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基于BLI技术的BamAβ-barrel结合化合物检测方法的建立

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中国抗生素杂志 2024年第4期49卷 448-456页

作者：郑怡凡朱小红陈明华卢宇魏元娟时文静司书毅李妍中国医学科学院、北京协和医学院、医药生物技术研究所、国家新药(微生物)筛选实验室北京100050

目的以革兰阴性菌外膜蛋白折叠辅助因子关键蛋白BamA为靶蛋白,基于生物膜干涉(Biolayer interferometry,BLI)技术建立化合物与BamA蛋白β折叠结构域(BamA_(β-barrel))结合活性的评价方法,为建立靶向BamA蛋白的抗革兰阴性菌先导物奠定... 详细信息

目的以革兰阴性菌外膜蛋白折叠辅助因子关键蛋白BamA为靶蛋白,基于生物膜干涉(Biolayer interferometry,BLI)技术建立化合物与BamA蛋白β折叠结构域(BamA_(β-barrel))结合活性的评价方法,为建立靶向BamA蛋白的抗革兰阴性菌先导物奠定基础。方法应用BLI方法检测BamA_(β-barrel)与已知的阳性化合物darobactin的结合活性。原核表达并纯化带有His标签的大肠埃希菌BamA_(β-barrel)蛋白,使用表面活性剂LDAO对其进行复性和折叠;使用生物素标记折叠和未折叠蛋白,并结合到超级链霉亲和素(super streptavidin,SSA)生物传感器,然后检测蛋白与不同浓度的darobactin结合信号的变化,同时做无蛋白或darobactin稀释液对照;空白对照采用未结合生物素化的BamA_(β-barrel)蛋白的传感器,检测上述系列稀释样品。相应信号采用Steady state analysis方式拟合分析,计算平衡常数(KD)值。结果成功获得高纯度的折叠状态BamA_(β-barrel)蛋白,通过BLI技术检测到折叠状态的BamA_(β-barrel)与阳性化合物darobactin具有良好结合活性且呈现浓度依赖性,R^(2)为0.9998,KD值为(2.2E-06±8.0E-08)M。结论基于BLI技术成功建立了折叠状态的BamA_(β-barrel)-化合物结合活性的评价方法,为后续BamA蛋白靶向性抗革兰阴性菌抗生素的发现建立基础。

关键词：革兰阴性菌 Darobactin BamAβ-barrel 生物膜干涉技术

靶向HER2的通用型CAR-T细胞来源的细胞外囊泡的制备及功能鉴定

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细胞与分子免疫学杂志 2024年第2期40卷 121-128页

作者：蒙若彤王鹏举赵晓娟郑瑞梁思辛张依婷董昊韩玉洁杨安钢白占涛阎博路凡延安大学生命科学学院陕西延安716000 空军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室陕西西安710032 空军军医大学基础医学院免疫学教研室陕西西安710032 新乡医学院医学检验学院河南新乡453003

目的利用可持续传代的T淋巴细胞系,制备携带靶向人表皮生长因子受体2(HER2)蛋白的嵌合抗原受体(CAR)的细胞外囊泡(EV),并检测其对HER2^(+)肿瘤细胞的杀伤能力。方法采用分子克隆技术构建重组慢病毒质粒。利用成簇的规律间隔的短回文... 详细信息

目的利用可持续传代的T淋巴细胞系,制备携带靶向人表皮生长因子受体2(HER2)蛋白的嵌合抗原受体(CAR)的细胞外囊泡(EV),并检测其对HER2^(+)肿瘤细胞的杀伤能力。方法采用分子克隆技术构建重组慢病毒质粒。利用成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术和慢病毒感染的方法构建底盘Jurkat细胞。流式细胞术检测底盘Jurkat细胞、嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞和CAR-Jurkat细胞的构建。通过聚乙二醇6000(PEG6000)浓缩方法和细胞挤压方法制备EV;微粒子追踪分析(NTA)和Western blot法鉴定EV。萤光素酶报告基因系统检测细胞和EV对肿瘤细胞的杀伤作用。荧光显微镜观察免疫细胞对EV的吞噬作用。结果酶切鉴定和基因测序结果表明重组质粒构建成功。流式细胞术结果显示底盘Jurkat细胞、 CAR-T细胞和CAR-Jurkat细胞顺利制备。NTA结果显示制备的EV大小正确。萤光素酶报告基因系统证明CAR-T细胞、 CAR-Jurkat细胞、 CAR-T EV和CAR-Jurkat EV对HER2+肿瘤细胞均具有靶向杀伤能力。荧光显微镜观察表明,提高CD47分子的表达水平能够减弱免疫细胞对通用型CAR-Jurkat EV的吞噬作用。结论通用型CAR-T细胞来源EV能够靶向杀伤HER2+肿瘤细胞。

关键词：嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞同种异体底盘细胞细胞外囊泡

基于可变形注意力transformer的胃肠癌病理图像细胞核自动分割方法

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复旦学报（医学版） 2024年第3期51卷 396-403页

作者：唐智贤李镇郭俏胡家祺王雪姚旭峰上海健康医学院医学影像学院医学影像技术教研室上海201318 上海理工大学健康科学与工程学院生物医学工程研究所上海200093 上海交通大学医学院附属瑞金医院病理科上海200025

目的使用深度学习算法实现胃肠癌病理图像的细胞核自动分割,辅助后续病理图像的定量分析。方法以2022年1月—2022年2月在上海交通大学医学院附属瑞金医院就诊的59例胃肠癌患者为研究对象,采用python和LabelMe对患者的病理图像进行数据... 详细信息

目的使用深度学习算法实现胃肠癌病理图像的细胞核自动分割,辅助后续病理图像的定量分析。方法以2022年1月—2022年2月在上海交通大学医学院附属瑞金医院就诊的59例胃肠癌患者为研究对象,采用python和LabelMe对患者的病理图像进行数据脱敏、图片切割和感兴趣区域标注,共纳入944张病理图像,标注了9703个细胞核。通过构建一种基于深度学习的新型语义分割模型,模型引入可变型注意力transformer(deformable attention transformer,DAT),实现了病理图像细胞核自动、精准、高效分割,并采用多种分割评价标准评估模型性能。结果模型分割结果的平均绝对误差值(mean absolute error,MAE)为0.1126,骰子系数(dice coefficient,Dice)为0.7215,其效果明显优于U-net基线模型,并领先于ResU-net++、R2Unet和R2AttUnet等模型,且分割结果相对稳定,泛化性好。结论本研究建立的分割模型能够精准识别并分割出病理图像中的细胞核,鲁棒性和泛化性较好,有助于在实际应用中辅助诊断。

关键词：深度学习模型病理图像细胞核分割胃肠癌诊断

耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌生物膜形成与外排泵基因AdeABC表达的相关性研究

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中国抗生素杂志 2024年

作者：潘蓓珍刘岩宿建胜杨继飞姜菲菲孙丽媛北华大学医学技术学院临床病原学检验教研室

目的研究鲍曼不动杆菌的生物膜形成，以及浮游态和生物膜状态下对外排泵基因AdeABC的相对表达量作用于碳青霉烯类抗生素耐药机制的影响。方法将菌株经药物敏感性试验分为碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌(CRAB)组和碳青霉烯类敏感鲍曼不动... 详细信息

目的研究鲍曼不动杆菌的生物膜形成，以及浮游态和生物膜状态下对外排泵基因AdeABC的相对表达量作用于碳青霉烯类抗生素耐药机制的影响。方法将菌株经药物敏感性试验分为碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌(CRAB)组和碳青霉烯类敏感鲍曼不动杆菌(CSAB)组，采用结晶紫染色法检测两组生物膜形成能力；通过微量肉汤稀释法分别测定两组对亚胺培南的MIC、MBIC值，并计算MBIC/MIC的比值进一步比较分析生物膜菌和浮游菌的耐药性；同时提取CRAB组浮游态和生物膜态的RNA，通过RT-qPCR检测外排泵基因AdeABC相对表达量。结果 35株标本的生物膜阳性率为91.43%，其中CRAB组生物膜的阳性检出率为92%，生物膜阴性、弱阳性、阳性和强阳性分别占8%、48%、36%和8%。MBIC/MIC比值显示，形成生物膜后，鲍曼不动杆菌的耐药能力呈现不同程度的增加，CSAB组的耐药增加幅度以2倍的菌株最多；CRAB组的增加幅度以4倍的菌株最多。同时CRAB组RT-qPCR结果显示，生物膜较浮游态相比，外排泵基因adeA和adeB的相对表达量明显增高(P0.05)。结论鲍曼不动杆菌碳青霉烯类耐药与生物膜密切相关，且生物膜态的鲍曼不动杆菌较浮游态可促进外排泵基因AdeABC的表达从而增强碳青霉烯类抗生素的耐药性。

关键词：鲍曼不动杆菌亚胺培南生物膜外排泵

生物钟核受体NR1D1在奶牛子宫内膜上皮细胞炎性反应中的作用

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中国畜牧杂志 2024年

作者：郭怡莹王雪容杨王浩曹梦丹张海森靳亚平陈华涛西北农林科技大学动物医学院农业农村部动物生物技术重点实验室

本研究旨在构建并筛选干扰效率高的奶牛NR1D1基因慢病毒干扰载体，以探究生物钟核受体NR1D1在大肠杆菌脂多糖（LPS）诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞（BEND）炎性反应中的作用。使用1 μg/mL LPS处理BEND 12 h建立炎性反应模型，qPCR检测炎... 详细信息

本研究旨在构建并筛选干扰效率高的奶牛NR1D1基因慢病毒干扰载体，以探究生物钟核受体NR1D1在大肠杆菌脂多糖（LPS）诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞（BEND）炎性反应中的作用。使用1 μg/mL LPS处理BEND 12 h建立炎性反应模型，qPCR检测炎症因子与生物钟基因的表达变化；设计2对靶向奶牛NR1D1基因的特异性短发夹RNA（shRNA）序列和1对无义序列，退火后分别连接至pCD513B-U6载体构建3个重组质粒，随后进行酶切和测序鉴定。将酶切测序鉴定均无误的重组质粒与辅助质粒共转染至HEK293T细胞包装慢病毒，获得病毒颗粒后用其感染BEND，2 μg/mL嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞系并使用qPCR和WB鉴定干扰效率。LPS处理NR1D1敲低组与对照组BEND细胞，采用qPCR技术检测炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β mRNA的表达变化。结果表明：LPS处理BEND后，IL-6、IL-8、IL-1β等炎症因子显著升高，表明BEND炎性反应模型构建成功。同时，LPS处理后，生物钟核受体NR1D1 mRNA表达量显著升高，提示其可能参与BEND炎性反应的调控；成功构建2个NR1D1基因慢病毒干扰载体sh1和sh2，WB结果显示，sh1和sh2均能有效降低NR1D1的表达，其中sh2的干扰效果最好，使用嘌呤霉素筛选成功获得sh2的敲低细胞系；LPS处理后，炎症因子在sh2细胞系中的表达显著高于shn组。本研究成功构建了奶牛NR1D1基因的慢病毒干扰载体，通过转染BEND细胞，筛选并成功获得了NR1D1敲低的稳定细胞系，发现NR1D1在LPS诱导的BEND炎性反应中可能发挥抑制促炎因子表达的作用，为后续深入探究NR1D1在奶牛子宫内膜炎发生发展过程中的作用机制提供前期基础。

关键词：奶牛 NR1D1基因子宫内膜炎慢病毒 RNA干扰

小鼠Klf11基因真核表达载体的构建、结构功能预测与初步验证

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江西农业大学学报 2024年

作者：唐艳颖熊菊萍杨王浩赵泓淙王雪容高登科董士豪马白荣靳亚平陈华涛西北农林科技大学动物医学院农业农村部动物生物技术重点实验室

【目的】本研究旨在克隆小鼠Kruppel样转录因子家族成员11（KLF11）基因并构建其真核表达载体，在小鼠AML12肝实质细胞系中过表达Klf11后探究其对脂代谢相关基因的调控作用。【方法】以小鼠肝脏组织cDNA为模板，通过PCR扩增小鼠Klf11基... 详细信息

【目的】本研究旨在克隆小鼠Kruppel样转录因子家族成员11（KLF11）基因并构建其真核表达载体，在小鼠AML12肝实质细胞系中过表达Klf11后探究其对脂代谢相关基因的调控作用。【方法】以小鼠肝脏组织cDNA为模板，通过PCR扩增小鼠Klf11基因的蛋白编码区（CDS），随后将其连接至pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体，构建重组质粒。利用酶切、PCR及测序对重组质粒进行鉴定，将鉴定正确的质粒命名为pcDNA3.1-mKLF11。利用在线软件对Klf11序列及其编码蛋白进行生物信息学分析。使用免疫组化技术检测KLF11在小鼠肝脏组织中的表达。将pcDNA3.1-Puro-N-3HA与pcDNA3.1-mKLF11质粒分别转染至HEK293T和AML12细胞，利用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）和蛋白质印迹技术（Western blotting）对小鼠Klf11基因的表达效果进行检测。最后通过qPCR和油红O染色，检测游离脂肪酸（FFA）处理后Klf11的过表达对AML12细胞脂质代谢的影响。【结果】PCR、酶切及测序结果显示，成功克隆了小鼠Klf11基因的CDS区片段并构建了pcDNA3.1-mKLF11重组质粒。生物信息学分析结果显示，小鼠Klf11基因的编码区序列与大鼠和人类的相似性较高。小鼠KLF11蛋白表现出亲水性特征，二级结构包括无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角，不存在信号肽，且不存在跨膜区；小鼠KLF11蛋白的三级结构与人类和大鼠的KLF11蛋白相比均存在显著差异。免疫组化结果表明，KLF11主要表达于小鼠肝细胞细胞核。qPCR和Westren blotting结果显示，在HEK293T和AML12细胞中，pcDNA3.1-mKLF11转染组Klf11基因的mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照组。此外，在FFA处理的条件下，Klf11过表达后小鼠AML12细胞中脂代谢相关基因Fasn、Acaca和Plin2的表达量显著升高，并且过表达组中细胞内脂滴数量增加。【结论】本研究成功构建了小鼠Klf11基因的真核表达载体，对小鼠Klf11基因及其编码蛋白进行了生物信息学分析。免疫组化结果表明KLF11主要表达于小鼠肝细胞细胞核。此外，在AML12细胞中成功过表达KLF11蛋白，并证明Klf11的过表达显著促进了AML12细胞的脂质沉积。本研究为后续探究Klf11基因调控哺乳动物肝脏脂质代谢的作用机制提供了前期基础，为开发家畜脂质代谢障碍疾病防治的新药物提高新思路。

关键词： Klf11 载体构建肝脏脂代谢生物信息学分析

生物钟基因BMAL1过表达对山羊子宫内膜上皮细胞凋亡的影响

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农业生物技术学报 2024年第6期32卷 1329-1341页

作者：李超徐皓东郭怡莹刘薇王逸群肖要要杨王浩靳亚平陈华涛西北农林科技大学动物医学院/农业农村部动物生物技术重点实验室

生物钟作为一种内源性计时系统，在调控哺乳动物行为活动与生理功能等方面发挥重要作用。为探究核心生物钟基因脑肌类芳香烃受体核转位蛋白1 (brain and muscle arnt-like protein 1, BMAL1)在山羊子宫内膜上皮细胞(goat endometrial ep... 详细信息

生物钟作为一种内源性计时系统，在调控哺乳动物行为活动与生理功能等方面发挥重要作用。为探究核心生物钟基因脑肌类芳香烃受体核转位蛋白1 (brain and muscle arnt-like protein 1, BMAL1)在山羊子宫内膜上皮细胞(goat endometrial epithelial cells, GEECs)凋亡过程中的作用，本研究以24月龄山羊子宫组织为材料克隆BMAL1基因的CDS序列，通过生物信息学方法分析、预测该基因及其编码蛋白的理化性质，利用qPCR技术检测其在山羊不同组织以及同步化后的GEECs中的表达变化；应用流式细胞术、qPCR与Western blot技术检测BMAL1基因过表达对GEECs凋亡的影响。结果显示，BMAL1基因的表达在各种组织以及不同时间点呈现显著的昼夜差异。山羊BMAL1基因的CDS全长1 881 bp，在哺乳动物中保守性较高，其编码蛋白可以通过与昼夜运动输出周期蛋白(circadian locomotor output cycles kaput,CLOCK)、核受体亚家族1D成员1 (nuclear receptor subfamily 1, group D, member 1, NR1D1)和酪蛋白激酶1δ (casein kinase 1δ, CSNK1D)等蛋白互作参与调控多种生理功能。流式细胞术结果表明，BMAL1过表达显著抑制了GEECs的凋亡(P生物钟系统的分子调控机制和进一步探究山羊BMAL1基因的生物学功能提供了基础。

关键词：生物钟脑肌类芳香烃受体核转位蛋白1 (BMAL1) 山羊子宫内膜上皮细胞(GEECs) 细胞凋亡

不同水文情景下白洋淀水体好氧反硝化菌群对水质因子的动态响应

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环境科学 2024年第6期45卷 3627-3637页

作者：孟佳靖张甜娜陈哲周石磊底怡玲武辰彬王晨光张家丰崔建升河北科技大学环境科学与工程学院河北省污染防治生物技术实验室石家庄050018

为探究不同水文情景下白洋淀水体好氧反硝化菌群的演变规律和驱动机制,基于水质调查和高通量测序技术,进行了水体水质因子分析、好氧反硝化菌群α多样性分析、物种组成和网络分析.结果表明,白洋淀水体呈弱碱性,丰水期水体T最高,DO最低,... 详细信息

为探究不同水文情景下白洋淀水体好氧反硝化菌群的演变规律和驱动机制,基于水质调查和高通量测序技术,进行了水体水质因子分析、好氧反硝化菌群α多样性分析、物种组成和网络分析.结果表明,白洋淀水体呈弱碱性,丰水期水体T最高,DO最低,冰封期T最低,DO最高.白洋淀水体在枯水期、丰水期、平水期和冰封期下NH_(4)^(+)-N、NO_(2)^(-)-N、NO_(3)^(-)-N、TN、高锰酸盐指数、Fe和Mn之间均存在显著差异(P0.05).不同水文情景下水体中最大的细菌门类为Proteobacteria,相对丰度较高的属为Magnetospirillum、Aeromonas、Pseudomonas、Azospirillum和Bradyrhizobium.此外,好氧反硝化菌群的α多样性均存在显著差异(P<0.001),冰封期菌群丰富度最高,枯水期和冰封期菌群的多样性和均匀度最高.经RDA、Mantel分析,菌群的水质驱动因子在不同水文情景下有所差异,枯水期菌群的水质驱动因子为p H、NO_(3)^(-)-N、NO_(2)^(-)-N和高锰酸盐指数,丰水期菌群的驱动因子为p H、T、DO、NO_(2)^(-)-N和TP,平水期的驱动因子为NO_(2)^(-)-N、Fe和高锰酸盐指数,冰封期菌群的驱动因子为NO_(3)^(-)-N和NO_(2)^(-)-N.网络分析表明与水质驱动因子相关的物种存在时间差异,枯水期与水质驱动因子相关的属为Magnetospirillum、Aeromonas和Azoarcus,与丰水期相关的属为Magnetospirillum、Pseudomonas和Aeromonas,与平水期相关的属为Magnetospirillum、Pseudomonas和Limnohabitans,与冰封期相关的属为Magnetospirillum、Azoarcus和Pseudomonas.不同水文情景关键水质因子(主要是T、DO、NO_(3)^(-)-N和高锰酸盐指数)与好氧反硝化菌群之间的关联关系,随着时间演变也在逐渐发生变化.综上,通过对不同水文情景下白洋淀水体好氧反硝化菌群演变特征及环境因子驱动机制进行研究,可为认识天然环境中好氧反硝化菌群演变机制提供依据.

关键词：好氧反硝化白洋淀水文情景网络分析水质因子

3D打印导板辅助坏死灶刮除联合陶瓷棒植入术治疗中早期股骨头坏死效果观察

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山东医药 2024年第8期64卷 54-58页

作者：郑文明袁伶俐张仲传梁英杰唐昊旭牛国旗蚌埠医学院第二附属医院骨科蚌埠医学院数字骨科重点实验室安徽蚌埠233002

目的观察3D打印导板辅助坏死灶刮除联合陶瓷棒植入术治疗中早期股骨头坏死的临床效果。方法中早期股骨头坏死患者40例(48髋),分为3D打印组20例(24髋)和对照组20例(24髋),3D打印组采用3D打印导板辅助坏死灶刮除联合陶瓷棒植入术;对照组... 详细信息

目的观察3D打印导板辅助坏死灶刮除联合陶瓷棒植入术治疗中早期股骨头坏死的临床效果。方法中早期股骨头坏死患者40例(48髋),分为3D打印组20例(24髋)和对照组20例(24髋),3D打印组采用3D打印导板辅助坏死灶刮除联合陶瓷棒植入术;对照组采用传统坏死灶刮除联合陶瓷棒植入术。比较两组围手术期指标(手术时间、术中透视次数、切口长度和手术出血量等),术前及术后3、6、12个月髋关节Harris评分,视觉模拟评分(VAS)及末次随访时股骨头存活率。结果3D打印组手术时间、术中透视次数及手术出血量少于对照组,手术切口长度长于对照组(P均0.05)。结论3D打印导板辅助坏死灶刮除联合陶瓷棒植入术治疗中早期股骨头坏死可准确定位坏死灶,有效缩短手术时间,减少X线透视次数和手术出血量,更有利于早期恢复。

关键词： 3D打印技术股骨头坏死导向模板坏死灶刮除术 β-磷酸三钙陶瓷棒植入术