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野猪DHX36解旋酶酶学特性及保守性分析

中国生物化学与分子生物学报 2022年第12期38卷 1681-1693页

作者：徐思颖郭海磊奚绪光西北农林科技大学生命科学学院生物化学与分子生物学教研室陕西杨凌712100

DHX36解旋酶(DEAH-box helicase 36)在生物体内广泛存在,可作为外源核酸传感器广泛参与机体免疫反应,因其对G-四链体具有高度亲和性和解旋活性而备受关注。目前已报道了3个物种DHX36解旋酶的三维结构,但其酶学活性的保守性研究鲜见报道... 详细信息

DHX36解旋酶(DEAH-box helicase 36)在生物体内广泛存在,可作为外源核酸传感器广泛参与机体免疫反应,因其对G-四链体具有高度亲和性和解旋活性而备受关注。目前已报道了3个物种DHX36解旋酶的三维结构,但其酶学活性的保守性研究鲜见报道。本文以哺乳动物野猪(Sus scrofa)DHX36解旋酶(SsDHX36)为研究对象,通过生物化学与生物物理研究技术系统研究了其酶学性质,并对比其与低等无脊椎动物黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)DHX36解旋酶(DmDHX36)的活性,探究DHX36在物种间的功能保守性。本研究通过原核表达系统,分离纯化得到了纯度大于95%的SsDHX36解旋酶;利用荧光偏振和快速停留技术得到SsDHX36的最佳酶学反应条件,发现SsDHX36对G4 DNA具有平行构型的亲和选择性,对富含鸟嘌呤的ssDNA具有结合和解旋的底物偏好性;结合单分子荧光共振能量转移技术对SsDHX36和DmDHX36进行活性比较,发现两者与G4 DNA结合的构型选择性和对富含鸟嘌呤DNA的底物偏好性是保守的。但两者对不同序列长度ssDNA的亲和性差异显著,SsDHX36受序列长度影响较大且亲和力随序列长度的增加而增强,而DmDHX36则完全相反。本文克隆纯化了SsDHX36解旋酶并研究了其酶学活性,着重分析了SsDHX36和DmDHX36的功能保守性,为理解DHX36的保守功能机制,探究基于DHX36与富含鸟嘌呤序列互作的免疫反应酶学活性基础和靶向药物设计提供了理论与实验基础。

关键词：野猪DHX36解旋酶 G-四链体酶学活性底物偏好性功能保守性

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嗜热菌PIF1解旋酶的生化活性研究

中国生物化学与分子生物学报 2021年第9期37卷 1220-1232页

作者：李丹李海红戴阳雪刘娜女侯锡苗奚绪光西北农林科技大学生命科学学院生物化学与分子生物学教研室陕西杨凌712100

小整合频率1(petite integration frequency 1,PIF1)解旋酶广泛存在于生物体内,在核酸的代谢过程中发挥着重要作用。近年来,人们已经报道了多种PIF1解旋酶的生化活性及三维结构,但对极端环境下细菌的PIF1解旋酶的报道仍较少。本文利用... 详细信息

小整合频率1(petite integration frequency 1,PIF1)解旋酶广泛存在于生物体内,在核酸的代谢过程中发挥着重要作用。近年来,人们已经报道了多种PIF1解旋酶的生化活性及三维结构,但对极端环境下细菌的PIF1解旋酶的报道仍较少。本文利用多种生物化学与生物物理学技术,对黄石热脱硫弧菌PIF1(***1)解旋酶进行了多方面研究。通过原核表达纯化系统,获得了纯度90%以上,均一性好的***1蛋白。***1在溶液中为单体,分子量约为60 kD。***1具有很高的热稳定性,在65℃以下时,二级结构保持稳定,大于70℃时,二级结构才会发生改变。***1在体外最适解旋温度为45℃,并非黄石热脱硫弧菌生存的最适温度,预示着***1在体内发挥活性时,可能需要其他辅助因子的参与。***1的酶活力温度范围较宽,在20~55℃均具有解旋活性,在55℃能解旋预示了***1具有耐热特性。***1偏向于同含有单链的底物结合,但对单链长度有一定要求,其长度至少大于4 nt;***1也会较好地结合无单链尾链的G4结构,说明***1可能有专门结合G4结构的区域。***1能解开一系列带有5′-单链尾链的类似于复制中间体的底物,且对底物结构有一定的偏好性;***1也可以解开含有G4结构的底物,DNA-RNA杂交链、RNA-loop结构,预示着***1在生物体内有着多种生物学功能。***1解旋带有不同长度5′-单链尾链的双链底物时,尾链长度越长,解旋速率越快,预示着***1可能与***1一样有着较低的解旋持续性。本文将***1的生化活性与其它物种的PIF1解旋酶进行了比较,找出了其中的共性与差异,加深了人们对嗜热菌PIF1解旋酶的认识,为今后研究其它极端环境微生物的PIF1解旋酶提供了一些思路。

关键词：小整合频率1解旋酶热稳定性结合活性解旋活性底物偏好性

电化学活性微生物在微生物燃料电池阳极中的应用

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分析化学 2015年第1期43卷 155-163页

作者：张逸驰蒋昭泓刘颖西北农林科技大学生命科学学院

微生物燃料电池是一种利用电化学活性微生物催化降解有机物的同时产生电能的新型产能装置。阳极电化学活性微生物特征及催化活性是影响微生物燃料电池产电效率的关键因素之一。本文对应用于阳极上的电化学活性微生物的富集、来源、菌种... 详细信息

微生物燃料电池是一种利用电化学活性微生物催化降解有机物的同时产生电能的新型产能装置。阳极电化学活性微生物特征及催化活性是影响微生物燃料电池产电效率的关键因素之一。本文对应用于阳极上的电化学活性微生物的富集、来源、菌种的生理生化特征及产电能力等进行了综述。

关键词：微生物燃料电池电化学活性微生物异化铁还原菌阳极呼吸菌评述

分子连接性指数~mX^z与不饱和链烃沸点的定量关系研究

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有机化学 2003年第9期23卷 1039-1048页

作者：张玉林高锦明郭满才西北农林科技大学生命科学学院杨陵712100

提出了一个计算分子中成键原子点价δzi 的新方法 ,以δzi 为基础建构的新的分子连接性指数为mXz=∑ (δzi·δzj·δzk…… ) -0 .5,其中0 Xz,1Xz 的定义为 :0 Xz=∑ (δzi) -0 .5,1Xz=∑ (δzi·δzj) -0 .5,并研究了0 Xz,1Xz 与不饱... 详细信息

提出了一个计算分子中成键原子点价δzi 的新方法 ,以δzi 为基础建构的新的分子连接性指数为mXz=∑ (δzi·δzj·δzk…… ) -0 .5,其中0 Xz,1Xz 的定义为 :0 Xz=∑ (δzi) -0 .5,1Xz=∑ (δzi·δzj) -0 .5,并研究了0 Xz,1Xz 与不饱和链烃沸点的相关性 .结果表明 ,该拓扑指数具有良好的结构 -性质相关性 .以0 Xz,1Xz和碳原子数N为结构参数分别与 80个单烯烃、39个单炔烃、16 9个不饱和链烃 (包括烯烃、炔烃及烯炔 )的沸点进行关联所得到的三元回归方程为 :单烯烃 ,log(779 13-bp) =2 82 2 433-0 0 133346 0 Xz-0 0 6 383791Xz+ 0 0 1112 2 9N (R =0 99895 ,F =2 0 2 783 6 5 ,s =3 36 ) ;单炔烃 ,log(797 4 7-bp) =2 80 9912 -0 0 10 83740 Xz-0 0 86 45 40 1Xz+ 0 0 2 330 2 8N (R =0 99935 ,F =986 5 7 36 ,s =3 6 5 ) ;不饱和链烃 ,log(741 2 6 -bp) =2 7795 2 6 + 0 0 1943880 Xz-0 0 5 1915 81Xz-0 0 2 110 47N (R =0 9946 7,F =82 387 2 6 ,s =7 74) .应用这些经验公式可以预测不饱和链烃的沸点 .

关键词：分子连接性指数不饱和链烃沸点定量关系相关性分子结构有机化合物

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单活性结构域T7核酸酶Ⅰ的制备及性质研究

生物化学与生物物理进展 2010年第4期37卷 426-432页

作者：范三红单丽伟王保莉管楚枤郭蔼光西北农林科技大学生命科学学院杨凌712100 西北农林科技大学陕西省农业分子生物学重点实验室杨凌712100 New England Biolabs Inc. Ipswich 01938MA USA

T7核酸酶Ⅰ(T7EⅠ)是一种能特异识别并拆分重组中间体Holliday Junction(HJ)的多功能核酸酶,该酶不仅能特异识别和拆分HJ,而且能随机切刻双链DNA,特异识别并切割双链DNA中的切刻和单碱基错配位点.构建了两种原核表达载体用于表达MBP和Hi... 详细信息

T7核酸酶Ⅰ(T7EⅠ)是一种能特异识别并拆分重组中间体Holliday Junction(HJ)的多功能核酸酶,该酶不仅能特异识别和拆分HJ,而且能随机切刻双链DNA,特异识别并切割双链DNA中的切刻和单碱基错配位点.构建了两种原核表达载体用于表达MBP和His-tag融合的两种T7EⅠ突变体,MBP-T7EⅠ(E20K)和His6-T7EⅠ(E65K).每一种融合蛋白形成的同源二聚体不具有核酸酶活性,通过共表达或两种蛋白质共变性复性、双标签亲和纯化,最终获得具有单个活性结构域的T7EⅠ异源二聚体(T7EⅠ-SAD).以pUC(AT)和pUC19为底物测试T7EⅠ-SAD的HJ拆分活性、随机切刻活性和切刻位点切割活性,结果显示,T7EⅠ-SAD可特异识别并切刻HJ结构,但丧失了同时引入两个切刻位点的能力,其对pUC(AT)的特异切刻活力和对pUC19的随机切刻活力与野生酶相当.逐级变性梯度洗脱实验显示,T7EⅠ-SAD的稳定性与野生型酶接近,二聚体解离需要5.0～6.0mol/L尿素或1.75～2.0mol/L盐酸胍;凝胶阻滞实验表明T7EⅠ-SAD具备与HJ结构特异结合的能力.为具有细胞毒性蛋白的表达提供了一种新策略,同时提供了一种简便直观的蛋白质二聚体稳定性测试方法.

关键词： T7核酸酶Ⅰ 结构域交换单活性结构域二聚体稳定性催化特性

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一株Zn抗性菌株的筛选鉴定及吸附条件优化

环境科学学报 2010年第11期30卷 2189-2196页

作者：李慧芬林雁冰王娜娜郭军康韦革宏西北农林科技大学生命科学学院陕西省农业分子生物学重点实验室杨凌712100

采用浓度梯度法从铅锌尾矿区与污水灌溉区土壤中筛选了一株Zn抗性放线菌,并通过形态与培养特征、生理生化特性、细胞壁组分与16SrRNA基因序列分析对该菌株进行了鉴定.同时,综合运用单因素试验与正交试验法对该菌株吸附Zn2+的条件进行了... 详细信息

采用浓度梯度法从铅锌尾矿区与污水灌溉区土壤中筛选了一株Zn抗性放线菌,并通过形态与培养特征、生理生化特性、细胞壁组分与16SrRNA基因序列分析对该菌株进行了鉴定.同时,综合运用单因素试验与正交试验法对该菌株吸附Zn2+的条件进行了优化.结果表明,菌株CCNWHX72-14经鉴定为高加索链霉菌(Streptomyces ciscaucasicus),其对Zn2+的抗性达到845mg·L-1.锌胁迫生长曲线表明,该菌株在130mg·L-1Zn2+胁迫时生长良好,且最适培养时间为7d.各个单因素条件对该菌株吸附Zn2+的影响顺序为:接种量>初始Zn2+浓度>初始pH>转速>温度.该菌株吸附Zn2+的最佳条件为:初始Zn2+浓度为150mg·L-1,初始pH=5,接种量为1%,转速为60r·min-1,温度为28℃.菌株CCNWHX72-14在最佳条件下对Zn2+的吸附较具有良好的重复性与稳定性,最高吸附量可达51.05mg·g-1,该研究为进一步探讨链霉菌的Zn2+吸附机制及其在生物修复中的应用奠定了基础.

关键词：高加索链霉菌锌吸附单因素正交

根瘤菌-豆科植物共生体系在重金属污染环境修复中的地位、应用及潜力

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微生物学报 2010年第11期50卷 1421-1430页

作者：韦革宏马占强西北农林科技大学生命科学学院陕西省农业分子生物学重点实验室杨凌712100

土壤重金属污染严重影响了人类健康和生态系统稳定,已成为亟待解决的现实问题。在重金属污染地,氮素的极端不足是植被恢复主要限制因子之一。根瘤菌-豆科植物共生体系是固氮能力最强的生物固氮体系,在促进重金属污染地氮素循化和营养元... 详细信息

土壤重金属污染严重影响了人类健康和生态系统稳定,已成为亟待解决的现实问题。在重金属污染地,氮素的极端不足是植被恢复主要限制因子之一。根瘤菌-豆科植物共生体系是固氮能力最强的生物固氮体系,在促进重金属污染地氮素循化和营养元素积累中具有重要作用。本文阐述土壤重金属污染的修复方法及其特点,微生物抗重金属的机理及促植物生长和重金属积累的特性,根瘤菌-豆科植物共生体系在土壤重金属污染修复中的优越性,研究现状及应用潜力。提出应用"豆科植物-根瘤菌共生体系"修复重金属污染土壤的新思路和新任务。

关键词：根瘤菌豆科植物共生体系重金属生物修复

PBPm-MDCC ATPase活力检测体系的建立与优化

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生物工程学报 2021年

作者：马海云李康李海红刘娜女奚绪光杨彦涛西北农林科技大学生命科学学院

ATPase活力测定是分子生物学研究中的重要研究方法。利用荧光标记了的周质蛋白PBPm(A197C)结合Pi后构象发生改变引起荧光信号变化的特性检测ATP水解释放的Pi,从而研究ATPase活力的方法已被广泛认可。研究报道中该方法需要的两种主要蛋白... 详细信息

ATPase活力测定是分子生物学研究中的重要研究方法。利用荧光标记了的周质蛋白PBPm(A197C)结合Pi后构象发生改变引起荧光信号变化的特性检测ATP水解释放的Pi,从而研究ATPase活力的方法已被广泛认可。研究报道中该方法需要的两种主要蛋白PBPm和PNPase的表达和纯化相对繁琐,合理优化有助于提高该方法的实用性。合理设计含有可切除His-SUMO标签的PBPm原核表达载体和含有His亲和标签的PNPase原核表达载体,用大肠杆菌能够大量表达并高效纯化获得高活性的PBPm和PNPase蛋白;用荧光染料MDCC标记突变体PBPm蛋白做荧光检测分子,用PNPase蛋白及其底物做磷拖把(Pimop),成功构建ATPase活力检测体系,能够应用于ATPase活力实时检测。优化后的PBPm和PNPase蛋白的表达纯化及PBPm蛋白的标记纯化方法简单高效,构建的ATPase活力测定体系成功实用,为分子生物学研究提供了一种更实用的ATPase活力检测方法。

关键词： PBP PNPase 蛋白表达纯化荧光标记 ATPase 实时检测

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LIM蛋白KyoT在小鼠胚胎发育中的表达

生物化学与生物物理进展 2003年第1期30卷 95-98页

作者：李荣程轶梦陈蕾胡静孙强黄红艳王键韩骅第四军医大学医学遗传学与发育生物学教研室西安710032 西北农林科技大学生命科学院生物化学与分子生物学教研室杨凌712100 第四军医大学组织学与胚胎学教研室西安710032

IM结构域蛋白KyoT可与转录因子RBP J相互作用而修饰Notch信号途径 .以往发现KyoT在成年小鼠肺脏、肾脏和睾丸中有特异性表达 ,为进一步明确KyoT在小鼠胚胎阶段的表达 ,故分析了KyoT在小鼠不同胚胎阶段的表达水平变化和胚胎 17天时各组... 详细信息

IM结构域蛋白KyoT可与转录因子RBP J相互作用而修饰Notch信号途径 .以往发现KyoT在成年小鼠肺脏、肾脏和睾丸中有特异性表达 ,为进一步明确KyoT在小鼠胚胎阶段的表达 ,故分析了KyoT在小鼠不同胚胎阶段的表达水平变化和胚胎 17天时各组织的表达分布 .采用RNA印迹发现KyoT在小鼠胚胎的各阶段均表达 ,而且胚胎 17天时表达水平最高 .进一步RNA印迹和免疫组织化学检测发现 ,KyoTmRNA和蛋白质在胚胎17天小鼠的肺、肾以及肌肉中均有高水平的表达 .上述结果提示 ,KyoT在小鼠胚胎发育过程中有特异性表达 ,且在胚胎 17天时KyoT表达器官分布与成年小鼠相似 ,特异性定位于肺、肾和肌肉等脏器 .

关键词： LIM结构域蛋白 KyoT 小鼠胚胎发育表达