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甲氨蝶呤载药囊泡在小鼠实验性牙周炎治疗中的作用研究

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中华口腔医学杂志 2024年第7期59卷 681-689页

作者：杨建花何小宁刘治王文哲李蓓第四军医大学口腔医院口腔组织病理学教研室、口颌系统重建与再生全国重点实验室、国家口腔疾病临床医学研究中心、陕西省口腔疾病国际联合研究中心西安710032 第四军医大学口腔医院口腔正畸科、口颌系统重建与再生全国重点实验室、国家口腔疾病临床医学研究中心、陕西省口腔疾病临床医学研究中心西安710032

目的探究甲氨蝶呤载药囊泡对小鼠实验性牙周炎的治疗作用。方法分离人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)的细胞外囊泡(EVs)。构建甲氨蝶呤(MTX)载药囊泡(MTX-EVs)并通过扫描电镜及动态光散射仪(DLS)对构建的载药囊泡进行形态大小分析,通过蛋白... 详细信息

目的探究甲氨蝶呤载药囊泡对小鼠实验性牙周炎的治疗作用。方法分离人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)的细胞外囊泡(EVs)。构建甲氨蝶呤(MTX)载药囊泡(MTX-EVs)并通过扫描电镜及动态光散射仪(DLS)对构建的载药囊泡进行形态大小分析,通过蛋白质印迹法对其表面特异性蛋白进行鉴定。选取4~5周C57BL/6J雄性小鼠,其中通过盲抓法随机抽取8只不做处理,正常饲养作为对照组(由第四军医大学实验动物中心提供),其余小鼠利用脂多糖(LPS)(2 g/L,5μl)牙周局部注射诱导小鼠牙周炎模型,间隔1天注射1次,诱导2周。将成功诱导牙周炎模型小鼠通过盲抓法随机分为4组,每组8只。分别为LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组。牙周局部治疗2周后,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测牙龈组织炎症因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的质量浓度。通过显微CT(micro-CT)、HE染色评估对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组小鼠的牙槽骨吸收情况。流式细胞仪分析牙龈组织中γ干扰素(IFN-γ)阳性细胞的占比。结果扫描电镜结果显示EVs和MTX-EVs呈圆形或椭圆形,DLS粒径分析证明EVs粒径在200 nm左右,MTX-EVs粒径在300 nm左右。ELISA结果显示,对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-1β质量浓度分别为(28.86±2.76)、(51.50±2.04)、(35.26±2.40)、(45.49±2.04)、(35.77±3.49)ng/L;LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-1β质量浓度均显著低于LPS组(均P颌第一磨牙第一牙根处釉质子骨质界到牙槽嵴顶的距离分别为(0.11±0.03)、(0.28±0.02)、(0.23±0.03)、(0.20±0.04)、(0.18±0.03)mm,与LPS组相比,LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组骨吸收均得到不同程度的抑制,差异均有统计学意义(均P<0.05),其中LPS+MTX-EVs组与LPS+MTX组及LPS+EVs组相比,骨吸收抑制效果最好,且差异均有统计学意义(均P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,LPS组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IFNγ阳性细胞占比分别为(11.77±1.02)%、(6.87±0.65)%及(4.15±0.92)%,LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组中IFN-γ阳性细胞占比均显著低于LPS组(均P<0.05),LPS+MTX-EVs组中IFN-γ阳性细胞占比显著低于LPS+EVs组(P<0.05)。结论MTX-EVs可有效改善牙周炎模型小鼠牙周局部炎症环境,减少小鼠牙槽骨骨吸收。

关键词：牙周炎细胞外囊泡甲氨蝶呤载药囊泡牙槽骨质丢失促炎因子

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非阻生第三磨牙与邻牙牙周稳态

中华口腔医学杂志 2024年第2期59卷 138-144页

作者：曲红蕾陈发明第四军医大学口腔医院口腔牙周病科口颌系统重建与再生全国重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心陕西省口腔疾病国际联合研究中心

由于萌出时间和空间的影响, 第三磨牙(M3s)常发生阻生并诱发多种口腔疾病, 可对其相邻的第二磨牙的健康产生不良影响。长期以来, 大量研究聚焦于阻生M3s对邻牙健康的危害, 而对已经萌出的非阻生M3s(N-M3s)关注较少。然而, 越来越多的研... 详细信息

由于萌出时间和空间的影响, 第三磨牙(M3s)常发生阻生并诱发多种口腔疾病, 可对其相邻的第二磨牙的健康产生不良影响。长期以来, 大量研究聚焦于阻生M3s对邻牙健康的危害, 而对已经萌出的非阻生M3s(N-M3s)关注较少。然而, 越来越多的研究和证据表明, N-M3s也是邻牙发生多种疾患的重要危险因素, 但这种危害并未得到口腔医师和患者的重视。本文结合课题组和国内外最新研究成果, 总结并阐释N-M3s对邻牙牙周稳态和牙周健康的影响, 为N-M3s的临床决策及其邻牙健康维护提供参考。

关键词：磨牙, 第三非阻生第三磨牙牙周稳态牙周健康临床决策

基于单细胞测序分析颌骨和长骨间充质干细胞特性差异

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中华口腔医学杂志 2024年第3期59卷 247-254页

作者：王浩周泽楷隋秉东金钫周峻郑晨曦第四军医大学口腔医院口腔组织病理学教研室、口颌系统重建与再生全国重点实验室、国家口腔疾病临床医学研究中心、陕西省口腔疾病国际联合研究中心西安710032 第四军医大学基础医学院西安710032 第四军医大学口腔医院口腔正畸科、口颌系统重建与再生全国重点实验室、国家口腔疾病临床医学研究中心、陕西省口腔疾病临床医学研究中心西安710032

目的研究颌骨和长骨全骨髓细胞组成并比较下颌骨来源间充质干细胞(M-MSC)与股骨来源间充质干细胞(F-MSC)异质性,探讨不同谱系来源骨间充质干细胞(MSC)的功能特性差异。方法对文献中下颌骨与股骨全骨髓单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集,使... 详细信息

目的研究颌骨和长骨全骨髓细胞组成并比较下颌骨来源间充质干细胞(M-MSC)与股骨来源间充质干细胞(F-MSC)异质性,探讨不同谱系来源骨间充质干细胞(MSC)的功能特性差异。方法对文献中下颌骨与股骨全骨髓单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集,使用R语言的Seurat包进行数据处理,参考既往文献报道标记基因对亚群进行细胞注释。计算M-MSC与F-MSC的差异表达基因,并对MSC与其他亚群间的相互作用进行细胞通讯分析。分别对上下调差异基因进行基因本体功能注释(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,并对M-MSC和F-MSC的所有基因进行基因集富集分析(GSEA)。结果scRNA-seq分析显示下颌骨与股骨骨髓细胞组成相同,但特定细胞亚群所占比例存在差异。差异基因计算显示M-MSC和F-MSC间存在显著差异基因。细胞通讯分析显示M-MSC和F-MSC与骨髓其他细胞亚群相互作用的配受体对数存在差异。进一步GO、KEGG、GSEA分析显示相比于F-MSC,M-MSC具有更高的细胞外基质生成潜能,但对骨髓其他细胞,尤其是免疫细胞的调控能力较低。结论M-MSC和F-MSC在基因表达模式与上调信号通路上存在较大差异,这些差异可能与颌骨和长骨发育来源以及功能特性不同密切相关。

关键词：干细胞骨髓间充质干细胞单细胞RNA测序下颌骨股骨

改良双肌肉环咽后壁瓣术矫治中重度腭咽闭合不全的临床效果研究

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中华口腔医学杂志 2024年第6期59卷 617-621页

作者：吴思默石冰赵芝鹤张浚睿李海强第四军医大学口腔医院颅颌面整形与美容外科口颌系统重建与再生全国重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心陕西省口腔疾病临床医学研究中心西安710032 四川大学华西口腔医院唇腭裂外科口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心成都610041

本文介绍了改良的双肌肉环咽后壁瓣术(BMR),并探讨该术式矫治中、重度腭咽闭合不全的临床效果并总结治疗经验。回顾2019年5月至2021年7月第四军医大学口腔医院颅颌面整形与美容外科接受BMR术的18例患者资料,其中男性10例,女性8例,年龄... 详细信息

本文介绍了改良的双肌肉环咽后壁瓣术(BMR),并探讨该术式矫治中、重度腭咽闭合不全的临床效果并总结治疗经验。回顾2019年5月至2021年7月第四军医大学口腔医院颅颌面整形与美容外科接受BMR术的18例患者资料,其中男性10例,女性8例,年龄中位数为8.5岁(范围5~34岁),术前临床诊断为中、重度腭咽闭合不全(腭咽闭合率<0.7)。对比分析术前及术后半年随访时鼻咽镜检查及语音评估结果,评价患者腭咽功能及语音变化。结果显示,18例患者接受BMR术,4例打鼾(3例数周后症状消失),2例伤口局部糜烂,延期愈合。全部患者术后鼻咽镜检查腭咽闭合优良,10例患者咽侧壁运动加强,全部患者咽后壁瓣可主动运动。患者术前语音评分为9分(7~12分),术后语音评分为2分(0~4分),配对非参数Wilcoxon符号秩检验显示,术后语音评分显著低于术前(P<0.05)。BMR术可作为治疗中、重度腭咽闭合不全的可靠手段。该技术在保留咽后壁瓣阻塞作用的同时实现通气孔全周长功能性收缩,有助于平衡鼻通气与腭咽闭合,并改善患者腭咽功能。

关键词：腭咽闭合不全咽后壁瓣腭裂腭咽功能

牙周组织再生--当前治疗策略和未来研究方向的思考

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中华口腔医学杂志 2024年第4期59卷 312-317页

作者：陈发明第四军医大学口腔医院口腔牙周病科、口颌系统重建与再生全国重点实验室、国家口腔疾病临床医学研究中心、陕西省口腔疾病国际联合研究中心西安710032

牙周炎所致的牙周组织慢性进行性破坏是成人牙齿缺失的主要原因。传统牙周治疗虽可控制牙周炎症、延缓或阻止疾病进程,却不能使缺失的牙周组织获得良好的再生。以引导性牙周组织再生、牙周骨移植技术为代表的再生治疗策略,虽可有效减小... 详细信息

牙周炎所致的牙周组织慢性进行性破坏是成人牙齿缺失的主要原因。传统牙周治疗虽可控制牙周炎症、延缓或阻止疾病进程,却不能使缺失的牙周组织获得良好的再生。以引导性牙周组织再生、牙周骨移植技术为代表的再生治疗策略,虽可有效减小牙周骨下袋深度,一定程度上恢复患牙牙周稳态,却面临再生能力有限、可预见性差的困境,特别是在恢复牙周组织的生理结构和功能上,远未达到临床所期望的目标。利用组织工程的原理、技术和方法促进牙周组织再生的尝试,在动物实验中已取得令人振奋的结果,但临床转化中却面临巨大的困难和挑战。诱导机体自身干细胞归巢,实现牙周组织内源性再生,可避免细胞培养和移植等复杂程序,有望加速牙周组织再生新技术、新方法临床转化的进程。由于口腔微环境和牙周局部条件的影响,牙周组织再生的生物学基础差,探索切实有效的再生策略,挽救、守护天然牙,在今后很长一段时间里,都将是牙周病学基础和临床研究领域关注的难题,任重而道远。

关键词：牙周炎牙周组织再生引导组织再生术骨移植干细胞治疗内源性再生

牙周炎症环境中内皮细胞焦亡现象的体内外研究初探

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中华口腔医学杂志 2024年第5期59卷 486-495页

作者：李蕊王晓雨叶庆元王垭铮张曦戈葛晓彤王勤涛第四军医大学口腔医院牙周病科、口颌系统重建与再生全国重点实验室、国家口腔疾病临床医学研究中心、陕西省口腔疾病国际联合研究中心西安710032 第四军医大学口腔医院数字化口腔医学中心口颌系统重建与再生全国重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心陕西省口腔医学重点实验室西安710032

目的通过体内外模型观察牙周炎局部组织内皮细胞在炎症环境下是否发生焦亡,为探究牙周炎发病机制提供实验依据。方法根据牙周病2018年新分类标准收集无全身疾病、牙周健康者及Ⅲ~Ⅳ期C级牙周炎患者的牙龈组织,免疫组化染色检测牙龈组织... 详细信息

目的通过体内外模型观察牙周炎局部组织内皮细胞在炎症环境下是否发生焦亡,为探究牙周炎发病机制提供实验依据。方法根据牙周病2018年新分类标准收集无全身疾病、牙周健康者及Ⅲ~Ⅳ期C级牙周炎患者的牙龈组织,免疫组化染色检测牙龈组织中焦亡标志性蛋白消皮素D(GSDMD)的表达水平及分布情况;每组通过结扎3只小鼠上颌第二磨牙2周建立牙周炎模型(结扎组),使用显微CT(micro-CT)检测小鼠牙槽骨吸收情况(以不做结扎处理的小鼠作为对照组);使用免疫荧光染色对健康及炎症小鼠牙龈组织中血管内皮细胞血小板内皮细胞黏附分子(CD31)与GSDMD共定位进行定量分析;体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分别以质量浓度为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mg/L牙龈卟啉单胞菌(Pg)脂多糖(LPS)联合腺苷三磷酸(ATP)处理HUVECs,同期设置0 mg/L Pg-LPS组为对照组。使用扫描电镜观察HUVECs形态,蛋白质印迹法检测GSDMD的N端结构域(GSDMD-N)蛋白表达,细胞免疫荧光染色检测GSDMD蛋白表达及分布,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测HUVECs的增殖能力,碘化丙啶(PI)染色检测HUVECs细胞膜的完整性。结果免疫组化结果显示,牙周炎患者牙龈组织中GSDMD主要分布于血管周围,且表达水平较健康组织显著升高;micro-CT结果显示,结扎组小鼠上颌第二磨牙周围牙槽骨吸收较对照组小鼠显著增多(t=8.88,P<0.001);免疫荧光染色结果显示,结扎组小鼠牙龈组织中血管内皮细胞GSDMD与CD31存在明显的共定位;扫描电镜结果显示,在不同浓度Pg-LPS联合ATP模拟的炎症环境中,HUVECs细胞膜上出现不同大小的孔洞,呈现典型的细胞焦亡形态,其中2.5 mg/L Pg-LPS+ATP组细胞膜上孔洞最多且扩张融合,细胞有裂解死亡的趋势。蛋白质印迹法结果显示,2.5和5.0 mg/L Pg-LPS+ATP组焦亡标志性蛋白GSDMD-N表达显著高于对照组(F=3.86,P<0.01);细胞免疫荧光结果显示,2.5 mg/L Pg-LPS+ATP组较对照组GSDMD平均荧光强度升高最显著(F=35.25,P<0.001)。CCK-8结果显示,0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 mg/L Pg-LPS+ATP组细胞增殖相对值(分别为0.52±0.07、0.57±0.10、0.58±0.04、0.55±0.04和0.61±0.03)均显著低于对照组(1.00±0.02)(F=39.95,P<0.001)。PI染色结果显示,PI阳性细胞数占比在2.5 mg/L Pg-LPS+ATP组最高[(56.07±3.22)%](F=88.24,P<0.001)。结论牙周炎症环境中内皮细胞发生明显的焦亡现象,提示内皮细胞焦亡可能是造成牙周炎发生的重要致病因素。

关键词：牙周炎内皮细胞细胞焦亡脂多糖腺苷三磷酸

细胞外基质囊泡模拟物制备及其生物学性能的初步研究

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中华口腔医学杂志 2024年第7期59卷 663-671页

作者：张忻妤李琳李思瑶梁嘉鑫陈发明殷园第四军医大学口腔医院牙周病科、口颌系统重建与再生全国重点实验室、国家口腔疾病临床医学研究中心、陕西省口腔医学重点实验室西安710032

目的探讨运用机械挤压法制备细胞外基质囊泡模拟物的生物学性能及其对人牙周膜干细胞(PDLSC)细胞活性和成骨分化潜能的影响。方法胶原酶消化法制备PDLSC来源细胞外基质囊泡,机械挤压法制备亲本细胞来源囊泡模拟物;将获取的天然细胞外基... 详细信息

目的探讨运用机械挤压法制备细胞外基质囊泡模拟物的生物学性能及其对人牙周膜干细胞(PDLSC)细胞活性和成骨分化潜能的影响。方法胶原酶消化法制备PDLSC来源细胞外基质囊泡,机械挤压法制备亲本细胞来源囊泡模拟物;将获取的天然细胞外基质囊泡和亲本细胞来源囊泡模拟物分为4组:基础培养基培养7 d的PDLSC来源基质囊泡(PDLSC matrix vesicles,MVs)和基础培养基培养7 d的PDLSC来源囊泡模拟物(PDLSC vesicle mimetics,CVMs),成骨诱导培养基培养7 d的PDLSC来源基质囊泡(osteogenic-induced PDLSC matrix vesicles,O-MVs)和成骨诱导培养基培养7 d的PDLSC来源囊泡模拟物(osteogenic-induced PDLSC vesicle mimetics,O-CVMs);透射电镜和纳米颗粒示踪分析观察囊泡形态和大小,免疫荧光检测细胞摄取囊泡情况;以PDLSC作为对照组,细胞活性实验检测囊泡对PDLSC细胞活性的影响,茜素红染色和蛋白质印迹法检测囊泡对PDLSC成骨分化潜能的影响。结果MVs、O-MVs、CVMs和O-CVMs均表现为圆形囊泡结构(直径50~250 nm),均能被PDLSC摄取,且不影响PDLSC的细胞活性;成骨诱导条件下,O-MVs和O-CVMs孵育的PDLSC相比于对照组细胞形成更多的矿化结节;MVs、O-MVs、CVMs和O-CVMs均能促进PDLSC表达成骨相关蛋白,O-CVMs孵育的PDLSC表达的碱性磷酸酶(1.571±0.348)、骨桥蛋白(1.827±0.627)和骨钙蛋白(1.798±0.537)表达水平均显著高于MVs孵育的细胞(分别为1.156±0.170、1.260±0.293和1.286±0.302)(均P0.05)。结论机械挤压法制备的囊泡模拟物与天然细胞外基质囊泡的形态、大小类似,不影响PDLSC的细胞活性,并可在一定程度上促进PDLSC的成骨分化潜能。

关键词：牙周炎细胞外基质囊泡囊泡模拟物机械挤压法牙周膜干细胞成骨分化潜能组织再生

牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡携带脂多糖激活Toll样受体2促进破骨细胞分化的研究

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中华口腔医学杂志 2024年第3期59卷 237-246页

作者：邹捷康曹宇蒙田义李璇吴瑞鑫田蓓敏孙海花陈发明贺小涛第四军医大学口腔医院牙周病科、口颌系统重建与再生全国重点实验室、国家口腔疾病临床医学研究中心、陕西省口腔疾病国际联合研究中心西安710032 西北大学生命科学学院西安710069 第四军医大学口腔医院急诊与综合临床科、口颌系统重建与再生全国重点实验室、国家口腔疾病临床医学研究中心、陕西省口腔疾病国际联合研究中心西安710032

目的探索牙龈卟啉单胞菌(Pg)来源的外膜囊泡(OMV)对巨噬细胞破骨分化的影响及其作用机制。方法使用透射电镜和纳米颗粒追踪分析仪对Pg OMV进行鉴定和表征;使用1、3和10 mg/L的Pg OMV处理破骨前体细胞,分别为1、3和10 mg/L OMV处理组,磷... 详细信息

目的探索牙龈卟啉单胞菌(Pg)来源的外膜囊泡(OMV)对巨噬细胞破骨分化的影响及其作用机制。方法使用透射电镜和纳米颗粒追踪分析仪对Pg OMV进行鉴定和表征;使用1、3和10 mg/L的Pg OMV处理破骨前体细胞,分别为1、3和10 mg/L OMV处理组,磷酸盐缓冲液处理破骨前体细胞为对照组,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、F-肌动蛋白(F-actin)染色和实时荧光定量PCR技术检测破骨细胞形成和破骨相关基因FBJ骨肉瘤癌基因(Fos)和基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达;利用多黏菌素B(PMB)封闭脂多糖(LPS)后的Pg OMV处理破骨前体细胞(PMB-OMV处理组),OMV单独处理为对照,通过TRAP和F-actin染色观察破骨细胞及肌动蛋白环的形成情况;使用蛋白质印迹法检测Pg OMV对破骨前体细胞Toll样受体(TLR)2和TLR4表达水平的影响;利用10、50、100和200μmol/L TLR2抑制剂C29预处理破骨前体细胞后,使用Pg OMV处理破骨前体细胞,分别为OMV+10μmol/L、OMV+50μmol/L、OMV+100μmol/L和OMV+200μmol/L C29处理组,未使用C29预处理的OMV处理组为对照,通过TRAP和F-actin染色观察破骨细胞和肌动蛋白环形成情况;使用OMV和PMB孵育的OMV处理破骨前体细胞,分别为OMV处理组和PMB-OMV处理组,通过蛋白质印迹法检测破骨前体细胞TLR2蛋白表达水平。结果Pg OMV的平均粒径为179.2 nm,具有典型的囊泡结构;3和10 mg/L OMV处理组中可见大量肌动蛋白环形成,TRAP阳性破骨细胞面积占比[分别为(22.6±2.1)%、(32.0±2.3)%]均显著高于对照组[(4.9±0.5)%](P面积占比[(14.8±3.8)%]显著低于OMV处理组[(31.5±6.7)%](P=0.004);OMV处理组TLR2表达水平(1.359±0.134)显著高于对照组(1.000±0.000)(t=4.62,P=0.044);50、100和200μmol/L C29预处理破骨前体细胞后,TRAP阳性破骨细胞面积占比[分别为(24.1±1.7)%、(18.5±2.1)%、(9.1±1.3)%]均显著小于对照组[(29.4±1.7)%](P=0.026,P面的TLR2在Pg OMV介导的破骨细胞分化中发挥重要作用。

关键词：牙周炎紫单胞菌,龈外膜囊泡破骨细胞 Toll样受体2

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间充质凝聚指导牙发育与再生的理论与实践

中华口腔医学杂志 2024年第5期59卷 418-425页

作者：隋秉东金岩第四军医大学口腔医院组织工程研发中心口颌系统重建与再生全国重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心陕西省口腔疾病国际联合研究中心西安

间充质干细胞在基因以及微环境的时空调控下可自发聚集形成致密化区域, 这一现象称为间充质凝聚。间充质凝聚是跨物种保守的发育事件, 对启动牙及全身器官的形态发生至关重要。间充质干细胞在培养中也具有自组装聚集能力, 利用此特性构... 详细信息

间充质干细胞在基因以及微环境的时空调控下可自发聚集形成致密化区域, 这一现象称为间充质凝聚。间充质凝聚是跨物种保守的发育事件, 对启动牙及全身器官的形态发生至关重要。间充质干细胞在培养中也具有自组装聚集能力, 利用此特性构建干细胞聚合体以模拟发育性间充质凝聚已成为一种具有应用前景的再生医学手段。本文讨论间充质凝聚的原理及其在牙形态发生中的作用与机制, 并总结干细胞聚合体的工程化构建策略及应用于牙再生领域的实践经验, 旨在从"发育指导再生"的理念出发, 为理解干细胞发育生物学和建立新的器官再生策略提供参考。

关键词：组织工程间充质干细胞间充质凝聚干细胞聚合体牙再生