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家蚕CRISPR/Cpf1基因编辑系统建立

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生物工程学报 2021年第12期37卷 4342-4350页

作者：董战旗秦琪张新铃李柯洁陈鹏潘敏慧西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室重庆400716 西南大学农业农村部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室重庆400716

自CRISPR/Cas9基因编辑系统成功应用于模式生物以来,因其快速、高效、便捷等特点,广泛应用于基因功能研究、基因治疗和基因工程等研究领域。与此同时,CRISPR/Cas系统不断在微生物界的发现也加速了新的基因编辑工具的不断涌现。CRISPR/C... 详细信息

自CRISPR/Cas9基因编辑系统成功应用于模式生物以来,因其快速、高效、便捷等特点,广泛应用于基因功能研究、基因治疗和基因工程等研究领域。与此同时,CRISPR/Cas系统不断在微生物界的发现也加速了新的基因编辑工具的不断涌现。CRISPR/Cpf1是第二类(Ⅴ型)能够编辑哺乳动物基因组的CRISPR系统,相比于CRISPR/Cas9基因编辑系统,能够利用5′T-PAM富集区增加基因组覆盖率,具有其切割位点为粘性末端和更不易同源重组修复等诸多优势。基于此,本研究构建了能够在家蚕细胞表达的3个不同来源的CRISPR/Cpf1 (AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1)表达载体,选择高度保守的家蚕热休克蛋白基因BmHSP60和家蚕ATP酶家族BmATAD3A基因分别设计靶标gRNA,构建gHSP60-266R和gATAD3A-346R基因编辑载体。通过T7E1酶切分析和T克隆测序,鉴定3个Cpf1基因编辑系统AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1对靶标基因BmHSP60和BmATAD3A的编辑效率。同时,利用Western blotting分析不同基因编辑系统敲除靶基因后对其BmATAD3A和BmHSP60蛋白翻译的影响。本研究成功构建了家蚕CRISPR/Cpf1基因编辑系统,能够在家蚕细胞中有效编辑家蚕基因组,为家蚕基因功能研究、基因工程和遗传育种开发了新技术与新方法。

关键词：家蚕基因编辑 CRISPR/Cpf1

家蚕热休克蛋白HSP60相互作用蛋白筛选与鉴定

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中国农业科学 2019年第2期52卷 376-384页

作者：董战旗蒋亚明潘敏慧西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室西南大学农业部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室

【目的】HSP60是热休克蛋白中重要的一员,在昆虫先天性免疫过程中起重要作用,同时也是昆虫生长发育的必要因子。前期研究证明家蚕BmHSP60参与家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)入侵细胞过程,本研究通过鉴定Bm... 详细信息

【目的】HSP60是热休克蛋白中重要的一员,在昆虫先天性免疫过程中起重要作用,同时也是昆虫生长发育的必要因子。前期研究证明家蚕BmHSP60参与家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)入侵细胞过程,本研究通过鉴定BmHSP60相互作用蛋白,为其在家蚕先天性免疫中作用机制研究打下基础。【方法】利用免疫共沉淀和银联-质谱分析技术(LC-MS/MS),首先构建BmHSP60过表达载体并融合Flag标签,转染到家蚕细胞中48 h后,收集蛋白,进行免疫共沉淀,用Flag抗体孵育磁珠调取相互作用蛋白,银染处理后,能够检测到明显的差异条带,把差异条带切胶保存在-80℃,然后质谱分析差异条带的多肽;根据质谱结果和差异条带的大小与NCBI数据库进行比对,筛选到候选相互作用蛋白。最后,构建候选相互作用蛋白的克隆载体并融合HA标签,分别和BmHSP60表达载体共转到家蚕细胞,免疫共沉淀和荧光共定位验证BmHSP60和候选蛋白之间的相互作用。并通过Mito-Tracker-Green分析BmHSP60候选相互作用蛋白与线粒体的共定位。【结果】免疫共沉淀银染结果显示BmHSP60相互作用蛋白在110、90、75、60和35 kD附近有5条明显的差异条带,将这5条条带混成蛋白池进行质谱分析,通过银联-质谱分析结果和家蚕基因组数据库以及NCBI数据库进行比对分析共鉴定到32个差异蛋白,根据多肽数量和蛋白分子量的大小共筛选到5个相互作用候选蛋白与银染结果差异条带一致,分别为ADP/ATP translocase(ANT)、Actin、Alpha-tubulin、Elongation factor 1-alpha(EF1α)和HSP90。构建BmHSP60候选相互作用蛋白克隆表达载体并融合HA标签,与BmHSP60共同转染到家蚕细胞,免疫共沉淀immunoprecipitated(IP)用α-Flag抗体孵育,immunoblotting(IB)再用α-Flag抗体孵育,均能够检测到BmHSP60表达。而IB用α-HA抗体孵育显示只有BmANT和BmHSP90能够检测到相应的条带,而Alpha-tubulin和EF1α与BmHSP60没有检测到相应的条带,说明只有BmANT和BmHSP90与BmHSP60具有直接的相互作用,而Alpha-tubulin和EF1α与BmHSP60没有相互作用。通过荧光共定位进一步分析表明BmANT和BmHSP90能够与BmHSP60共定位在细胞质中。线粒体标记物Mito-Tracker-Green共定位结果显示BmHSP60、BmANT和BmHSP90均能够与线粒体共定位到一起。【结论】鉴定到家蚕热休克蛋白BmHSP60能够与BmANT和BmHSP90相互作用,并共定位于线粒体,可用于研究BmHSP60在家蚕抗病毒免疫中的作用机制。

关键词：家蚕 BmHSP60 相互作用蛋白免疫共沉淀 BmANT1 BmHSP90

杆状病毒LEF-11蛋白自身相互作用关键区域的鉴定

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中国农业科学 2017年第20期50卷 4028-4035页

作者：蒋亚明董战旗陈婷婷胡楠董非凡黄亮唐良彤潘敏慧西南大学农业部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室重庆农业机械化学校

【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)是蚕业上最常见且危害最为严重的病原微生物之一,其晚期表达因子(late expression factor,lef)LEF-11对病毒的增殖具有重要作用,相关研究证明LEF-11蛋白能够发生... 详细信息

【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)是蚕业上最常见且危害最为严重的病原微生物之一,其晚期表达因子(late expression factor,lef)LEF-11对病毒的增殖具有重要作用,相关研究证明LEF-11蛋白能够发生自身相互作用形成寡聚体,本研究通过逐步截短探究LEF-11蛋白自身相互作用的关键区域。【方法】利用双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation)技术和荧光定位(fluorescent co-location)技术,首先根据Bm NVP lef-11及各个截短片段序列和荧光蛋白序列设计引物,通过PCR技术扩增回收得到所有片段以及荧光标签片段,并且通过限制性内切酶处理回收后,将荧光标签片段分别连接到昆虫细胞表达载体p IZ/V5-His上,构建p IZ-Ds Red和p IZ-EGFP质粒,然后用相同方法构建LEF-11全长和逐步截短的LEF-11红色荧光融合蛋白载体,分别与p IZ-LEF11-GFP共同转染到家蚕Bm N-SWU1细胞中,更换普通培养基48 h后固定细胞并制片,最后在荧光共聚焦显微镜下观察荧光融合蛋白表达及定位情况,鉴定LEF-11蛋白自身相互作用的关键区域;荧光双分子互补试验相关载体的构建步骤与荧光融合表达载体构建方法一致,转染处理及荧光观察方法也相同。【结果】杆状病毒LEF-11蛋白2—61和62—112端均能与LEF-11蛋白全长发生相互作用,分别共定位于细胞质和细胞核;逐步截短过程中,LEF-11蛋白N-端2—61、12—61、22—61、32—61、42—61和2—51均能与LEF-11蛋白全长共同定位于细胞质中,但其52—61、2—41未发生共定位;C-端截短片段能够与LEF-11蛋白全长发生共定位的有62—112、72—112、82—112、72—101和72—91,但92—112和72—81区域未发现共定位现象;双分子荧光互补试验结果验证LEF-11蛋白N-端片段与LEF-11蛋白全长相互作用的有2—61、12—61、22—61、32—61、42—61、2—51,而2—41、52—61截短突变体则不能,与N-端片段荧光共定位结果保持一致。【结论】鉴定到了杆状病毒LEF-11蛋白的42-51和82-91区域为其自身相互作用关键区域,可用于LEF-11相关功能研究。

关键词：家蚕 BmNPV LEF-11 双分子荧光互补自身相互作用

家蚕热休克蛋白HSP90相互作用蛋白的筛选与鉴定

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中国农业科学 2022年第6期55卷 1253-1262页

作者：龙艳碧吴云飞张倩陈鹏潘敏慧西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室西南大学农业农村部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室

【目的】HSP90 是热休克蛋白家族的成员之一，在昆虫的抗逆性和变态发育中发挥重要作用，已有研究表明 HSP90能够促进家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)的增殖，但作用机制尚不清楚。本研究通过鉴定 BmHSP90... 详细信息

【目的】HSP90 是热休克蛋白家族的成员之一，在昆虫的抗逆性和变态发育中发挥重要作用，已有研究表明 HSP90能够促进家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)的增殖，但作用机制尚不清楚。本研究通过鉴定 BmHSP90 的相互作用蛋白，为其促进 BmNPV 增殖的作用机制解析提供参考。【方法】构建连接在 pIZ/V5-His 的BmHSP90HA真核过表达载体，在家蚕 BmN-SWU1 细胞中转染 48 h 后，感染 BmNPV 继续培养 48 h 后收集蛋白，保留总蛋白后将这些蛋白均分两管，进行免疫共沉淀，分别用抗 HA 抗体和 IgG 抗体钓取相互作用蛋白，对蛋白胶进行硝酸银染色后，获取差异条带并做质谱分析，将质谱结果与信息分析结合进行候选互作蛋白筛选，并克隆鉴定互作蛋白。通过免疫荧光验证 HSP90 与互作蛋白的共定位情况，并进一步采用免疫共沉淀试验确定其是否存在相互作用关系。【结果】硝酸银染色结果显示，试验组与对照组在 90、70 和 60 kD 附近处存在差异条带，并验证了 90 kD 处的差异条带为诱饵蛋白；将另外两条差异带进行质谱分析，共鉴定到 7 个候选相互作用蛋白，通过分析选择其中两个候选蛋白作后续研究，分别为Tubulin-specific chaperone E(Tbce)和 Golgin subfamily A member 5(Golga5)。BmTbce 的最大开放阅读框长度为 1 728bp，编码 576 个氨基酸，BmGolga5 的最大开放阅读框长度为 1 854 bp，编码 618 个氨基酸；同源比对和系统进化树显示 BmTbce的微管结合结构域(cytoskeleton-associated protein-glycine-rich,CAP-Gly)位于 N 端且在不同物种之间保守性较高，BmGolga5 的跨膜区(transmembrane domain,TMD)位于 C 端，也较为保守；荧光共定位显示 BmHSP90 与 BmTbce 和 BmGolga5在细胞质中发生共定位，并进一步通过免疫共沉淀证明 BmHSP90HA和 BmTbceFlag、BmHSP90HA和 BmGolga5Flag具有相互作用关系。【结论】经过筛选与鉴定，在 BmNPV 感染家蚕细胞的过程中，与家蚕热休克蛋白 HSP90 发生相互作用的蛋白为 BmTbce 和BmGolga5。

关键词：家蚕家蚕核型多角体病毒 HSP90 Tbce Golga5

适合马铃薯块茎计算机断层扫描原位观察的栽培基质筛选

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园艺学报 2023年第5期50卷 1085-1094页

作者：谭杰刘建刚刘菊简银巧李广存金黎平徐建飞中国农业科学院蔬菜花卉研究所农业农村部薯类作物生物学和遗传育种重点实验室蔬菜生物育种全国重点实验室北京100081

土壤的不透明性阻碍了马铃薯块茎生长过程的直接可视化,而计算机断层扫描(Computed tomography,CT)技术可避免破坏性取样,实现植株地下生长过程实时连续观测。为了筛选马铃薯块茎CT成像效果好的栽培基质,对6种不同含水量基质的CT成像效... 详细信息

土壤的不透明性阻碍了马铃薯块茎生长过程的直接可视化,而计算机断层扫描(Computed tomography,CT)技术可避免破坏性取样,实现植株地下生长过程实时连续观测。为了筛选马铃薯块茎CT成像效果好的栽培基质,对6种不同含水量基质的CT成像效果、数据提取效果和植株生长状态进行了对比分析。结果显示,过筛草炭的植株地上部分生长状况最佳,过筛草炭、蛭石与过筛草炭混合两种类型基质中块茎干、鲜质量最高。除蛭石基质以外,其他基质成像效果均随含水量降低而改善,但基质含水量过低导致植株无法正常生长。相同含水量条件下,过筛草炭的扫描背景杂质最少、成像效果最佳,可获得更清晰的CT图像。因此,在适宜植株正常生长的含水量条件下,即20%左右含水量条件下,过筛草炭是适合CT扫描观测马铃薯块茎生长发育的栽培基质。

关键词：马铃薯块茎 CT 基质生长发育

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昆虫Notch信号通路研究进展

昆虫学报 2021年第2期64卷 250-258页

作者：杨曦陈鹏蒋霞潘敏慧鲁成西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室农业农村部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室重庆400715

Notch信号通路由Notch受体、Notch配体(DSL蛋白)、CSL[C promoter binding factor-1(CBF1),Suppressor of hairless(Su(H)),Lag-1]转录因子、其他效应子和Notch调节分子构成,在动物组织的发育和器官的细胞命运决定中起着基础性的作用。从1917年在果蝇Drosophilia中被发现以来,基于昆虫Notch信号通路的研究一直十分活跃,证实了其在昆虫中主要行使胚胎及器官的发育调控、细胞增殖及细胞周期调控等作用。Notch基因位点的突变能够导致果蝇在胚胎期死亡,且翅发生缺失;Notch胞内域(intracellular domain of Notch,NICD)的表达会影响果蝇、蟑螂等昆虫卵巢卵泡细胞的发育;Delta可以介导昆虫体节形成以及神经系统正常发育;Su(H)以转录因子的形式发挥功能,主要影响昆虫细胞的细胞周期进程;Fringe在果蝇、家蚕Bombyx mori等昆虫的翅发育过程中起关键作用。此外Notch信号通路与Hippo信号通路、Wnt信号通路和EGFR信号通路等存在相互作用,表明其不作为一个单线形式而是复杂的网络结构参与昆虫的生命进程。近年来对Notch信号通路的研究已经从昆虫扩展到人类重大疾病、肿瘤医学和分子治疗中。鉴于Notch信号通路的高度保守性,昆虫Notch信号通路的研究成果不仅对昆虫发育机制的解析起着关键作用,还可为其他动物的研究乃至人类疾病的研究提供重要的参考和新思路。

关键词：昆虫 Notch信号通路转录因子发育调控细胞增殖细胞周期

递增施用有机质对马铃薯产量及氮磷钾养分吸收利用的影响

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作物杂志 2024年

作者：阳新月向颖陈子恒林茜邓振鹏周克友李明聪王季春西南大学农学与生物科技学院薯类生物学与遗传育种重庆市重点实验室重庆市巫溪县农业技术推广中心

为探究有机质提升下马铃薯对土壤氮磷钾养分的吸收利用特点，采用中晚熟品种青薯9号，在两个基础肥力差异较大的试验点，通过施用有机肥增施有机质，设置不施有机质(T1)、有机质975 kg/hm2(T2)、有机质1950 kg/hm2(T3)、有机质2925 kg/h... 详细信息

为探究有机质提升下马铃薯对土壤氮磷钾养分的吸收利用特点，采用中晚熟品种青薯9号，在两个基础肥力差异较大的试验点，通过施用有机肥增施有机质，设置不施有机质(T1)、有机质975 kg/hm2(T2)、有机质1950 kg/hm2(T3)、有机质2925 kg/hm2(T4)和有机质3900 kg/hm2(T5)5个有机质用量处理，并设不施肥处理(T0)，研究有机质施用总量增加对土壤养分含量与微生物数量、马铃薯产量、干物质积累量和养分吸收利用情况的影响。结果表明，有机质量增加能有效提高土壤养分含量和土壤微生物数量；随着有机质施入量的增加，马铃薯产量、养分积累量以及养分利用率、肥料贡献率、肥料偏生产力与土壤细菌/真菌比率均呈现先增后减的趋势，且基础肥力较高试验点高于基础肥力较低试验点。在基础肥力较高的歇马试验点、基础肥力较低的尖山试验点分别施入有机质975 kg/hm2、1950 kg/hm2时其产量最佳，较T1处理分别增产11.84%、8.22%。综上，施入有机质对肥料利用率、偏生产力与肥料贡献率的作用更突出；土壤肥力较高时，马铃薯更有易于达到高产目标；施入过多或过少有机质均不利于马铃薯的营养吸收与产量形成。

关键词：马铃薯有机质氮磷钾养分养分吸收利用产量

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马铃薯遗传育种研究:现状与展望

中国农业科学 2017年第6期50卷 990-1015页

作者：徐建飞金黎平中国农业科学院蔬菜花卉研究所/农业部薯类作物生物学与遗传育种重点实验室

马铃薯是世界第三大粮食作物,马铃薯产业的可持续发展对保障世界和中国的粮食安全具有重要意义。优良品种是支撑马铃薯产业发展的基础。马铃薯经常遭受病虫害的侵袭和非生物胁迫,加工业的迅速发展和人们对食物营养的重视,迫切需要选育... 详细信息

马铃薯是世界第三大粮食作物,马铃薯产业的可持续发展对保障世界和中国的粮食安全具有重要意义。优良品种是支撑马铃薯产业发展的基础。马铃薯经常遭受病虫害的侵袭和非生物胁迫,加工业的迅速发展和人们对食物营养的重视,迫切需要选育出更抗病、更耐逆、更高产、更优质和专用的马铃薯新品种。培育一个优良马铃薯品种,种质资源是基础,重要性状的遗传学是理论指导,先进的育种技术是保障,完善的推广和栽培模式是支撑。世界范围内,保存了大约65 000份马铃薯种质资源,通过对种质资源抗病、抗逆和品质方面的系统评价,并应用多种资源利用技术,将三大类约17个野生种的种质导入到普通栽培种中,应用于育种和遗传学研究。利用纯合双单倍体材料作为测序对象,马铃薯基因组序列已经被揭示,预测出了39 031个蛋白编码基因,目前更多的种质资源正在被重测序以揭示更多的等位变异。马铃薯普通栽培品种是无性繁殖四倍体作物,具有四体遗传特性,尽管如此,许多植株发育和形态、块茎品质和抗病抗逆等重要性状的遗传特性基本明确,并定位和克隆了大量重要性状相关基因。目前,马铃薯育种技术主要涵盖传统育种技术、倍性育种技术、标记辅助选择育种技术、基因工程育种技术和新兴的基因组选择育种技术。中国马铃薯遗传育种研究队伍不断壮大,品种选育取得了重大进展。荷兰马铃薯遗传育种水平居于世界前列,合作育种模式推动了商业化育种。不断完善马铃薯综合育种技术,创新育种模式和机制,充分利用现有种质资源培育突破性、专用型品种将是未来马铃薯遗传育种发展的主要方向。

关键词：马铃薯育种遗传学现状展望

家蚕Sox家族基因BmDichaete的克隆与表达分析

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昆虫学报 2017年第5期60卷 513-522页

作者：杨基贵彭丽娜刘太行吴云飞杜国玉张倩王炜潘敏慧西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室重庆400716 西南大学农业部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室重庆400716

【目的】Sox家族是一类转录调控因子,在多细胞动物的发育过程中起到了极其重要的作用。本研究旨在获得家蚕Bombyx mori Sox家族基因,并分析其在幼虫不同组织和发育阶段的表达模式及功能。【方法】采用cDNA末端快速扩增方法(rapid amplif... 详细信息

【目的】Sox家族是一类转录调控因子,在多细胞动物的发育过程中起到了极其重要的作用。本研究旨在获得家蚕Bombyx mori Sox家族基因,并分析其在幼虫不同组织和发育阶段的表达模式及功能。【方法】采用cDNA末端快速扩增方法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆家蚕Sox家族基因,并对其序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体,诱导原核表达并得到其蛋白的多克隆抗体,并以Western blot验证其蛋白在家蚕胚胎发育时期(产卵后24,48,72,96,120,144,168,192和216 h)和蚁蚕的表达特征。同时,使用半定量RT-PCR技术分析这一基因在家蚕整个发育过程以及5龄第3天幼虫不同组织(精巢、卵巢、神经节、头部、丝腺、脂肪体、马氏管、中肠、后肠、表皮、血液、气管)中的表达谱。【结果】克隆获得一个家蚕Sox家族基因,将其命名为BmDichaete(Gen Bank登录号:KY914554),其cDNA序列全长为1 541 bp,开放阅读框长741 bp,编码246个氨基酸,预测分子量大小为27.3 kD,等电点为9.89。同源序列比对和系统进化分析显示,BmDichaete具有Sox家族的典型HMG结构域,并与其他鳞翅目昆虫的Dichaete蛋白具有较高的同源性。对其表达模式分析发现,BmDichaete在家蚕整个发育时期都有表达,从胚胎发育后期到蛹前期持续高表达,在蛹后期及成虫期表达量有所下降,并且该基因在家蚕5龄第3天幼虫的卵巢、头部、丝腺及后肠组织中显著高表达。Western blot分析结果显示,BmDichaete在家蚕胚胎发育过程中持续而稳定地表达。【结论】家蚕BmDichaete具有典型HMG结构域,属于Sox家族成员。BmDichaete在家蚕胚胎发育的各个时期都发挥作用。本研究为进一步探索该基因在家蚕中的功能奠定了基础。

关键词：家蚕 BmDichaete 序列分析原核表达表达谱胚胎发育