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M1巨噬细胞回输治疗小鼠肝癌的研究

空军军医大学学报 2024年第7期45卷 749-755页

作者：卢羿同杨嘉蒙魏调霞赵俊龙秦鸿雁空军军医大学基础医学院医学遗传与发育生物学教研室陕西西安710032

目的研究回输M1型骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)对原位肝肿瘤小鼠模型的治疗作用。方法①分离野生小鼠的骨髓细胞并体外诱导成BMDMs(即M0型巨噬细胞),在IFN-γ+LPS诱导下极化为M1型巨噬细胞。通过肝内接种Luciferase-Hepa1-6细胞建立原位... 详细信息

目的研究回输M1型骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)对原位肝肿瘤小鼠模型的治疗作用。方法①分离野生小鼠的骨髓细胞并体外诱导成BMDMs(即M0型巨噬细胞),在IFN-γ+LPS诱导下极化为M1型巨噬细胞。通过肝内接种Luciferase-Hepa1-6细胞建立原位小鼠肝癌模型。在接种肿瘤7 d后,经尾静脉回输PBS(对照组)、M0型和M1型巨噬细胞,通过小动物活体成像技术检测小鼠肝脏肿瘤的生长状态。接种21 d后,分离并观察肝脏肿瘤大小及称取质量,确定回输不同类型巨噬细胞对小鼠肝脏肿瘤进展的影响。利用流式细胞仪分析肝脏肿瘤癌旁组织内巨噬细胞亚群变化。②分离GFP转基因小鼠的骨髓细胞,诱导分化成M0型和M1型巨噬细胞后经尾静脉回输至肝癌小鼠体内,利用流式细胞仪及免疫荧光等方法检测回输1、3、7 d后肝脏内GFP阳性的BMDMs细胞数。结果与对照组相比,回输M0型和M1型BMDMs均促进了肝肿瘤的生长(P<0.05)。回输M0型或M1型BMDMs后,癌旁组织中枯否细胞增多,骨髓单核来源的炎性巨噬细胞增多(P<0.05)。经尾静脉回输1×10^(6)个M0型或M1型GFP+BMDMs,1 d后约3×10^(3)个细胞驻留于肝脏中,并随着时间增长逐渐减少。结论回输M1型巨噬细胞并未能达到治疗肝肿瘤的目的,反而促进肝肿瘤的生长。

关键词：肝癌巨噬细胞细胞治疗肿瘤相关巨噬细胞

构建治疗非酒精性脂肪性肝病的TREM2慢病毒载体

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空军军医大学学报 2024年第6期45卷 609-616页

作者：魏莉邵思佳芶恺琳高春辰秦鸿雁空军军医大学基础医学院医学遗传与发育生物学教研室陕西西安710032

目的构建TREM2不同截断体的慢病毒治疗载体,观察其在体外非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)条件下对AML12肝细胞的影响,为后续靶向巨噬细胞的治疗奠定理论基础。方法通过慢病毒包装的方式建立TREM2或可溶性TREM2(sTREM2)稳定转染AML12肝细胞系... 详细信息

目的构建TREM2不同截断体的慢病毒治疗载体,观察其在体外非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)条件下对AML12肝细胞的影响,为后续靶向巨噬细胞的治疗奠定理论基础。方法通过慢病毒包装的方式建立TREM2或可溶性TREM2(sTREM2)稳定转染AML12肝细胞系,利用qRT-PCR技术、Western blotting技术、流式细胞术检测转染效率,利用免疫荧光染色技术检测TREM2或sTREM2的表达和细胞定位;利用流式细胞术检测TREM2或sTREM2对体外NAFLD条件下细胞凋亡的影响和对静息态下细胞周期的影响;利用油红O染色观察脂质沉积变化情况。结果与对照组相比,稳定转染细胞系中TREM2和sTREM2 mRNA水平明显升高,蛋白表达量明显升高,提示成功建立稳定转染细胞系。在体外NAFLD条件下,过表达TREM2可减轻AML12肝细胞的凋亡和脂质沉积(P<0.05)。静息态下,过表达TREM2或sTREM2均使得G1期细胞数目比例减少(P<0.05),S期细胞数目比例增多(P<0.01),而体外NAFLD条件均使得S期细胞数目比例减少(P<0.01),G2期细胞数目比例增多(P<0.01)。结论肝细胞中TREM2的过表达可减少肝细胞凋亡和脂质沉积,进而保护肝细胞在NAFLD条件下免受损伤。

关键词：非酒精性脂肪性肝病 AML12肝细胞 TREM2 细胞凋亡

环状RNA mmu_circ_0005019影响小鼠心肌细胞钙激活钾通道电流及动作电位

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陆军军医大学学报 2024年第2期46卷 100-109页

作者：杨岚清邬娜陈鹏慧袁志权李成英吴龙钟理李亚斐陆军军医大学(第三军医大学)军事预防医学系军队流行病学教研室重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)基础医学院神经生物学教研室重庆400038 重庆医科大学附属第三医院心血管疾病中心重庆401120

目的探索环状RNA mmu_circ_0005019调控小电导钙激活钾(small-conductance calcium-activated potassium, SK)通道蛋白亚基SK3编码基因Kcnn3的表达,以及对小电导钙激活钾通道电流(IK,Ca)和动作电位时程(action potential duration, APD)的影响。方法在小鼠HL-1细胞中分别构建mmu_circ_0005019过表达和干扰模型,分为过表达组(n=3)、空质粒组(n=3)、干扰1组(n=3)、干扰2组(n=3)、对照组(n=3),通过RT-qPCR、Western blot分析mmu_circ_0005019调节Kcnn3表达的分子机制,应用膜片钳技术电流钳模式记录全细胞的IK,Ca,并用电压钳模式记录APD。结果成功构建了环状RNA mmu_circ_0005019过表达和干扰的HL-1细胞模型。过表达组的Kcnn3基因表达与空质粒组相比明显上调(P<0.05);干扰1组和干扰2组的Kcnn3基因表达与对照组相比均明显下调(P<0.05)。电生理发现过表达mmu_circ_0005019增加了HL-1细胞IK,Ca电流密度,APD显著缩短;相反,干扰mmu_circ_0005019减少了IK,Ca电流密度,APD显著延长。结论 mmu_circ_0005019可以上调小鼠HL-1细胞Kcnn3的表达水平,从而改变IK,Ca和APD,提示环状RNA mmu_circ_0005019可能在房颤发生中起到促进作用。

关键词：环状RNA 心肌细胞小电导钙激活钾通道动作电位时程膜片钳

KRT6A调控胰腺导管腺癌细胞生物学行为的作用及作为诊断与预后判断靶标的研究

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中国肿瘤生物治疗杂志 2024年第5期31卷 462-468页

作者：王浩泽杨轩陈昕苑顾炎海军军医大学基础医学院免疫学教研室暨免疫与炎症全国重点实验室上海200433

目的:通过生物信息学分析以及细胞生物学实验研究角蛋白6A(KRT6A)对胰腺导管腺癌(PDAC)诊断、预后判断、免疫微环境以及PDAC细胞PANC1增殖、凋亡等生物学行为的影响。方法:通过GEPIA平台整合TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库与GTEx(... 详细信息

目的:通过生物信息学分析以及细胞生物学实验研究角蛋白6A(KRT6A)对胰腺导管腺癌(PDAC)诊断、预后判断、免疫微环境以及PDAC细胞PANC1增殖、凋亡等生物学行为的影响。方法:通过GEPIA平台整合TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库与GTEx(Genotype-Tissue)数据库中的数据,分析KTRT6A在PDAC组织中的表达情况,并通过CIBERSORT工具分析KRT6A表达与PDAC组织中免疫细胞浸润的关系,然后通过GSEA方法研究与KRT6A基因表达相关的肿瘤信号通路。选取长海医院病理科保存的60例PDAC组织与癌旁组织标本进行免疫组化分析,验证KRT6A在肿瘤组织中表达情况;通过干扰RNA敲减PANC1细胞中KRT6A的表达,采用CCK-8实验以及流式细胞术检测敲减KRT6A对细胞的增殖、凋亡的影响。结果:利用TCGA与GTEx数据库数据分析发现,KRT6A在人PDAC组织中呈高表达,且与患者较差的生存期存在关联(P=0.015)。利用CIBERSORT软件以及GSEA分析发现,KRT6A高表达的PDAC组织中M2型巨噬细胞浸润性升高(P=0.034),且与Wnt通路(NES:1.7359272,P<0.05)、磷酸戊糖途径(PPP)(NES:1.5613053,P<0.05)等信号通路上调有关联(P<0.05或P<0.01);免疫组化结果进一步验证了KRT6A在PDAC组织中呈高表达(P<0.001)。增殖和凋亡实验发现,干扰KRT6A能够显著抑制PANC1细胞的增殖(P<0.05)以及凋亡(P<0.001)。结论:KRT6A在人PDAC组织中呈高表达,敲减其表达能够抑制PANC1细胞的增殖和凋亡,具有作为PDAC诊断与预后判断新靶标的潜力。

关键词：胰腺导管腺癌 KRT6A基因 PANC1细胞增殖凋亡诊断预后

沙库巴曲缬沙坦防治肿瘤治疗相关心功能不全的效果分析

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中国肿瘤临床 2024年第4期51卷 186-191页

作者：林艺婷韩晴郭小博张红梅空军军医大学基础医学院学员四大队西安市710032 空军军医大学基础医学院学员六大队空军军医大学西京医院肿瘤科

目的:探讨沙库巴曲缬沙坦治疗肿瘤治疗相关心功能不全(cancer therapy-related cardiac dysfunction,CTRCD)的疗效。方法:汇总分析自建库至2023年3月发表于Pubmed、Web of Science、Cochrane Library、Medline、Embase五大数据库的沙库巴曲缬沙坦治疗CTRCD的所有文献,归纳总结用药时机、剂量、药物疗效等;梳理总结其预防CTRCD的临床研究。结果:使用沙库巴曲缬沙坦治疗CTRCD 3~12个月后,肿瘤患者NYHA心功能从Ⅱ~Ⅳ级改善为Ⅰ~Ⅱ级,LVEF上升幅度为3.0%~37.0%,NTproBNP下降幅度为280.0~65498.0 pg/mL。结论:沙库巴曲缬沙坦治疗CTRCD有效,在改善患者LVEF、GLS等指标方面具有较好的临床应用价值,使肿瘤患者抗肿瘤治疗得以继续、生存期得以延长。

关键词：沙库巴曲缬沙坦肿瘤治疗相关心功能不全心力衰竭肿瘤心脏病学

小鼠抗西方马脑炎病毒E2蛋白胞外区(E2ecto)单克隆抗体的制备

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细胞与分子免疫学杂志 2024年第1期40卷 62-68页

作者：武福星董阳超张剑薛潘袁若栋陈洋元航李宝莉雷迎峰延安大学医学院陕西延安716000 空军军医大学基础医学院微生物与病原生物学教研室陕西西安710032

目的制备针对西方马脑炎病毒(WEEV)E2包膜糖蛋白胞外区(E2ecto)的小鼠特异性单克隆抗体(mAb)。方法构建表达WEEV E2ecto的原核表达质粒pET-28a-WEEV E2ecto,转化BL21(DE3)感受态细胞后,IPTG诱导表达,主要为包涵体形式。包涵体纯化后,通... 详细信息

目的制备针对西方马脑炎病毒(WEEV)E2包膜糖蛋白胞外区(E2ecto)的小鼠特异性单克隆抗体(mAb)。方法构建表达WEEV E2ecto的原核表达质粒pET-28a-WEEV E2ecto,转化BL21(DE3)感受态细胞后,IPTG诱导表达,主要为包涵体形式。包涵体纯化后,通过变性、复性、超滤等制备得到E2ecto蛋白;以QuickAntibody-Mouse5W为佐剂,将E2ecto蛋白肌肉免疫BALB/c小鼠,间隔21 d加强1次。免疫后35 d,取效价超过1×104的小鼠腹腔接种1次E2ecto蛋白,3 d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。通过有限稀释法筛选稳定分泌特异性mAb的杂交瘤细胞,接种小鼠腹腔后制备腹水;利用ELISA检测抗体亚型及腹水中抗体效价的水平;将真核表达质粒pCAGGS-WEEV-CE3E2E1转染BHK-21细胞,通过免疫荧光法(IFA)鉴定上述mAb的生物学活性;利用东方马脑炎病毒(EEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的E2ecto蛋白进行ELISA鉴定上述抗体的特异性。结果成功表达及复性获得了纯化的WEEV E2ecto蛋白;制备了3G6G10、3D7G2、3B9E8、3D5B7四株mAb,其亚型分别为IgG2c(κ)、IgM(κ)、IgM(κ)、IgG1(κ);3G6G10、3B9E8、3D7G2腹水抗体效价均为105,3D5B7达到107;该4株抗体与VEEV和EEEV等其他脑炎甲病毒无交叉反应。结论成功制备了4株特异性结合WEEVE2ecto的小鼠mAb。

关键词：西方马脑炎病毒(WEEV) E2包膜糖蛋白胞外区(E2ecto) 原核表达单克隆抗体(mAb)

中性粒细胞在肿瘤发生发展及免疫治疗中的作用

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中国肿瘤生物治疗杂志 2024年第5期31卷 507-513页

作者：王浩泽(综述) 顾炎(审阅) 海军军医大学基础医学院免疫学教研室暨免疫与炎症全国重点实验室上海200433

中性粒细胞作为机体的重要免疫细胞,在感染、自身免疫性疾病等多种炎症反应中发挥重要作用。然而,中性粒细胞在肿瘤的发生发展过程中也扮演重要角色。一方面,中性粒细胞能够通过杀伤肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用;另一方面,中性粒细胞也可以... 详细信息

中性粒细胞作为机体的重要免疫细胞,在感染、自身免疫性疾病等多种炎症反应中发挥重要作用。然而,中性粒细胞在肿瘤的发生发展过程中也扮演重要角色。一方面,中性粒细胞能够通过杀伤肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用;另一方面,中性粒细胞也可以通过分泌多种细胞因子或与其他类型细胞相互作用来促进肿瘤细胞发生免疫逃逸。由于中性粒细胞能够通过多种机制来促进肿瘤的发生发展,因此靶向中性粒细胞的免疫治疗也成为了肿瘤免疫治疗的一个新的思路。本文通过介绍中性粒细胞在肿瘤演进过程中发挥的抗肿瘤效应,促进肿瘤免疫逃逸以及中性粒细胞相关的免疫治疗等方面来阐述中性粒细胞在肿瘤发生发展以及免疫治疗中的重要性。

关键词：中性粒细胞肿瘤细胞免疫逃逸免疫治疗肿瘤免疫

小鼠抗寨卡病毒包膜蛋白胞外区(Eecto)单克隆抗体的制备

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细胞与分子免疫学杂志 2024年第5期40卷 447-454页

作者：薛潘董阳超武福星陈洋张剑元航武苏闪袁若栋李宝莉雷迎峰延安大学医学院陕西延安716000 空军军医大学基础医学院微生物与病原生物学教研室陕西西安710032

目的制备小鼠抗寨卡病毒(ZIKV)包膜蛋白胞外区(Eecto)单克隆抗体。方法首先构建ZIKV Eecto的原核表达质粒pET28a-ZIKV-Eecto,将其转化至大肠杆菌感受态BL21后,利用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。重组Eecto蛋白以包涵体形式表... 详细信息

目的制备小鼠抗寨卡病毒(ZIKV)包膜蛋白胞外区(Eecto)单克隆抗体。方法首先构建ZIKV Eecto的原核表达质粒pET28a-ZIKV-Eecto,将其转化至大肠杆菌感受态BL21后,利用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。重组Eecto蛋白以包涵体形式表达,经过变性、复性和超滤获得纯化的蛋白。将Eecto蛋白3次免疫后,获得多克隆抗体血清,进行效价测定,并利用ZIKV prME真核表达质粒转染的HEK293T细胞进行Western blot法和免疫荧光法分析。取效价较高的小鼠脾脏制备脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法获取分泌抗体的杂交瘤细胞,并进一步制备腹水。对腹水进行抗体效价测定、亚类分析。以ZIKV同属病毒日本脑炎病毒(JEV)、黄热病病毒(YFV)、登革病毒1-4(DENV1-4)、蜱传脑炎病毒(TBEV)的Eecto为包被抗原,利用ELISA分析ZIKV单克隆抗体的交叉反应性,进一步对效价高、特异性强的抗体进行特异性分析。结果成功构建了原核表达质粒pET28a-ZIKV-Eecto,并获得纯化的Eecto蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性;制备筛选得到1D6、4F11、4H7、4F8四株单克隆抗体,其中三株(1D6、4H7、4F8)为IgGκ型抗体,一株(4F11)为IgMκ,1D6腹水效价大于1∶108;其中1D6和4H7为ZIKV特异性抗体,与其他黄病毒无交叉反应。结论成功制备了小鼠抗ZIKV Eecto单克隆抗体,为后续建立ZIKV检测方法及致病机制研究提供了实验材料。

关键词：寨卡病毒(ZIKV) 包膜蛋白胞外区(Eecto) 原核表达单克隆抗体

利用CRISPR/Cas9技术建立STAT1敲除细胞系及其功能验证

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病毒学报 2024年第3期40卷 519-527页

作者：张俊梅王芳应旗康冯文杰古天乐吴兴安空军军医大学基础医学院微生物与病原生物学教研室西安710032 延安大学生命科学学院延安716000

信号转导和转录活化因子1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)是干扰素信号通路中的关键分子,在对抗病毒和其他病原体的免疫反应中发挥重要作用,构建STAT1敲除细胞系有助于研究其在病毒感染过程中的作用与机制... 详细信息

信号转导和转录活化因子1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)是干扰素信号通路中的关键分子,在对抗病毒和其他病原体的免疫反应中发挥重要作用,构建STAT1敲除细胞系有助于研究其在病毒感染过程中的作用与机制。本研究利用CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9)基因编辑技术构建STAT1基因敲除细胞系。首先构建STAT1基因特异性打靶载体,后通过慢病毒转导人非小细胞肺癌细胞系(Human non-small cell lung cancer cells,A549),嘌呤霉素筛选稳定转导的细胞后进行单克隆化,最后对获取的单克隆细胞在分子水平上进行敲除及敲除回补验证,成功构建一株STAT1基因敲除(STAT1 gene knockout,STAT1-KO)的A549细胞,且该细胞系可维持正常细胞活性与增殖能力。以汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)感染验证,发现在该细胞系中病毒复制水平明显升高。本研究成功构建了一株STAT1-KO A549细胞,可为抗病毒药物和干扰素信号通路研究提供有力工具。

关键词：信号转导和转录活化因子1 CRISPR/Cas9 基因敲除汉滩病毒