示不存在多效性和异质性(P>0.05),结果可靠。结论新生儿高胆红素血症与TD之间存在潜在因果关系，但二者关联需要更大样本量进一步验证。

关键词：新生儿高胆红素血症抽动障碍孟德尔随机化

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基于PI3K/Akt信号通路探讨和枢消积方对肝纤维化大鼠的影响

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中成药 2024年第7期46卷 2400-2406页

作者：干佳岑彭孟云蒲清荣王晓栋汪静[] 西南医科大学中西医结合学院四川泸州646000 西南医科大学附属中医医院肝胆病科四川泸州646000 西南医科大学附属中医医院药剂科四川泸州646000

目的探究和枢消积方对肝纤维化大鼠的影响。方法40只大鼠随机分为模型组,和枢消积方低、中、高剂量组(1.625、3.25、6.5g/kg),秋水仙碱组(0.12mg/kg),每组8只,腹腔注射40%四氯化碳6周建立肝纤维化模型,同时给予相应药物干预6周;另取8只... 详细信息

目的探究和枢消积方对肝纤维化大鼠的影响。方法40只大鼠随机分为模型组,和枢消积方低、中、高剂量组(1.625、3.25、6.5g/kg),秋水仙碱组(0.12mg/kg),每组8只,腹腔注射40%四氯化碳6周建立肝纤维化模型,同时给予相应药物干预6周;另取8只大鼠作为正常组,予以生理盐水(1mL/100g)干预6周。给药结束后,检测肝功能及肝脏组织病理学变化,免疫组化法检测肝组织α-SMA蛋白表达,Westernblot法检测肝组织CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达。利用网络药理学预测和枢消积方防治肝纤维化相关靶点及信号通路,并通过ELISA、RT-qPCR、Westernblot法对相关靶点和信号通路进行验证。结果与正常组比较,模型组大鼠肝组织胶原沉积,汇管区炎症细胞浸润,血清ALT、AST、TBIL、ALP水平升高(P<0.01),肝组织α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白水平表达升高(P<0.05);与模型组比较,各给药组肝组织炎症及胶原沉积均改善,血清ALT、AST、TBIL、ALP水平降低(P<0.01),和枢消积方高剂量组和秋水仙碱组肝组织α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达降低(P<0.05)。网络药理学显示,和枢消积方防治肝纤维化核心靶点主要为Akt1、TP53、VEGFA、IL-1β,可通过调控PI3K/Akt、TNF-α、IL-17等通路发挥改善肝纤维化作用。与正常组比较,模型组大鼠肝组织PI3K、AktmRNA表达,TNF-α、IL-1β、IL-6水平和p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt1蛋白表达升高(P<0.01);与模型组比较,和枢消积方高剂量组和秋水仙碱组肝组织PI3K、AktmRNA表达降低(P<0.05,P<0.01),各给药组肝组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平和p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt1蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。结论和枢消积方可减轻肝纤维化大鼠肝脏炎症反应,从而发挥改善肝纤维化作用,其机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路相关。

关键词：和枢消积方肝纤维化 PI3K/Akt信号通路炎症和调理论

基于CT平扫下胫腓联合腓骨切迹分型及其临床意义

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解剖学报 2024年第1期55卷 82-87页

作者：尹诗琴杨思艺王锐涵游贵宣杨迎秋张磊西南医科大学体育学院四川泸州646000 西南医科大学中西医结合学院四川泸州646000 宜宾市中西医结合医院康复科四川宜宾644100 西南医科大学附属中医医院骨伤科四川泸州646000 西南医科大学附属中医医院骨伤疾病研究中心四川泸州646000

目的基于CT下胫腓联合腓骨切迹形态学分型及其临床意义。方法根据纳入排除标准分析在骨伤科行踝关节CT检查患者(男性123例,女性102例,均为汉族,年龄18~60岁)的图像资料,按形态学特点对下胫腓联合腓骨切迹进行分型,并测量下胫腓联合腓骨... 详细信息

目的基于CT下胫腓联合腓骨切迹形态学分型及其临床意义。方法根据纳入排除标准分析在骨伤科行踝关节CT检查患者(男性123例,女性102例,均为汉族,年龄18~60岁)的图像资料,按形态学特点对下胫腓联合腓骨切迹进行分型,并测量下胫腓联合腓骨切迹周围的8个距离。结果回顾分析了2013年12月~2022年12月225例患者结果,可将下胫腓联合腓骨切迹分为4型:C形(50.67%)、V形(26.67%)、平坦形(15.11%)、L形(7.56%)。平坦形的切迹前后部夹角(145.56±9.25)°最大(P<0.05),L形切迹前后部夹角(125.07±13.54)°最小(P<0.05);平坦形的切迹深度(3.11±0.83)mm最小(P<0.05),L形的切迹深度(4.47±1.11)mm最大(P<0.05)。左侧切迹后部长度(13.06±3.56)mm、胫腓前间隙(3.83±1.49)mm明显大于右侧(P<0.05);男性切迹后部长度(13.36±3.46)mm、切迹深度(3.93±1.10)mm及胫腓重叠垂直距离(9.10±2.55)mm明显大于女性(P<0.05)。结论通过测量下胫腓联合腓骨切迹相关数据并根据形态将其分为4种类型。平坦形下胫腓联合腓骨切迹更易出现慢性踝关节不稳,在解剖复位时更易发生腓骨前移;而L形和C形切迹的下胫腓联合在解剖复位时更易发生腓骨后移或旋转复位不良。

关键词：下胫腓联合腓骨切迹分型解剖学复位踝关节不稳计算机断层成像解剖学人

中医药联合化疗和靶向治疗晚期肠癌的研究进展

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中药药理与临床 2024年第3期40卷 119-123页

作者：田园杨忠明衡鑫沈程明段大跃西南医科大学中西医结合学院泸州646000 西南医科大学附属中医医院肿瘤科泸州646000 西南医科大学附属中医医院中医药表型组学研究中心泸州646000

结直肠癌作为临床常见的恶性肿瘤严重威胁着人类健康,目前大量研究证实中医药在协同化疗和靶向治疗上发挥着独特优势,中西医结合治疗已成为治疗晚期结直肠癌的新模式,为晚期结直肠癌治疗提供了更多的治疗途径和思路。文章通过检索相关... 详细信息

结直肠癌作为临床常见的恶性肿瘤严重威胁着人类健康,目前大量研究证实中医药在协同化疗和靶向治疗上发挥着独特优势,中西医结合治疗已成为治疗晚期结直肠癌的新模式,为晚期结直肠癌治疗提供了更多的治疗途径和思路。文章通过检索相关临床文献,对其进行探讨和分析,针对中医药对晚期结直肠癌化疗,联合靶向治疗的临床研究现状进行综合分析。文献研究发现中医药可有效提高晚期结直肠癌化疗联合靶向治疗患者的近期和远期临床疗效,并在提高机体免疫功能、减轻毒副作用等方面有着重要作用。

关键词：中医药肠癌化疗靶向治疗

柴黄清胰活血颗粒通过抑制NLRP3炎症小体活化减轻重症急性胰腺炎模型大鼠炎症损伤的机制研究

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中药新药与临床药理 2024年第1期35卷 17-25页

作者：杨佳李晓渝姜朝丽周鑫李志西南医科大学中西医结合学院四川泸州646000 西南医科大学附属中医医院脾胃病科四川泸州646000 西南医科大学附属中医医院泸州市中西医结合防治消化系统疾病重点实验室四川泸州646000

目的通过观察柴黄清胰活血颗粒对NLRP3炎症小体活化的调控作用,探讨其对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)模型大鼠胰腺组织的作用及机制。方法将64只SD大鼠随机分为假手术组、重症急性胰腺炎模型组、柴黄清胰活血颗粒组及... 详细信息

目的通过观察柴黄清胰活血颗粒对NLRP3炎症小体活化的调控作用,探讨其对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)模型大鼠胰腺组织的作用及机制。方法将64只SD大鼠随机分为假手术组、重症急性胰腺炎模型组、柴黄清胰活血颗粒组及MCC950(NLRP3抑制剂)组,各组再分为12 h和24 h两个亚组,每组8只。重症急性胰腺炎模型组、柴黄清胰活血颗粒组及MCC950组给予3.5%的牛磺胆酸钠(2 mL·kg^(-1))逆行胰胆管注射构建重症急性胰腺炎模型。MCC950组于模型制备完成后立即腹腔注射MCC950(1 mg·mL-1)。麻醉苏醒后,柴黄清胰活血颗粒组灌胃柴黄清胰活血颗粒溶液(0.35 g·mL-1),6 h一次。造模后12 h和24 h收集腹水、腹主动脉血及胰腺组织。采用全自动生化分析仪检测血清淀粉酶及脂肪酶活性;HE染色观察胰腺损伤情况;ELISA法检测血清IL-18、IL-1β的变化,IHC、qRT-PCR及Western Blot法检测NLRP3炎症小体活化相关基因及蛋白的表达。结果与重症急性胰腺炎组比较,柴黄清胰活血颗粒组及MCC950组的胰腺组织病理损伤明显减轻,病理评分明显降低(P<0.05),血清脂肪酶、淀粉酶、白细胞介素(IL)-18、IL-1β水平明显降低(P<0.05);与重症急性胰腺炎组比较,经柴黄清胰活血颗粒治疗或腹腔注射NLRP3抑制剂后,胰腺组织NLRP3、ASC、Caspase-1免疫组化阳性表达量及NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表达水平和NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论柴黄清胰活血颗粒可通过抑制NLRP3炎症小体活化,降低胰腺组织NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA及蛋白的表达,降低下游炎症因子IL-18、IL-1β的释放,从而减轻重症急性胰腺炎模型大鼠胰腺炎症损伤。

关键词：重症急性胰腺炎柴黄清胰活血颗粒 NLRP3炎症小体 NLRP3/Caspase-1信号通路大鼠