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H3N2和H1N1甲型流感病毒感染对猪CDK9基因表达的影响

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2013年第10期41卷 14-18页

作者：李登云孙岩蒋鹏飞亢展展王静娜华琳琳张洋张德礼西北农林科技大学动物医学院病毒免疫与生物信息研究室陕西杨凌712100

【目的】研究H3N2和H1N1甲型流感病毒感染对仔猪肺脏CDK9基因表达的影响,揭示流感发病机制与CDK9基因的相关性。【方法】以接种PBS的仔猪为空白对照,利用实时荧光定量PCR技术和半定量免疫组织化学法,检测H3N2和H1N1甲型流感病毒接种感... 详细信息

【目的】研究H3N2和H1N1甲型流感病毒感染对仔猪肺脏CDK9基因表达的影响,揭示流感发病机制与CDK9基因的相关性。【方法】以接种PBS的仔猪为空白对照,利用实时荧光定量PCR技术和半定量免疫组织化学法,检测H3N2和H1N1甲型流感病毒接种感染7d后,仔猪肺脏CDK9的mRNA和蛋白表达的变化,并在电子显微镜下观察CDK9阳性细胞的定位。【结果】实时荧光定量PCR检测表明,H3N2和H1N1甲型流感病毒感染仔猪7d后,肺脏组织内CDK9基因mRNA的相对表达量分别为0.42和0.36,与对照(1.0)相比显著降低(P免疫组织化学检测结果显示,仔猪受到H3N2和H1N1流感病毒感染后,肺脏组织内CDK9蛋白的相对表达水平分别为31.4和38.7,较正常组织(61.4)显著降低(P病毒感染仔猪后,肺脏细胞界限不明显,CDK9阳性细胞散在分布于终末细支气管和肺泡内,且胞核着色较深,但是细胞整体着色变浅。【结论】受到流感病毒感染后,仔猪肺脏组织内CDK9表达量降低,可能是RNApolⅡ磷酸化水平降低的原因之一。

关键词：流感病毒 CDK9基因实时荧光定量PCR 免疫组织化学

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鸡BCL10基因的克隆与表达

中国兽医学报 2011年第4期31卷 533-538页

作者：孙柏李燕丽张亚杰薄联锋郜原张德礼西北农林科技大学动物医学院病毒免疫与生物信息研究室陕西杨凌712100

通过电子克隆手段,克隆到大小为959bp的cDNA序列。然后从鸡的脾脏提取RNA,用RT-PCR方法扩增出目的片段。将该片段连接到原核表达载体pET-32a和真核表达载体pEGFP-C1中,采用SDS-PAGE检测原核表达载体pET-BCL10在大肠杆菌中的表达,脂质体... 详细信息

通过电子克隆手段,克隆到大小为959bp的cDNA序列。然后从鸡的脾脏提取RNA,用RT-PCR方法扩增出目的片段。将该片段连接到原核表达载体pET-32a和真核表达载体pEGFP-C1中,采用SDS-PAGE检测原核表达载体pET-BCL10在大肠杆菌中的表达,脂质体转染法将真核表达载体pEGFP-BCL10转入vero细胞,Western blotting检测其在细胞中的表达。结果显示,PCR扩增到735bp的DNA片段,原核表达载体和真核表达载体经双酶切和核酸测序表明载体构建成功。SDS-PAGE电泳检测到pET-BCL10重组质粒在大肠杆菌中表达。Western blotting检测到pEGFP-BCL10重组质粒在vero细胞中表达。结论表明,BCL10基因在鸡体内存在,该基因的重组质粒能在大肠杆菌和vero细胞中表达。

关键词： BCL10基因克隆原核表达真核表达 Western blotting

猪新基因P58^IPK的分子克隆、原核表达及其多克隆抗体的制备

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细胞与分子免疫学杂志 2011年第6期27卷 637-640页

作者：温俊歌宋豪孙岩郜原徐志坤薄联锋张德礼西北农林科技大学动物医学院病毒免疫与生物信息研究室生物信息研究中心分子病毒免疫与肿瘤系统生物学研究组陕西杨凌712100

目的:分子克隆出猪P58IPK新基因,制备其多克隆抗体,为下一步研究流感病毒与宿主相互作用机制提供条件。方法:根据猪EST数据库,利用生物信息学方法,电子克隆猪P58IPK新基因;采用RT-PCR方法从猪淋巴组织分子克隆P58IPK基因完整开放阅读框(... 详细信息

目的:分子克隆出猪P58IPK新基因,制备其多克隆抗体,为下一步研究流感病毒与宿主相互作用机制提供条件。方法:根据猪EST数据库,利用生物信息学方法,电子克隆猪P58IPK新基因;采用RT-PCR方法从猪淋巴组织分子克隆P58IPK基因完整开放阅读框(ORF),全长1 518 bp,编码505个氨基酸(GenBank登录号:HQ287801),并对其进行初步生物信息学分析;构建P58IPK原核表达载体pET-P58IPK,诱导表达并纯化重组的his-P58IPK融合蛋白,后免疫兔子制备多克隆抗体。结果:成功制备P58IPK多克隆抗体,通过双向琼脂扩散实验检测抗体有活性,ELISA鉴定血清中多抗效价达到1∶20 000,Western blot与免疫荧光检测反应特异性良好。结论:成功克隆猪新基因P58IPK,并制备了其多克隆抗体。

关键词：猪P58IPK 多克隆抗体 ELISA Western blot 免疫荧光

猪CDK9基因的克隆及其过表达对SUVEC细胞周期的影响

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2010年第8期38卷 33-39页

作者：张亚杰宋豪李艳丽孙柏孙岩张德礼西北农林科技大学动物医学院病毒免疫与生物信息研究室陕西杨凌712100

【目的】克隆猪细胞周期蛋白激酶9(CDK9)基因,观察该基因过表达对猪脐静脉血管内皮细胞(SU-VEC)周期的影响。【方法】采用电子克隆方法筛选得到猪CDK9基因全长序列,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析。利用RT-PCR方法从猪脾脏中扩增... 详细信息

【目的】克隆猪细胞周期蛋白激酶9(CDK9)基因,观察该基因过表达对猪脐静脉血管内皮细胞(SU-VEC)周期的影响。【方法】采用电子克隆方法筛选得到猪CDK9基因全长序列,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析。利用RT-PCR方法从猪脾脏中扩增出包含完整开放读码框架(ORF)的CDK9 cDNA片段,将其与真核表达载体pEGFP-C1连接,构建重组真核表达载体pEGFP-CDK9。将pEGFP-CDK9以脂质体介导法转染至SUVEC细胞,采用绿色荧光标记和Western blot检测SUVEC细胞中CDK9基因的表达,用流式细胞仪检测转染CDK9基因后SUVEC细胞周期的变化。【结果】得到猪CDK9基因全长1820bp的cDNA序列,其ORF为1119bp,编码372个氨基酸;CDK9分子质量为42.76ku,等电点为9.04;CDK9基因定位于猪的1号染色体上。酶切和测序结果证明,重组真核表达载体pEGFP-CDK9构建成功。pEGFP-CDK9转染SUVEC细胞48h后,荧光显微镜和Western blot检测到目的基因序列在SUVEC细胞中成功表达;试验组各期SUVEC细胞比例与空载体组相比,差异无统计学意义(P>0.05),细胞周期未发生显著变化。【结论】克隆了猪CDK9基因,并在SUVEC细胞中成功进行了表达。CDK9基因的过表达未引起细胞周期发生显著变化,其可能并不参与细胞周期的调控。

关键词： CDK9基因猪真核表达细胞周期

人天然免疫基因BCL10的猪同源物的识别、克隆与初步表达分析

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遗传 2008年第6期30卷 747-754页

作者：何建锋张彦明段会娟曹金锁张德礼西北农林科技大学动物医学院预防兽医学系病毒免疫与生物信息研究室杨凌712100

采用电子克隆方法克隆到大小为925bp的人天然免疫蛋白BCL10的猪同源基因完整cDNA序列(GenBank登录号:EU088132),并利用RT-PCR方法从猪的全血中扩增出包含702bp的完整开放读码框架(ORF)的cDNA片段。经核酸测序,证明与电子克隆结果相符。... 详细信息

采用电子克隆方法克隆到大小为925bp的人天然免疫蛋白BCL10的猪同源基因完整cDNA序列(GenBank登录号:EU088132),并利用RT-PCR方法从猪的全血中扩增出包含702bp的完整开放读码框架(ORF)的cDNA片段。经核酸测序,证明与电子克隆结果相符。利用NCBIBLAST分析该cDNA包含3个大小为57bp、289bp和356bp的外显子,并且定位于猪的4号染色体上。采用半定量PCR技术检测基础水平猪各组织BCL10基因mRNA表达丰度,并将该基因构建到带有绿色标签的真核表达载体pEGFP-C1中,采用脂质体转染法将该基因转入PK-15细胞,通过绿色荧光标记和RT-PCR方法检测实验组的BCL10蛋白表达。研究结果表明,BCL10基因mRNA在脾脏中表达最高;胸腺、大脑和淋巴结表达次之,而肝脏只有微量表达,肾脏没有检测到表达;同时BCL10基因在PK-15细胞中得到了有效表达。

关键词： BCL10基因克隆表达分析真核表达

奶牛NR1D1基因的真核表达载体构建、表达谱及其在卵巢组织的定位

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畜牧兽医学报 2023年第1期54卷 133-145页

作者：王逸群刘祖培李雅婷张海森李丹靳亚平陈华涛西北农林科技大学动物医学院杨凌712100 西北农林科技大学农业农村部动物生物技术重点实验室杨凌712100

旨在克隆奶牛核受体亚家族1 D组成员1(nuclear receptor subfamily 1 group D member 1,NR1D1)基因的蛋白编码序列(coding sequence, CDS),构建其真核表达载体,预测分析NR1D1基因的生物学功能,并检测该基因的组织表达谱及其在卵巢组织... 详细信息

旨在克隆奶牛核受体亚家族1 D组成员1(nuclear receptor subfamily 1 group D member 1,NR1D1)基因的蛋白编码序列(coding sequence, CDS),构建其真核表达载体,预测分析NR1D1基因的生物学功能,并检测该基因的组织表达谱及其在卵巢组织的表达分布。本研究以5头健康的24月龄雌性奶牛为试验动物,PCR扩增带有同源臂的奶牛NR1D1基因CDS区全长片段,利用同源重组法将目的片段连接至线性化的pcDNA3.1-Puro-N-3HA空载体,构建重组质粒,利用酶切、PCR及测序对重组质粒进行鉴定。结合质粒测序结果,利用生物信息学软件预测分析该基因的生物学功能。将鉴定正确的质粒转染至HEK293T细胞,利用实时荧光定量PCR(qPCR)与Western blotting技术检测NR1D1基因在mRNA与蛋白水平的表达。此外,利用qPCR检测奶牛NR1D1基因的组织表达谱,并利用免疫组织化学技术检测NR1D1蛋白在奶牛卵巢组织的表达分布。结果,成功获得带有同源臂的奶牛NR1D1基因的CDS区全长片段(1 884 bp),酶切、PCR及测序结果表明pcDNA3.1-3HA-cNR1D1真核表达载体构建成功。生物信息学分析结果显示,NR1D1蛋白不存在跨膜结构,为核蛋白,其核定位序列存在于第200位氨基酸附近,且NR1D1蛋白中存在86个潜在的磷酸化位点;奶牛与小鼠NR1D1蛋白三级结构较为相似,奶牛NR1D1蛋白可能在奶牛生殖、代谢与免疫等生理过程中发挥重要作用。将pcDNA3.1-3HA-cNR1D1转染至HEK293T细胞,奶牛NR1D1基因在mRNA与蛋白水平均成功过表达。qPCR结果显示,NR1D1基因在奶牛瘤胃、结肠与肝中表达量显著高于其他组织;免疫组织化学结果显示,奶牛NR1D1表达于不同发育时期卵泡的颗粒细胞中。本研究成功构建了奶牛NR1D1基因真核表达载体,且在HEK293T细胞成功实现了该基因的过表达,对奶牛NR1D1基因及其编码蛋白的理化性质与生物学特性进行了预测分析,并获得了该基因的组织表达谱及在奶牛卵巢组织的表达分布情况,为深入探究奶牛NR1D1基因的生物学功能提供了前期基础与关键材料。

关键词：反刍动物生物钟核受体繁殖表达谱

PLptn真核载体的构建表达及其趋化活性测定

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中国兽医杂志 2010年第7期46卷 22-24页

作者：柳超蒋朋飞曹金锁张德礼西北农林科技大学动物医学院病毒免疫与生物信息研究室陕西杨凌712100

趋化因子是一种能够趋化和活化白细胞的细胞因子,在炎症和免疫反应中发挥着重要的作用,现在发现的趋化因子有CXC,CC,CX3C和C共四族。淋巴细胞趋化因子(Lptn)为趋化因子C家族成员,[第一段]

关键词：趋化因子真核载体活性测定细胞因子免疫反应淋巴细胞白细胞炎症

小鼠Bmal1基因克隆与表达载体构建及其生物信息学分析

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基因组学与应用生物学 2022年第3期41卷 461-471页

作者：江海圳董浩马白荣李超李丹高登科靳亚平陈华涛西北农林科技大学动物医学院临床兽医系西北农林科技大学农业农村部动物生物技术重点实验室

本研究旨在克隆小鼠(Mus musculus)生物钟基因Bmal1的蛋白编码序列(coding sequence, CDS),构建其真核表达载体，并分析小鼠BMAL1蛋白的生物学特性。从小鼠肝脏组织中提取总RNA,反转录得到cDNA,通过PCR扩增获得小鼠Bmal1基因CDS区片段... 详细信息

本研究旨在克隆小鼠(Mus musculus)生物钟基因Bmal1的蛋白编码序列(coding sequence, CDS),构建其真核表达载体，并分析小鼠BMAL1蛋白的生物学特性。从小鼠肝脏组织中提取总RNA,反转录得到cDNA,通过PCR扩增获得小鼠Bmal1基因CDS区片段，并以同源重组的方式连接至pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体。经酶切和测序鉴定后将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-BMAL1。将pcDNA3.1-3HA-BMAL1转染至HEK293T细胞，并通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(WB)检测BMAL1在HEK293T细胞中的表达。同时对小鼠Bmal1基因及其编码蛋白进行生物信息学分析。酶切和测序鉴定结果表明，pcDNA3.1-3HA-BMAL1中插入的Bmal1基因CDS区片段正确。RT-qPCR及WB检测结果表明，相较于对照组，pcDNA3.1-3HA-BMAL1转染组的HEK293T细胞中小鼠Bmal1基因在mRNA及蛋白水平的表达均大幅度升高。生物信息学分析结果表明，包括小鼠和人(Homo sapiens)在内的多种哺乳动物的Bmal1基因CDS区具有较高的同源性；小鼠BMAL1为不稳定蛋白，具有一定的亲水性，存在磷酸化位点23个、乙酰化位点4个、泛素化位点6个；小鼠BMAL1蛋白不存在跨膜区和信号肽，属于胞内蛋白；小鼠BMAL1蛋白二级结构由α-螺旋、延伸链、β-折叠和无规则卷曲组成，三级结构和人BMAL1蛋白相比具有极高的相似性。双荧光素酶报告实验证明BMAL1蛋白具有正常的转录调节活性。本研究成功克隆了小鼠Bmal1基因的CDS区片段，构建了小鼠pcDNA3.1-3HA-BMAL1真核表达载体，验证了其在HEK293T细胞中的表达效果，并利用生物信息学软件分析了小鼠Bmal1基因及其编码蛋白的生物学特性。

关键词：小鼠生物钟真核表达载体生物信息学

山羊RORα基因的克隆、表达载体构建及功能分析

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畜牧兽医学报 2022年第6期53卷 1779-1794页

作者：高登科赵泓淙董浩靳亚平陈华涛西北农林科技大学动物医学院杨凌712100 西北农林科技大学农业农村部动物生物技术重点实验室杨凌712100

旨在克隆山羊维甲酸相关孤儿受体α(RORα)基因并构建其真核表达载体,然后利用生物信息学工具系统分析RORα的生物学特性,最后对其在山羊生物钟系统中的作用机制进行初步探究。本研究以1只健康的12月龄雄性西农萨能奶山羊为试验动物,提... 详细信息

旨在克隆山羊维甲酸相关孤儿受体α(RORα)基因并构建其真核表达载体,然后利用生物信息学工具系统分析RORα的生物学特性,最后对其在山羊生物钟系统中的作用机制进行初步探究。本研究以1只健康的12月龄雄性西农萨能奶山羊为试验动物,提取其肝组织总RNA,经逆转录PCR反转录为cDNA后,利用常规PCR扩增山羊RORα基因的编码区(coding sequence,CDS)片段,使用同源重组法将其与pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体相连接;重组载体经PCR、酶切和测序鉴定后,将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-gRORα;将pcDNA3.1-Puro-N-3HA和pcDNA3.1-3HA-gRORα质粒分别转染至HEK293T细胞后,通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和蛋白质免疫印迹(western blotting,WB)技术检测山羊RORα的表达;同时利用ExPASy、ProtScale等软件对山羊RORα基因进行系统的生物信息学分析。另外,使用同源重组法分别构建含有山羊生物钟基因BMAL1和NR1D1启动子片段的pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc及pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc的荧光素酶报告质粒,并通过双荧光素酶报告试验探究山羊RORα蛋白调控BMAL1和NR1D1基因启动子转录活性的作用机制。PCR、酶切和测序鉴定结果表明,pcDNA3.1-3HA-gRORα重组质粒构建成功;qPCR和WB结果显示,pcDNA3.1-3HA-gRORα转染组RORα基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平均显著高于pcDNA3.1-Puro-N-3HA转染组(P生物信息学分析结果显示,山羊RORα基因CDS区序列与绵羊、牛和猪的相似性较高,分别为97.5%、97.1%和95.2%。山羊的RORα蛋白是一种亲水性蛋白。二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,有信号肽的概率较小,无跨膜区;三级结构与小鼠和人的RORα蛋白差异性极小,三者具有高度相似性。此外,PCR、酶切和测序结果表明,pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc和pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc重组质粒构建成功。双荧光素酶报告试验结果表明,山羊RORα蛋白可以显著上调山羊BMAL1和NR1D1基因启动子的转录活性。本研究成功构建了山羊RORα基因的真核表达载体,并证明了RORα蛋白可以正向调控山羊BMAL1和NR1D1基因的启动子活性,这为进一步探究山羊核受体RORα的功能及山羊生物钟的转录调控机制提供了前期基础。

关键词：山羊维甲酸相关孤儿受体α 真核表达载体生物信息学分析生物钟