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松油烯-4-醇对粘虫几种代谢酶及酚氧化酶的影响

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中国农业科学 2008年第2期41卷 437-442页

作者：马志卿韩秀玲冯俊涛李广泽张兴陕西省生物农药工程技术研究中心/西北农林科技大学无公害农药研究服务中心陕西省生物农药工程技术研究中心/西北农林科技大学无公害农药研究服务中心陕西杨凌712100

【目的】探讨杀虫植物砂地柏Sabina vulgaris精油中主要杀虫成分松油烯-4-醇的作用机理。【方法】以点滴法处理粘虫5龄幼虫后,测定兴奋期、痉挛期、麻痹期及复苏期等4个中毒阶段试虫体内4种代谢酶及酚氧化酶(PPO)的活性。【结果】松油烯... 详细信息

【目的】探讨杀虫植物砂地柏Sabina vulgaris精油中主要杀虫成分松油烯-4-醇的作用机理。【方法】以点滴法处理粘虫5龄幼虫后,测定兴奋期、痉挛期、麻痹期及复苏期等4个中毒阶段试虫体内4种代谢酶及酚氧化酶(PPO)的活性。【结果】松油烯-4-醇仅在麻痹期对酸性磷酸酯酶(ACP)具有一定的抑制作用,而在其它时期均可明显激活ACP及碱性磷酸酯酶(AKP);对谷胱甘肽S转移酶(GSTs)则表现出先抑制后恢复的趋势;可显著抑制细胞色素P450O-脱甲基活性,各中毒阶段酶抑制率分别为26.27%、46.03%、80.24%和90.22%;离体和活体条件下,均可显著抑制PPO活性。【结论】松油烯-4-醇对粘虫代谢酶系细胞色素P450、GSTs及PPO的抑制与其毒杀活性有关,而中毒试虫的复苏可能与GSTs活性的恢复有关。该化合物可开发为新型农药或增效剂,在害虫抗性治理中具有潜在的应用价值。

关键词：松油烯-4-醇粘虫酚氧化酶代谢酶作用机理

丁香精油和丁香酚对苹果贮藏期病害及果实品质的影响

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农业工程学报 2006年第6期22卷 173-177页

作者：李鹏霞邵世达冯俊涛蒲占胥张兴西北农林科技大学无公害农药研究服务中心陕西712100

该文对丁香精油和丁香酚在离体和活体条件下对采后苹果的主要致腐菌苹果青霉、苹果灰霉、苹果炭疽、苹果轮纹、苹果褐腐和苹果腐心的抑制作用以及对贮藏期苹果品质的影响进行了研究。结果表明，在离体条件下，丁香精油和丁香酚对供试菌... 详细信息

该文对丁香精油和丁香酚在离体和活体条件下对采后苹果的主要致腐菌苹果青霉、苹果灰霉、苹果炭疽、苹果轮纹、苹果褐腐和苹果腐心的抑制作用以及对贮藏期苹果品质的影响进行了研究。结果表明，在离体条件下，丁香精油和丁香酚对供试菌种有显著的抑制作用，最低抑制浓度（MIC）范尉分别为0．15～0．30mg／（100mL）和0．15～0．35rag／（100mL），但不能完全抑制致腐菌在苹果果实卜的生长。丁香精油和丁香酚能够抑制采后苹果腐烂率、呼吸强度和褐变指数的上升，以及可溶性固性物含量、可滴定酸和硬度的下降，延缓采后苹果的生理衰老，有利于保持苹果的品质和风昧。加入CaCl2后，抑菌效果和保鲜效果优于单一的丁香精油和丁香酚处理。作为一种可食性香料，丁香有望开发为纯天然的食品和果品保鲜剂。

关键词：丁香精油丁香酚苹果贮期病害品质

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玉米象线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因克隆与表达分析

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中国农业科学 2016年第23期49卷 4544-4554页

作者：侯昌亮王靖博李永强吴华马志卿冯俊涛张兴西北农林科技大学无公害农药研究服务中心陕西省生物农药工程技术研究中心

【目的】克隆辣根素可能的作用位点——细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ(COXⅢ)的全长cDNA,并对其进行序列分析及原核表达。【方法】在NCBI数据库中查找玉米象(Sitophilus zeamais)COXⅢ已知的部分序列,利用RT-PCR,结合RACE技术克隆获得玉米象CO... 详细信息

【目的】克隆辣根素可能的作用位点——细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ(COXⅢ)的全长cDNA,并对其进行序列分析及原核表达。【方法】在NCBI数据库中查找玉米象(Sitophilus zeamais)COXⅢ已知的部分序列,利用RT-PCR,结合RACE技术克隆获得玉米象COXⅢ全长序列;利用DNAMAN8.0、MEGA5.1、GENEDOC、Prot Param和Target P 1.1 Server等软件对该基因全长cDNA序列、系统进化关系、基本理化性质及其三维结构进行分析;将玉米象COXⅢ基因分别与载体p EASY-Blunt E1、pET28a、pET30a、p ET32a、pET42a连接,构建原核表达载体p EASY-Blunt E1-COXⅢ、pET28a-COXⅢ、pET30a-COXⅢ、p ET32a-COXⅢ、pET42a-COXⅢ并分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,在不同IPTG诱导浓度、温度以及时间内诱导融合蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot(WB)对表达结果进行验证。【结果】获得的玉米象COXⅢ基因全长cDNA序列开放阅读框(ORF)为792 bp,编码263个氨基酸,编码的蛋白分子质量约为30 938.1 Da,理论等电点p I 6.51,预测分子式为C1492H2154N338O362S10,不稳定系数为34.49,总平均亲水系数为0.492,为疏水的稳定蛋白。系统发育树显示玉米象与鞘翅目象鼻虫科昆虫米象进化关系最近。原核表达结果表明,该蛋白在18℃、1 mmol·L-1 IPTG诱导24 h的条件下即能实现融合蛋白的表达,可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blot印迹检测证实大肠杆菌BL21(DE3)中表达了一个分子量约为62 k D的融合蛋白。【结论】成功从玉米象昆虫克隆得到COXⅢ全长cDNA序列,并实现了其编码蛋白的原核表达,可为后续探究玉米象COXⅢ功能和异硫氰酸酯类化合物对玉米象的作用机理提供理论依据。

关键词：玉米象细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ RACE技术生物信息学原核表达

松油烯-4-醇及其酯类衍生物对家蝇Na~+,K~+-ATPase活性的抑制作用

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中国农业科学 2008年第10期41卷 3110-3115页

作者：郭志波马志卿冯俊涛张兴西北农林科技大学无公害农药研究服务中心陕西省生物农药工程技术研究中心

【目的】探讨松油烯-4-醇的杀虫作用机理。【方法】采用点滴法测定了松油烯-4-醇及其6种酯类衍生物乙酸酯(Z1)、丙酸酯(Z2)、丙烯酸酯(Z3)、苯甲酸酯(Z4)、苯磺酸酯(Z5)、对甲苯磺酸酯(Z6)对家蝇成虫的触杀活性及对其体内Na+,K+-ATPase... 详细信息

【目的】探讨松油烯-4-醇的杀虫作用机理。【方法】采用点滴法测定了松油烯-4-醇及其6种酯类衍生物乙酸酯(Z1)、丙酸酯(Z2)、丙烯酸酯(Z3)、苯甲酸酯(Z4)、苯磺酸酯(Z5)、对甲苯磺酸酯(Z6)对家蝇成虫的触杀活性及对其体内Na+,K+-ATPase活性的影响。【结果】松油烯-4-醇及其酯类衍生物对家蝇均具有一定的触杀活性,除丙烯酸酯外,其它酯类衍生物的触杀毒力均高于或相当于松油烯-4-醇;活体条件下,7种化合物均对Na+,K+-ATPase具有较强的抑制作用,且随着中毒症状的加剧,对该酶的抑制作用增强;离体条件下,松油烯-4-醇及其乙酸酯、丙酸酯、苯甲酸酯、苯磺酸酯、对甲苯磺酸酯衍生物对家蝇Na+,K+-ATPase的IC50分别为155.89、197.98、96.02、121.36、124.85、153.74μg·ml-1;分析发现松油烯-4-醇及其酯类衍生物对家蝇24h的触杀LD50与对Na+,K+-ATPase的IC50之间具有显著相关性。【结论】Na+,K+-ATPase可能是松油烯-4-醇类化合物的主要作用靶标。

关键词：松油烯-4-醇松油烯-4-醇酯类衍生物 Na+,K+-ATPase 家蝇

雷公藤胚状体培养合成雷公藤甲素与总生物碱的初步研究

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农业生物技术学报 2013年第6期21卷 631-640页

作者：祝传书冯慧娜薛璐莎杨广隶冯俊涛张兴西北农林科技大学无公害农药研究服务中心陕西省生物农药工程技术研究中心

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)是一种多年生的木质藤本植物,生长周期长,次生代谢产物含量低,野生自然资源已经无法满足对其药用与农用的需求。为解决自然资源的短缺并保护雷公藤植物野生资源的生态环境,通过细胞工程技术生产... 详细信息

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)是一种多年生的木质藤本植物,生长周期长,次生代谢产物含量低,野生自然资源已经无法满足对其药用与农用的需求。为解决自然资源的短缺并保护雷公藤植物野生资源的生态环境,通过细胞工程技术生产雷公藤药用与农用活性物质是解决自然资源短缺,保护生态环境的途径之一。本研究中的雷公藤愈伤组织诱导自扦插一年生雷公藤叶片,将获得的愈伤组织建立细胞悬浮体系,诱导悬浮细胞得到生长稳定的胚状体培养体系。研究结果显示,添加60 mL/L椰汁的1/2 MS液体培养基可诱导愈伤组织形成浅绿色的胚状体,分离后的胚状体在1/2 MS添加0.5 mg/L a-萘乙酸(NAA)的液体培养基中可继续增殖分化。通过对接种量、培养基、装液量和pH值等培养条件的筛选和优化,在1/2MS培养基添加1.0 mg/L NAA和30 g/L蔗糖,胚状体接种量为1.5 g/100 mL,pH值调至5.8,250 mL三角瓶中装液量为120 mL时最适合胚状体的培养生长;添加内生真菌诱导子,以生物量为指标,在1/2MS+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+Y1(叶的内生菌),pH 5.8时雷公藤甲素在胚状体中的含量是叶中的1.07倍,是自然根皮粉中的1.44倍;在1/2MS+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+G4(根的内生菌),pH 5.8时胚状体中总生物碱量17.02倍于叶中总生物碱量,1.46倍于自然根皮粉中总生物碱量。对3龄小菜蛾(Plutella xylostella)的毒杀试验表明,胚状体提取物与根皮粉提取物相似,100 mg处理浓度下,72 h时死亡率均在90%以上。通过雷公藤叶愈伤组织诱导的雷公藤胚状体培养体系,其次生代谢物(雷公藤甲素与雷公藤总生物碱)含量与野生雷公藤叶和根皮中的相当,胚状体提取物的杀虫活性与雷公藤根皮粉的杀虫活性无明显差异,说明雷公藤胚状体可作为解决雷公藤植物资源短缺的一条途径,为进一步研究和利用雷公藤这一植物资源提供基础资料。

关键词：雷公藤胚状体雷公藤甲素雷公藤生物碱

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中国粗榧生物碱的除草活性

中国农业科学 2016年第19期49卷 3746-3753页

作者：马树杰刘琳芦小鹏马志卿张兴西北农林科技大学无公害农药研究服务中心陕西省生物农药工程技术研究中心

【目的】明确中国粗榧(Cephalotaxus sinensis)的除草活性成分,为进一步深入研究中国粗榧的除草作用打下基础。【方法】采用种子萌发法评价中国粗榧乙醇提取物、中国粗榧总生物碱及从中分离得到的8种生物碱(桥氧三尖杉碱、11-羟基三尖... 详细信息

【目的】明确中国粗榧(Cephalotaxus sinensis)的除草活性成分,为进一步深入研究中国粗榧的除草作用打下基础。【方法】采用种子萌发法评价中国粗榧乙醇提取物、中国粗榧总生物碱及从中分离得到的8种生物碱(桥氧三尖杉碱、11-羟基三尖杉碱、贡山三尖杉碱A、异三尖杉碱、cephalotaxineβ-N-oxide、4-羟基三尖杉碱、台湾三尖杉碱和三尖杉碱)对红三叶(Trifolium pratense)、反枝苋(Amaranthus retroflexus)、黑麦草(Lolium perenne)及高丹草(Sorghum sudanense)4种杂草种子幼根和幼芽的生长抑制作用;采用盆栽法测定中国粗榧乙醇提取物、中国粗榧总生物碱及各生物碱的鲜重抑制率。【结果】种子萌发试验表明,中国粗榧提取物、中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱、11-羟基三尖杉碱、三尖杉碱和cephalotaxineβ-N-oxide对红三叶种子具有较强的抑制作用,对幼根的有效中浓度(EC50)分别为634.35、690.47、69.47、71.21、174.11和243.12 mg·L-1,对幼芽的EC50分别为411.79、413.11、68.52、139.25、237.72和413.62 mg·L-1;中国粗榧提取物、中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱、11-羟基三尖杉碱、三尖杉碱和cephalotaxineβ-N-oxide对反枝苋种子具有较强的抑制作用,对幼根的EC50分别为176.32、29.69、21.01、48.08、199.57和90.74 mg·L-1,对幼芽的EC50分别为257.69、46.20、25.51、47.85、65.08和66.34 mg·L-1;仅中国粗榧提取物、中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱对高丹草种子具有抑制作用,对幼根的EC50分别为349.54、254.27和84.71 mg·L-1,对幼芽的EC50分别为556.50、168.66和154.34 mg·L-1;仅中国粗榧提取物、cephalotaxineβ-N-oxide及桥氧三尖杉碱对黑麦草种子具有抑制作用,对幼根的EC50分别为214.40、187.89和26.52 mg·L-1,对幼芽的EC50分别为695.58、290.15和122.26 mg·L-1;盆栽试验表明,中国粗榧提取物、总生物碱及3种生物碱(桥氧三尖杉碱、11-羟基三尖杉碱、三尖杉碱)对双子叶杂草红三叶和反枝苋表现出了一定的苗前除草作用,其中桥氧三尖杉碱的活性最高,以1 000 mg·L-1浓度进行土壤处理后,14 d的鲜重抑制率分别为78.89%和81.11%,但对禾本科的高丹草和黑麦草的鲜重抑制率较低,均在25%以下;茎叶喷雾处理显示,5种药剂对双子叶杂草红三叶和反枝苋的生长表现出一定的抑制作用,但抑制率均在30%以下,而对2种单子叶杂草基本无效果。【结论】中国粗榧生物碱对双子叶杂草具有较好的除草活性,其主要活性成分为桥氧三尖杉碱,且主要作用方式为抑制幼芽(根)的生长,具有进一步研究及开发潜力。

关键词：中国粗榧桥氧三尖杉碱 cephalotaxine β-N-oxide 除草活性植物源农药

过表达TwHMGR和TwDXR基因对雷公藤萜类次生代谢产物的影响

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农业生物技术学报 2018年第6期26卷 940-948页

作者：祝传书陈蒙蒙刘艳郭嘉张斌冯俊涛张兴西北农林科技大学无公害农药研究服务中心陕西省生物农药工程技术研究中心

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGR)和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)分别被认为是植物萜类合成途径:甲羟戊酸(mevalonate,MVA)和2-甲基赤藓醇4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途径的关键酶,这两个酶的基因表达水平将会直接影响到植物萜类物质的合成。本研究通过构建TwHMGR(KU246037.1)和TwDXR(KJ174341.1)基因的过表达载体,借助发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)整合到雷公藤(Tripterygium wilfordii)基因组中,分别筛选得到三株转基因发状根系。qRT-PCR分析结果表明,转基因发状根系中目的基因TwHMGR和TwDXR的表达量均明显高于对照,最高可分别达到对照的4.73倍和5.81倍。高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)法测定结果显示,转TwHMGR基因和TwDXR基因的发状根雷公藤内酯醇、雷公藤吉碱和雷公藤次碱的含量均明显高于对照,结果表明,提高雷公藤TwHMGR基因和TwDXR基因的表达量,可以提高雷公藤萜类次生代谢产物的产量。研究结果为进一步利用代谢工程手段调控雷公藤活性物质的生物合成以及为研究雷公藤萜类物质的生物合成途径奠定基础。

关键词：雷公藤过表达生物合成萜类化合物发状根

雷公藤1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶基因(TwDXR)的克隆与表达分析

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农业生物技术学报 2014年第3期22卷 298-308页

作者：祝传书陈欣郭嘉缪国鹏冯俊涛张兴西北农林科技大学无公害农药研究服务中心陕西省生物农药工程技术研究中心

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase,DXR)是植物萜类代谢通路中丙酮酸磷酸甘油醛途径的关键酶,该酶在植物细胞中的含量可以影响植物萜类物质的合成。利用RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)和RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术对雷公藤萜类生物合成途径中的关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶基因(1-deoxy-Dxylulose 5-phosphate reductoisomerase,TwDXR)进行了克隆和表达分析研究,结果表明,TwDXR基因全长1 674 bp,其中包含1 410 bp的开放阅读框,编码469个氨基酸(GenBank登录号:***174341)。与毛白杨(Populus trichocarpa)等植物中的DXR基因有很高的同源性,跨膜结构分析DXR肽链位于膜外;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测表明,TwDXR和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,TwHMGR)在不同雷公藤组织中均有表达,其中TwDXR在叶中的表达量最大;TwHMGR基因在不定根中的表达量最高;诱导因子AgNO3(Ag+)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理促进雷公藤不定根中TwDXR和TwHMGR的表达,其中用30 mmol/LAg+处理后,DXR基因表达量在第4天达到最大值,HMGR基因表达量在第2天达到最大值;用50 mmol/L MeJA处理后,DXR与HMGR基因的表达量均在第2天达到最大值;高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)检测表明,用30 mmol/L Ag+处理后,内酯醇在不定根中的积累量在第4天达到最大值,与DXR基因表达相一致,次碱的积累量在第6天达到最大值;用50 mmol/L MeJA处理后,内酯醇和次碱在不定根中的积累量均在第6天达到最大值。研究结果为阐明DXR基因在调控雷公藤萜类化合物生物代谢途径中的机理及提高雷公藤萜类次生代谢物质含量提供了基础资料。

关键词：雷公藤 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶基因(DXR) 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR) 硝酸银茉莉酸甲酯

紫外(UV-B)及超声波处理对雷公藤悬浮细胞中三种次生代谢物含量的影响

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农业生物技术学报 2013年第9期21卷 1052-1059页

作者：祝传书冯明星缪国鹏冯俊涛张兴西北农林科技大学无公害农药研究服务中心陕西省生物农药工程技术研究中心

目前已经找到一种由雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)细胞培养法生产雷公藤甲素和生物碱的方法,但是这种方法生产的次生代谢物产量较低,因此本研究利用紫外光(UV-B)辐照和超声波处理对雷公藤悬浮培养体系中萜类次生代谢物的含量... 详细信息

目前已经找到一种由雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)细胞培养法生产雷公藤甲素和生物碱的方法,但是这种方法生产的次生代谢物产量较低,因此本研究利用紫外光(UV-B)辐照和超声波处理对雷公藤悬浮培养体系中萜类次生代谢物的含量进行了检测分析。在雷公藤悬浮细胞的不同培养时期,利用不同时长的UV-B辐照和超声波分别处理的雷公藤悬浮细胞和培养体系,采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)对悬浮细胞和培养液中雷公藤内酯醇、吉碱和次碱的含量进行测定。结果表明,利用UV-B辐照和超声波处理均可以显著提高雷公藤悬浮培养体系中悬浮细胞生长量及其次生代谢物的含量。紫外辐照及超声波处理均可使雷公藤悬浮细胞的生长量比对照提高1～2倍。在雷公藤悬浮细胞生长周期的第13天用UV-B辐照90 min,雷公藤悬浮细胞中内酯醇、吉碱和次碱产物含量达到最大,分别为5.185、39.747和42.189μg/L;超声波处理40 s时,次生代谢物含量达到最大,分别为5.185、40.080和45.472μg/L,与对照相比提高1～3倍。另外超声波处理对雷公藤悬浮细胞中次生代谢物释放分泌入细胞培养液中有一定程度的促进作用,通过对雷公藤悬浮细胞培养液中次生代谢物含量的检测发现,在处理时长分别为40 s时,内酯醇、吉碱和次碱的转化率分别达到93.7%、86.6%和88.1%,与对照相比含量提高1～3倍。本研究为解决雷公藤野生资源短缺,利用雷公藤悬浮细胞培养生产雷公藤内酯醇、吉碱和次碱提供基础资料。

关键词：雷公藤悬浮细胞培养紫外辐照超声波处理次生代谢物