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差异显示反转录PCR技术研究进展

生物化学与生物物理进展 2000年第1期27卷 28-32页

作者：赵锦荣阎小君苏成芝第四军医大学基因诊断技术应用研究所西安710033

分析一对细胞或组织在不同状态下基因表达的差异,已成为分子生物学研究领域的热点之一.近年来,用于识别差异表达基因的方法已发展起来多种.DDRTPCR是近年来较为广泛应用的一种技术.理论上,DDRTPCR技术比较简单,但实施起来却存在着假阳... 详细信息

分析一对细胞或组织在不同状态下基因表达的差异,已成为分子生物学研究领域的热点之一.近年来,用于识别差异表达基因的方法已发展起来多种.DDRTPCR是近年来较为广泛应用的一种技术.理论上,DDRTPCR技术比较简单,但实施起来却存在着假阳性率高,凝胶中单条cDNA带成分不均一,所获cDNA仅代表着mRNA3′UT区(约300bp)以及一些低拷贝数mRNA不能有效被呈现等问题.对DDRTPCR技术的改良也主要集中在解决这些问题方面.

关键词： mRNA 差异显示 DDRT-PCR 分子生物学生物技术

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高通量apoE基因分型技术的建立及应用

中华医学遗传学杂志 2005年第1期22卷 61-64页

作者：张文红白玉杰王琰李丁阎小君第四军医大学基因诊断技术应用研究所西安710032

目的建立一种准确、快速、高通量的apoE基因分型技术。方法从外周血样品提取基因组DNA,PCR扩增覆盖第112和158密码子的apoE基因片段;构建apoE基因片段重组质粒,并进行定点诱变,以得到3种等位基因型的对照样品;PCR产物消化处理,以除去残... 详细信息

目的建立一种准确、快速、高通量的apoE基因分型技术。方法从外周血样品提取基因组DNA,PCR扩增覆盖第112和158密码子的apoE基因片段;构建apoE基因片段重组质粒,并进行定点诱变,以得到3种等位基因型的对照样品;PCR产物消化处理,以除去残余的引物和dNTPs;进行模板指导的荧光染料标记终止碱基的掺入反应,应用荧光偏振检测仪分析荧光偏振值的变化;检测79例阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)患者和63名健康老年人的apoE基因型,分析基因型与AD易感性之间的关系。结果对分析结果进行测序验证,表明模板指导的荧光染料标记终止碱基掺入-荧光偏振检测技术分析结果与测序结果完全相符。AD组和健康对照组样品的基因分型结果提示apoEε4等位基因是迟发型AD的危险因素。结论应用此技术进行apoE基因多态性的基因分型分析,具有准确、简易和高通量等优势,可以作为AD风险分析的一种新技术,也适于apoE基因与其他疾病相关性研究时的大规模基因筛查分析。

关键词： apoE基因分型技术基因分型掺入荧光偏振等位基因型高通量碱基 PCR产物测序

用单表位合成肽抗原荧光偏振免疫法检测抗幽门螺旋杆菌尿素酶的抗体

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细胞与分子免疫学杂志 2005年第3期21卷 371-374页

作者：张文红王琰郭慧芳白玉杰阎小君第四军医大学基因诊断技术应用研究所陕西西安710032

目的:应用单表位合成肽抗原,建立一种新的基于荧光偏振技术(fluorescencepolarization,FP)的抗体检测方法。方法:用幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori,Hp)尿素酶B(UreB)的单表位合成分支肽抗原免疫小鼠,以ELISA法分析免疫的效果。分析FIT... 详细信息

目的:应用单表位合成肽抗原,建立一种新的基于荧光偏振技术(fluorescencepolarization,FP)的抗体检测方法。方法:用幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori,Hp)尿素酶B(UreB)的单表位合成分支肽抗原免疫小鼠,以ELISA法分析免疫的效果。分析FITC标记的合成肽抗原在不同浓度时的FP值,用FP技术分析抗原表位的抗原性以及不同稀释比例的血清样品对FP检测的影响。分别应用FPIA法和ELISA法,对126例样品进行Hp感染检测,对FPIA的检测数据进行受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve,ROC)分析。结果:UreB的单表位抗原肽具有较强的抗原性和免疫原性;1.0nmol/L的FITC标记肽可用于FPIA检测,血清样品做1∶25稀释时可明显区分阳性和阴性检测结果。与ELISA方法检测的结果相比较,用基于UreB单表位合成肽抗原的FPIA法检测Hp感染的灵敏度为85.7%,特异度为98%。结论:应用UreB单表位合成肽抗原,可对抗UreB的抗体进行快速FPIA检测,用此法检测抗体在疾病的临床诊断中具有广阔的应用前景。

关键词：抗原表位合成肽荧光偏振幽门螺旋杆菌尿素酶B

CGGBP1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化

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第四军医大学学报 2007年第12期28卷 1119-1121页

作者：杨芳张文红薛莉王琰夏琳白玉杰第四军医大学全军基因诊断技术应用研究所

目的:对人CGGBP1蛋白进行原核表达及纯化,为进一步研究CGGBP1的生物功能奠定基础.方法:构建原核表达载体pRSETA/CGGBP1.在大肠杆菌BL21中诱导表达人CGGBP1蛋白,经Ni2+-NTA亲和层析纯化,利用链酶亲和素磁珠鉴定所表达纯化的蛋白能否和d(C... 详细信息

目的:对人CGGBP1蛋白进行原核表达及纯化,为进一步研究CGGBP1的生物功能奠定基础.方法:构建原核表达载体pRSETA/CGGBP1.在大肠杆菌BL21中诱导表达人CGGBP1蛋白,经Ni2+-NTA亲和层析纯化,利用链酶亲和素磁珠鉴定所表达纯化的蛋白能否和d(CGG)29重复序列双链DNA特异性结合.结果:诱导后表达得到CGGBP1蛋白,纯化得到的可溶性表达产物CGGBP1蛋白可以和d(CGG)29重复序列双链DNA特异性结合.结论:表达并纯化得到可溶性CGGBP1蛋白,为进一步研究CGGBP1的结构与功能奠定了必要的基础.

关键词： ICGGBPl 基因表达纯化

甲基化特异性PCR检测FMR1和XIST基因甲基化实验方法的建立

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中国生物化学与分子生物学报 2006年第11期22卷 914-918页

作者：杨芳赵新张文红薛丽王琰白玉杰第四军医大学基因诊断技术应用研究所第四军医大学唐都医院西安710032

建立一种快速、灵敏的检测脆性X智障基因(fragile X mental retardation,FMR1)、X染色体失活基因(Xchromosome inactivation,XIST)甲基化的方法.用亚硫酸氢钠和对苯二酚对基因组DNA进行脱氨基修饰.以修饰后的DNA为模板,用两套不同的引物... 详细信息

建立一种快速、灵敏的检测脆性X智障基因(fragile X mental retardation,FMR1)、X染色体失活基因(Xchromosome inactivation,XIST)甲基化的方法.用亚硫酸氢钠和对苯二酚对基因组DNA进行脱氨基修饰.以修饰后的DNA为模板,用两套不同的引物对:1对甲基化特异性引物和1对非甲基化特异性引物扩增FMR1基因(CGG)n重复序列区、FMR1和XIST基因的启动子区.PCR产物进一步克隆、测序.以亚硫酸氢钠和对苯二酚脱氨基修饰后的DNA为模板进行PCR扩增后的产物与预期基因目的基因片段大小相符合,无非特异性扩增产物.测序结果表明,FMR1、XIST基因中的非甲基化的C碱基转变为U碱基,而CpG岛被甲基化的C碱基不改变.成功地建立了检测FMR1、XIST甲基化的方法,为实验室诊断脆性X综合征提供了新的方法.

关键词：脆性X智障基因 X染色体失活基因甲基化特异性PCR 甲基化检测

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UreB蛋白B细胞抗原表位快速筛选与鉴定

生物化学与生物物理进展 2006年第1期33卷 83-86页

作者：郭慧芳张文红温冬青韩锋产张虎明罗进阎小君第四军医大学全军基因诊断技术研究所国家肿瘤生物学重点实验室西安710032

以幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori,Hp)主要抗原蛋白尿素酶B(ureaseB,UreB)为靶蛋白,建立一种新的B细胞抗原表位筛选与鉴定方法.运用Fmoc固相肽合成法合成11条HpUreB蛋白的单表位抗原肽片段,在其氨基端标记FITC荧光素,应用荧光偏振方法... 详细信息

以幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori,Hp)主要抗原蛋白尿素酶B(ureaseB,UreB)为靶蛋白,建立一种新的B细胞抗原表位筛选与鉴定方法.运用Fmoc固相肽合成法合成11条HpUreB蛋白的单表位抗原肽片段,在其氨基端标记FITC荧光素,应用荧光偏振方法(fluorescencepolarization,FP)快速鉴定这些肽片段的抗原性,并通过FP法在大规模样品中快速筛选相应抗体滴度高、分布人群广的优势抗原表位肽.结果表明,合成的11条UreB蛋白线性抗原肽中,10条具有较强的抗原性,其中No.2、No.5和No.11抗原肽相应的特异性抗体在感染Hp的人群中分布较广,抗体滴度较高,为UreB的优势抗原表位肽.对抗原表位进行多参数综合分析与设计,通过FP技术快速鉴定抗原肽,并筛选优势抗原表位肽,对于疾病的抗原表位谱研究具有重要的意义,同时在疾病的诊断、分型及治疗中具有重要的应用前景.

关键词：抗原表位尿素酶B 抗原性鉴定筛选荧光偏振

宫颈癌与HLA等位基因DQB1＊03、DR15的相关性研究

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第四军医大学学报 2004年第24期25卷 2264-2266页

作者：夏琳张菊陈中灿白玉杰罗进杨浩阎小君第四军医大学科研部全军基因诊断技术研究所陕西西安710033

目的 :探讨我国陕西地区宫颈癌的发生与人类白细胞抗原 (HLA) DQB1 0 3、DR15等位基因的相关性 .方法 :采用序列特异性引物的聚合酶链式反应 (PCR SSP)方法 ,扩增HLA等位基因DQB1 0 3、DR15的目的DNA片段 (分别为 79、197bp) ,分析两... 详细信息

目的 :探讨我国陕西地区宫颈癌的发生与人类白细胞抗原 (HLA) DQB1 0 3、DR15等位基因的相关性 .方法 :采用序列特异性引物的聚合酶链式反应 (PCR SSP)方法 ,扩增HLA等位基因DQB1 0 3、DR15的目的DNA片段 (分别为 79、197bp) ,分析两对等位基因在陕西地区宫颈癌患者和正常人中分布频率的差异 .结果 :4 5名宫颈癌患者组中DQB1 0 3等位基因频率显著高于 5 0名健康对照组 ,DR15等位基因频率在两组中的分布无显著差异 .结论 :HLA等位基因DQB1 0 3可能与宫颈癌的发生具有相关性 ,DR15可能与宫颈癌的发生不存在关联 .

关键词：宫颈肿瘤 HLA抗原

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改良PCR-ELISA的建立及初步应用

临床检验杂志 2002年第4期20卷 211-213页

作者：郭晏海张菊崔大祥赵锦荣闫小君第四军医大学全军基因诊断技术研究所西安710033

目的　建立操作简单、灵敏、特异的PCR -ELISA。方法　采用短DNA片段扩增 ,其中上游引物 5′端标记有生物素 ,使PCR扩增产物的一条链上带有生物素 ,随着PCR反应的结束 ,PCR反应液中的地高辛标记的探针与PCR产物中的生物素标记的DNA链杂... 详细信息

目的　建立操作简单、灵敏、特异的PCR -ELISA。方法　采用短DNA片段扩增 ,其中上游引物 5′端标记有生物素 ,使PCR扩增产物的一条链上带有生物素 ,随着PCR反应的结束 ,PCR反应液中的地高辛标记的探针与PCR产物中的生物素标记的DNA链杂交 ,形成杂交产物 ,然后杂交产物通过生物素与微孔板上固定的链霉亲合素结合 ,被固定在微孔板上 ,最后用ELISA检测被固定的杂交产物。结果　该方法可以检测出 1× 10 1拷贝的HBVDNA模板 ,对 10 0例乙型肝炎患者的血清进行检测 ,HBSAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)的血清 10 0 %(30 /30 )检出HBVDNA ;HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBc(+)的血清HBVDNA阳性为 78 6 %(2 2 /2 8) ;HBsAg(+)、抗HBc(+)的血清HBVDNA阳性为 6 6 7%(16 /2 4) ,其余为阴性。非乙型肝炎血清的结果均为阴性。结论　该PCR -ELISA操作简单 ,方法灵敏、特异。

关键词：改良PCR-ELISA 酶联免疫吸附分析基因诊断乙型肝炎

荧光偏振检测HBV DNA C区BCP双突变

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第四军医大学学报 2003年第18期24卷 1668-1670页

作者：郭晏海吕贯庭白玉洁赵锦荣张菊闫小君第四军医大学科研部全军基因诊断技术研究所陕西西安710033

目的 :建立简便、灵敏的HBVDNA序列中BCP双突变点的检测方法 .方法 :采用终点终止法和偏振光检测技术进行点突变的检测 .首先对HBVC区基因进行PCR扩增 ,然后用特异探针与扩增产物中待测核苷酸的下游序列杂交 ,使探针的 3′端可以在DNA... 详细信息

目的 :建立简便、灵敏的HBVDNA序列中BCP双突变点的检测方法 .方法 :采用终点终止法和偏振光检测技术进行点突变的检测 .首先对HBVC区基因进行PCR扩增 ,然后用特异探针与扩增产物中待测核苷酸的下游序列杂交 ,使探针的 3′端可以在DNA聚合酶的催化下 ,依据其互补链上的待测核苷酸连接上一个标有特定荧光素的ddNTP ,然后检测该 3′端带有荧光素的探针 ,根据检测到的荧光素种类和偏振光的强度可以判定待测点是何种核苷酸 .结果 :该方法可以检测出HBV基因序列中BCP双突变核苷酸类型以及检测1个拷贝的模板 ,并且可以从BCP野性株DNA序列中检出5 %BCP双突变DNA序列 .结论

关键词：荧光偏振突变肝炎病毒,乙型 DNA