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EIF4A3 shRNA慢病毒载体的构建及其稳定转染细胞系的建立

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吉林大学学报（医学版） 2024年第3期50卷 831-839页

作者：何嘉文李友廖科棋李胜男广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室广东湛江524002 广东医科大学附属医院神经病学研究所广东湛江524002

目的:构建真核细胞翻译起始因子4A3(EIF4A3)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,建立Neuro-2a-EIF4A3-shRNA稳定转染细胞系。方法:通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库检索EIF4A3基因序列,设计并合成PCR鉴定引物,并将其连接至经EcoRⅠ和... 详细信息

目的:构建真核细胞翻译起始因子4A3(EIF4A3)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,建立Neuro-2a-EIF4A3-shRNA稳定转染细胞系。方法:通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库检索EIF4A3基因序列,设计并合成PCR鉴定引物,并将其连接至经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒GV493载体,构建GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒质粒,PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。将GV493空载质粒和GV493-EIF4A3-shRNA重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,分别为GV493对照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为空白组、GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组,空白组不作处理,GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组分别采用相应慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,使用10 mg·L-1嘌呤霉素筛选成功感染慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞的生长状态和绿色荧光表达情况;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中EIF4A3 mRNA及蛋白表达水平。结果:PCR测序结果显示GV493-EIF4A3-shRNA重组质粒基因序列与设计合成的EIF4A3-shRNA序列一致,成功构建GV493-EIF4A3慢病毒载体。荧光显微镜观察可见HEK293T细胞荧光表达强烈,生长状态良好,慢病毒包装成功。GV493-对照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒的滴度均为2×10~8 TU·mL^(-1),GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组Neuro-2a细胞生长状态良好且表达绿色荧光,表明慢病毒感染稳定细胞系构建成功。RT-qPCR法,与空白组和GV493对照组比较,GV493-EIF4A3shRNA组Neuro-2a细胞EIF4A3mRNA表达水平明显降低(P系,为EIF4A3在颅内动脉粥样硬化的作用机制研究提供了参考。

关键词：真核细胞翻译起始因子4A3 短发夹RNA 慢病毒稳定转染细胞系 Neuro-2a细胞

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43例中国儿童Ⅰ型唾液酸沉积症眼部与神经系统表现相关性的meta分析

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中华眼底病杂志 2024年第1期40卷 52-57页

作者：左华欣周晓芳任晓暾施维李莉余继锋彭春霞首都医科大学附属北京儿童医院眼科国家儿童医学中心北京100045 首都医科大学附属北京儿童医院神经内科国家儿童医学中心北京100045 江西省儿童医院眼科南昌330006

目的探讨中国儿童Ⅰ型唾液酸沉积症(SD)眼底"樱桃红斑"(CS)与神经系统表现的相关性。方法循证医学研究。以"中国"、"唾液酸沉积症"、"Sialidosis"、"Sialidoses"、"China"为中英文检索词,在中国知网、万方科技期刊全文数据库、美国国立... 详细信息

目的探讨中国儿童Ⅰ型唾液酸沉积症(SD)眼底"樱桃红斑"(CS)与神经系统表现的相关性。方法循证医学研究。以"中国"、"唾液酸沉积症"、"Sialidosis"、"Sialidoses"、"China"为中英文检索词,在中国知网、万方科技期刊全文数据库、美国国立医学图书馆医学数据库PubMed进行检索。病例均来自中国且符合Ⅰ型SD诊断标准。根据眼底检查有(+)无(-)CS表现,将患儿分为CS+组、CS-组。采用RevMan 5.3软件对眼底CS发生与神经系统表现的相关性进行统计学分析。结果根据检索策略初步检索出68篇文献,最终纳入17篇文献进行分析;对其中同时纳入CS+、CS-患儿的5篇文献进行meta分析。共纳入SD患儿43例。其中,男性28例,女性15例;发病年龄中位数12岁。视力下降、眼底CS分别为37(90.2%,37/41;无记录2例)、24(55.8%,24/43)例;肌阵挛、共济失调、癫痫分别为42(97.7%,42/43)、39(95.1%,39/41;无记录2例)、32(91.4%,32/35;无记录8例)例。42例为NEU1基因突变所致,1例无记录。CS+组、CS-组癫痫发作分别为20(100.0%,20/20)、12(80.0%,12/15)例,CS+组癫痫发生率较CS-组明显增高。Meta分析结果显示,CS+组、CS-组患儿肌阵挛或共济失调[相对危险度(RR)=1.13,95%可信区间(CI)0.79~1.63,P=0.49]、癫痫(RR=1.13,95%CI 0.84~2.06,P=0.24)发生率比较,差异均无统计学意义。结论中国人群儿童Ⅰ型SD眼底CS发生率为55.8%;其与神经系统表现无相关性,但伴CS者癫痫发生率明显高于不伴CS者。

关键词：唾液酸沉积症樱桃红斑中国儿童共济失调诊断价值 Meta分析

TWNK基因突变致慢性眼外肌麻痹一家系的临床及遗传学分析

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国际神经病学神经外科学杂志 2024年第3期51卷 18-21页

作者：李楠胡静赵哲沈宏锐邴琪郭璇河北医科大学第三医院神经内科二病区(神经肌肉病科) 河北石家庄050000

慢性进行性眼外肌麻痹是线粒体病的一种表型,以上睑下垂或眼球活动障碍为特征。该文报道一个TWNK基因突变导致的线粒体病家系的临床和遗传学分析。先证者为32岁女性,因“双眼睑下垂10余年”就诊于河北医科大学第三医院神经肌肉病科,仅... 详细信息

慢性进行性眼外肌麻痹是线粒体病的一种表型,以上睑下垂或眼球活动障碍为特征。该文报道一个TWNK基因突变导致的线粒体病家系的临床和遗传学分析。先证者为32岁女性,因“双眼睑下垂10余年”就诊于河北医科大学第三医院神经肌肉病科,仅表现为眼睑下垂、轻度眼外肌麻痹。临床诊断为“慢性进行性眼外肌麻痹”。其家族中也存在类似病例。为明确致病基因,对先证者进行高通量测序及致病变异筛查。根据临床表型与基因测序结果,确定了TWNK基因的一个杂合突变位点(c.1411T>G,p.Y417D)作为候选致病基因。进一步采用Sanger测序法对先证者及其家系成员进行验证,确认了该突变位点的存在。根据美国医学遗传学与基因组学学会遗传变异分类标准与指南,该变异判定为致病变异(PVS1+PM2+PP3),且该位点在国内尚无报道。该研究不仅拓展了TWNK基因的变异谱,还为线粒体病家系的遗传咨询与分子诊断提供了参考依据。

关键词：眼外肌麻痹常染色体显性遗传 TWNK基因线粒体病

妊娠期有症状泌尿系结石导致的脓毒血症的研究进展

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临床医学进展 2024年第4期14卷 2460-2468页

作者：李林斌宋光鲁新疆医科大学第一附属医院泌尿外科新疆乌鲁木齐

妊娠期有症状泌尿系结石是产科患者住院最常见的非产科指征之一,而妊娠期有症状泌尿系结石导致的脓毒血症可显著增加孕产妇发病率和死亡率。妊娠期有症状泌尿系结石导致的脓毒血症是一种严重的疾病,多因妊娠期特殊的生理改变诱导结石的... 详细信息

妊娠期有症状泌尿系结石是产科患者住院最常见的非产科指征之一,而妊娠期有症状泌尿系结石导致的脓毒血症可显著增加孕产妇发病率和死亡率。妊娠期有症状泌尿系结石导致的脓毒血症是一种严重的疾病,多因妊娠期特殊的生理改变诱导结石的发生与妊娠前上尿路“安静”结石延续所致。通常以腰部胀痛为主,合并上尿路感染者较多,部分发展成肾积脓、败血症。妊娠期黄体酮分泌增加,输尿管生理性扩张积水、局部免疫力及内脏神经敏感性降低,痛阈及易感性升高,处理不当会导致持续肾绞痛、肾功能持续性损害、感染性休克、胎膜早破、早产、流产、死胎等并发症,对孕妇和胎儿造成严重危害;如何选择兼顾孕妇与胎儿安全性的诊疗方法,长期困扰着泌尿外科与产科医生。尽管近年输尿管软镜与钬激光的出现,为妊娠期输尿管结石治疗带来了机会,但是否及时引入放射性检查与介入性诊疗操作还是存在较多争议。妊娠合并输尿管结石近年报道逐渐增多,发病年龄平均27岁左右,80%~90%发生在妊娠中期(12~28周)及晚期(>28周);经产妇发生率为初产妇4倍,两侧发生率几乎相同,发生率是肾结石的2倍;孕前有结石病史者占24%~30%;“结石带地区”如美国南部、中国南方的发生率相对较高,主要为草酸钙和感染性结石;总体发病率约为1/1500,与非妊娠期输尿管结石发病率比较没有显著性差异,说明妊娠状态并不增加输尿管结石的发病率。由于妊娠期输尿管解剖及生理的改变,同时考虑到对胎儿的潜在危险性,临床上对于妊娠期输尿管结石的诊断及治疗存在较大困难,一直以来对泌尿外科、产科以及影像科医师来说是一个棘手的问题。因此,我们将通过最新文献从病因、危险因素、诊断方法、并发症及治疗方法等方面对妊娠期有症状泌尿系结石导致脓毒血症进行阐述。

关键词：妊娠期有症状泌尿系结石脓毒症危险因素诊断治疗预防

锰对人源性脉络丛乳头状瘤细胞系合成GDF-15的影响及机制研究

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毒理学杂志 2024年第3期38卷 207-214,242页

作者：张雨张国艳李子南田永吉宁钧宇洪昭雄高珊谭壮生敬海明李国君首都医科大学公共卫生学院北京100069 北京市疾病预防控制中心食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室北京100013 首都医科大学附属北京天坛医院小儿神经外科北京100070 美国国立卫生环境健康研究所神经生物学实验室德汉姆北卡州27709

目的应用人源性脉络丛乳头状瘤细胞系(hCPP)探究锰对脑脉络丛上皮细胞中生长分化因子-15(growth differentiation factor-15,GDF-15)合成的影响及其调控机制。方法应用CCK-8试剂盒检测氯化锰(以下简称锰)处理后hCPP的细胞活力;不同浓度... 详细信息

目的应用人源性脉络丛乳头状瘤细胞系(hCPP)探究锰对脑脉络丛上皮细胞中生长分化因子-15(growth differentiation factor-15,GDF-15)合成的影响及其调控机制。方法应用CCK-8试剂盒检测氯化锰(以下简称锰)处理后hCPP的细胞活力;不同浓度的锰(25、50、75、100、150和200μmol/L)处理hCPP细胞24、48和72 h,通过Western blot、Real-Time PCR检测GDF-15蛋白表达和Gdf-15 mRNA水平在锰作用下的剂量和时间-效应关系。给予hCPP细胞100μmol/L的锰处理24 h,通过Western blot检测p38 MAPK、NF-κB、AMPK、PI3K/AKT通路的激活情况,随后,给予相应的通路抑制剂后检测GDF-15的蛋白表达。100μmol/L的锰处理hCPP细胞0、6、12、24、36、48、72 h,检测GDF-15、p38 MAPK蛋白表达的时间-效应关系。使用荧光探针试剂盒检测hCPP锰处理(100μmol/L,24 h)后细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量,给予ROS抑制剂N-acetylcysteine(NAC)后检测GDF-15、p38 MAPK蛋白表达。结果用200μmol/L以下的不同浓度的锰处理hCPP细胞24、48和72 h,可引起细胞活力降低、GDF-15蛋白合成增加、Gdf-15 mRNA水平增加,且随锰浓度的增高而变化。100μmol/L的锰处理hCPP细胞24 h,通过增加p38 MAPK、NF-κB p65和AMPKα的磷酸化水平激活p38 MAPK、NF-κB和AMPK信号通路,给予SB 202190(p38 MAPK通路抑制剂)可逆转锰处理hCPP引起的GDF-15合成增加效应。100μmol/L的锰处理hCPP细胞0、6、12、24、36、48和72 h,GDF-15蛋白水平和p38 MAPK磷酸化蛋白水平随着锰处理时间的增加而增高。100μmol/L的锰处理hCPP细胞15、30、60 min以及24 h,细胞ROS水平与对照组相比差异无统计学意义,给予NAC处理不能逆转锰引起的GDF-15合成增加及p38 MAPK通路的激活状态。结论本研究表明,锰处理可增加hCPP细胞中GDF-15的合成,这可能是p38 MAPK信号通路激活后介导的。这些发现为今后阐明GDF-15在锰所致中枢神经系统的毒性效应及分子机制提供了新的线索和科学依据。

关键词：生长分化因子-15(GDF-15) 氯化锰脉络丛人源性脉络丛乳头状瘤细胞系(hCPP) p38 MAPK信号通路

NPC1基因复合杂合突变致尼曼-匹克病C型一家系

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中华神经科杂志 2023年第9期56卷 986-991页

作者：李海江唐春艳钟莲梅昆明医科大学第一附属医院神经内科、云南省神经系统疾病临床医学研究中心昆明650032

目的报道NPC1基因新发复合杂合突变致尼曼-匹克病C型一家系的临床及遗传学特点,提高临床医师对该病的认识水平。方法对云南省昆明医科大学第一附属医院神经内科2020年收治的1个非近亲结婚家系中的2例患者进行详细的神经科体格检查,提取... 详细信息

目的报道NPC1基因新发复合杂合突变致尼曼-匹克病C型一家系的临床及遗传学特点,提高临床医师对该病的认识水平。方法对云南省昆明医科大学第一附属医院神经内科2020年收治的1个非近亲结婚家系中的2例患者进行详细的神经科体格检查,提取外周血DNA,应用二代测序技术对患者进行全外显子测序,结合Sanger测序对患者家系进行一代验证,应用软件对突变位点进行分析。结果该家系呈常染色体隐性遗传,2例患者的发病年龄不同,先证者9岁起病,主要表现为:构音不良、吞咽困难、认知障碍、共济失调、双侧锥体束损害、垂直核上凝视麻痹和脾脏肿大。先证者弟弟临床表型与患者相似,但比患者更为严重,发病年龄更早,婴幼儿期发病,伴有严重的精神运动发育迟缓。全外显子组测序结果显示,两兄弟均携带NPC1基因的两种罕见变异:c.352_353del,***119ValfsTer8和c.593A>G,***198Ser。Sanger测序验证结果提示复合杂合突变分别来源于先证者的父母。根据美国医学遗传学与基因组学学会指南,上述变异评级分别为致病和疑似致病变异。该家系患者携带的c.593A>G,***198Ser变异为未报道的新变异。先证者从症状出现开始延迟诊断7年,服用麦格司他1年后吞咽困难、共济失调及眼球垂直运动障碍等症状有明显的好转。结论该家系患者的临床表型符合尼曼-匹克病C型的临床表型,NPC1基因复合杂合突变(c.352_353del和c.593A>G)为该家系的遗传学病因。

关键词：尼曼-匹克病,C型 NPC1基因脾大基因变异

以痉挛性截瘫为首发症状的早发型家族性阿尔茨海默病3型一家系

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中国现代神经疾病杂志 2023年第9期23卷 853-858页

作者：李海江王朝东首都医科大学宣武医院神经内科北京100053 昆明医科大学第一附属医院神经内科 650032

目的总结以痉挛性截瘫为首发症状的早发型家族性阿尔茨海默病(EOFAD)3型一家系临床表现及基因变异特征。方法与结果首都医科大学宣武医院2021年3月30日收治1例以痉挛性截瘫为首发症状的29岁男性患者,头部MRI显示双侧额叶皮质下和颞叶多... 详细信息

目的总结以痉挛性截瘫为首发症状的早发型家族性阿尔茨海默病(EOFAD)3型一家系临床表现及基因变异特征。方法与结果首都医科大学宣武医院2021年3月30日收治1例以痉挛性截瘫为首发症状的29岁男性患者,头部MRI显示双侧额叶皮质下和颞叶多发缺血灶,胸椎MRI呈轻度萎缩性改变。追问病史,患者之父首发症状与之相似且迅速进展,表现为痉挛性瘫痪、言语障碍、认知功能障碍和精神行为异常,发病至死亡时间7年,呈相对恶性病程。全外显子组测序(WES)显示患者存在PSEN1基因外显子7 c.668A>G(***223Arg)错义突变,经Sanger测序验证其母和其姐未携带该变异,推测该变异源自其父,根据美国医学遗传学和基因组学会分级该突变位点为可能致病。患者诊断为痉挛性截瘫,该家系诊断为EOFAD3型家系。结论PSEN1基因外显子7 c.668A>G(***223Arg)错义突变为该家系致病性变异,导致以痉挛性截瘫为首发症状的罕见EOFAD3型,详细的家系调查结合WES测序有助于提高疾病诊断率。

关键词：阿尔茨海默病截瘫基因突变误义系谱

脑卒中呼吸系统感染患者气道管理的最佳证据总结

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中华护理杂志 2023年第1期58卷 31-38页

作者：郭桂华许小明王海靓刘宁遵义医科大学珠海校区护理系珠海市519000 珠海市中西医结合医院神经外科

目的检索、评价和整合脑卒中呼吸系统感染患者气道管理的最佳证据,为临床护理实践提供参考。方法使用计算机检索BMJ最佳临床实践、Best Practice、UpToDate、世界卫生组织官网、国际指南协作网、澳大利亚乔安娜布里格斯研究所循证卫... 详细信息

目的检索、评价和整合脑卒中呼吸系统感染患者气道管理的最佳证据,为临床护理实践提供参考。方法使用计算机检索BMJ最佳临床实践、Best Practice、UpToDate、世界卫生组织官网、国际指南协作网、澳大利亚乔安娜布里格斯研究所循证卫生保健中心数据库、美国国立指南库、加拿大安大略注册护士协会网站、英国国家卫生与临床优化研究所指南网、苏格兰院际指南网、澳大利亚临床实践指南数据库、新西兰指南工作组、医脉通、Embase、the Cochrane Library、PubMed、中国知网、万方数据库、维普数据库、中国生物医学文献数据库等网站,检索关于脑卒中呼吸系统感染患者气道管理的最佳临床实践、指南、专家共识、证据总结、系统评价、Meta分析、随机对照试验。检索时限为2017年1月1日—2022年5月20日。由2名研究员对纳入的文献进行评价,并对符合质量标准的文献进行证据提取。结果共纳入20篇文献,包括2篇临床决策、8篇指南、4篇专家共识、3篇证据总结、1篇系统评价、2篇随机对照试验,从预防管理、气道吸引、气道湿化、管道护理、切口护理和撤机管理6个方面形成29条最佳证据。结论该研究总结了脑卒中呼吸系统感染患者气道管理的最佳证据,为医护人员提供循证依据,建议医护人员根据临床情景应用证据,完善气道管理的护理措施。

关键词：脑卒中呼吸系统感染气道管理证据总结循证护理学

超敏C反应蛋白和随机血糖与青年卒中患者预后的关系研究

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中国全科医学 2022年第29期25卷 3627-3634页

作者：贾娇坤刘艳芳郭加欢赵性泉首都医科大学附属北京天坛医院神经病学中心北京市100070

背景青年卒中可导致长期残疾,造成沉重的社会、家庭负担。研究认为超敏C反应蛋白(hs-CRP)和应激性血糖升高可增加缺血性卒中发生及其预后不良等风险,但截至目前,尚缺乏青年卒中人群的研究证据。目的分别探讨hs-CRP和随机血糖与青年卒中... 详细信息

背景青年卒中可导致长期残疾,造成沉重的社会、家庭负担。研究认为超敏C反应蛋白(hs-CRP)和应激性血糖升高可增加缺血性卒中发生及其预后不良等风险,但截至目前,尚缺乏青年卒中人群的研究证据。目的分别探讨hs-CRP和随机血糖与青年卒中患者神经功能缺损及长、短期预后的关系。方法回顾性选取2019—2021年首都医科大学附属北京天坛医院神经病学中心收治的发病72 h内到院的18~45岁首次缺血性卒中患者。收集患者的人口学信息、危险因素、实验室结果、并发症等。根据hs-CRP四分位数将患者分为4组,即Q1组(n=160)、Q2组(n=156)、Q3组(n=157)、Q4组(n=157);又根据随机血糖四分位数将患者分为4组,即q1组(n=158)、q2组(n=158)、q3组(n=157)、q4组(n=157)。以出院时美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分>4分作为神经功能缺损标准,出院时改良Rankin量表(mRS)评分2~5分作为短期预后不良标准,90 d mRS评分2~5分作为长期预后不良标准。采用多因素Logistic回归分析探讨hs-CRP、随机血糖与神经功能缺损、短期预后不良、长期预后不良的关系。结果630例患者中神经功能缺损154例(24.4%),短期预后不良217例(34.4%),长期预后不良144例(22.9%)。Logistic回归分析结果显示,与Q1组相比,Q3组和Q4组神经功能缺损〔OR=2.86,95%CI(1.56,5.22);OR=2.99,95%CI(1.63,5.50)〕、短期预后不良〔OR=2.14,95%CI(1.25,3.66);OR=2.80,95%CI(1.62,4.83)〕、长期预后不良〔OR=3.17,95%CI(1.67,6.01);OR=3.61,95%CI(1.90,6.86)〕的发生风险均增加(P系感染及感染性腹泻人群后仍得到一致结果。结论hs-CRP>1.18 mg/L是青年卒中患者长、短期预后不良及出院时神经功能缺损的危险因素。随机血糖>5.56 mmol/L与青年卒中患者长期预后不良相关,随机血糖>7.01 mmol/L与青年卒中患者短期预后不良相关,而与出院时神经功能缺损无关。

关键词：卒中青年人超敏C反应蛋白随机血糖神经功能缺损预后