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高+Gz反复暴露后大鼠心脏组织应激性差异表达基因的分离(英文)

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航天医学与医学工程 2004年第4期17卷 235-239页

作者：石缨宋志鸿朱美财空军总医院临床分子生物学中心北京100036

目的筛选+Gz反复暴露后大鼠心脏组织特异性应激基因。方法采用动物离心机处理对照组和实验组大鼠,实验组G值为+10 Gz,增长率为1 G/s,峰值持续3 min,共做3次,两次间歇30 min,对照组动物在离心机经历类似实验步骤,所承受的G值为+1 Gz;反... 详细信息

目的筛选+Gz反复暴露后大鼠心脏组织特异性应激基因。方法采用动物离心机处理对照组和实验组大鼠,实验组G值为+10 Gz,增长率为1 G/s,峰值持续3 min,共做3次,两次间歇30 min,对照组动物在离心机经历类似实验步骤,所承受的G值为+1 Gz;反复暴露后1 h提取实验组和对照组大鼠心脏组织总RNA,分离纯化poly A+RNA,与Atlas Rat Stress Array膜杂交,并用半定量RT-PCR进行差异基因表达的特异性鉴定。结果得到10个差异表达基因,其中8个在+Gz反复暴露后大鼠心脏组织中表达上调,2个表达下调,选取热休克蛋白70、P21和血红素加氧酶-1基因作为候选基因,经半定量RT-PCR得到特异性验证,P21和血红素加氧酶-1表达水平升高,热休克蛋白70表达下降。结论应用Atlas Rat Stress Array杂交技术可以发现与+Gz反复暴露相关的特异性应激基因,为+Gz反复暴露对心脏组织的作用机制研究提供新的思路和方法。

关键词：正加速度 +Gz 心脏血红素加氧酶-1 P21 热休克蛋白70

+Gz重复暴露大鼠脑cDNA消减文库的构建

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航天医学与医学工程 2002年第6期15卷 415-418页

作者：蔡庆刘红巾林凯姜建东朱美财空军总医院分子生物学研究中心北京100036

目的应用抑制性消减杂交技术构建 +Gz重复暴露大鼠脑和正常大鼠脑差异表达的cDNA消减文库 ,为筛选 +Gz暴露大鼠脑差异表达基因 ,探讨 +Gz引起脑损伤的分子机制奠定基础。方法Wister大鼠随机分成对照组和 +Gz重复暴露组 ,对照组大鼠G值为... 详细信息

目的应用抑制性消减杂交技术构建 +Gz重复暴露大鼠脑和正常大鼠脑差异表达的cDNA消减文库 ,为筛选 +Gz暴露大鼠脑差异表达基因 ,探讨 +Gz引起脑损伤的分子机制奠定基础。方法Wister大鼠随机分成对照组和 +Gz重复暴露组 ,对照组大鼠G值为 + 1Gz,实验组大鼠在动物离心机上经历了 3次+ 1 0Gz/1min(两次间间隔 30min)作用 ,于暴露后 6h处死取脑。分别从 +Gz重复暴露组和对照组大鼠脑中提取poly(A) +RNA ,依次合成单链及双链cDNA ,用RsaⅠ酶切成大小不等的片段。将 +Gz重复暴露组cDNA分为两组 ,分别与两种不同的接头连接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将PCR产物与T/A载体连接构建 +Gz暴露大鼠脑cDNA消减文库。结果成功构建具有高消减效率的 +Gz暴露大鼠脑cDNA消减文库 ,非特异性cDNA片段被有效地消减 ,特异表达的cDNA得到富集。结论 +Gz暴露大鼠脑cDNA消减文库的建立为进一步筛选、克隆 +Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因奠定了基础。

关键词： +Gz 重复暴露大鼠脑 cDNA消减文库抑制性消减杂交

DnaJ类分子伴侣PBP的基因克隆及亚细胞定位研究

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细胞与分子免疫学杂志 2003年第6期19卷 531-534页

作者：刘缨朱美财王荫静占志刘成刚空军总医院临床分子生物学研究中心北京100036

目的:从人骨骼肌cDNA文库中,分离、鉴定视网膜感光受体外周蛋白的结合蛋白(PBP)-DnaJ(HSP40)类分子伴侣,并初步分析其在转染的哺乳动物细胞中的表达及分布。方法:以33p-dCTP标记探针杂交筛选人骨骼肌cDNA文库,对阳性克隆进行序列分析,... 详细信息

目的:从人骨骼肌cDNA文库中,分离、鉴定视网膜感光受体外周蛋白的结合蛋白(PBP)-DnaJ(HSP40)类分子伴侣,并初步分析其在转染的哺乳动物细胞中的表达及分布。方法:以33p-dCTP标记探针杂交筛选人骨骼肌cDNA文库,对阳性克隆进行序列分析,并以脂质体介导转染哺乳动物细胞,用免疫印迹及间接免疫荧光染色法检测目的蛋白的表达。结果:筛选出全长pbp基因,经与GenBank中的序列比较分析证实,与DnaJ家族的1个成员-mrj(1.5 kb)的序列相同,且含140 bp左右富含GC的非编码区上游序列。在COS-7细胞中瞬时表达的PBP,大多呈典型的胞浆分布,而J-domain缺失的pbp片段多为胞核分布。而在CHO细胞中稳定表达的PBP,在处于不同细胞周期时相的细胞中的分布不同。结论:DnaJ除与HSP70(DnaK)协同发挥重要功能外,其本身作为分子伴侣也可能发挥着重要作用,且与细胞周期可能存在某种密切联系。

关键词： DnaJ分子伴侣蛋白基因转染细胞外周蛋白结合蛋白

抗PAI抑制作用的组织纤溶酶原激活剂在大肠杆菌中的表达

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细胞与分子免疫学杂志 2005年第5期21卷 565-569页

作者：朱美财占志王雅静刘成刚石缨蔡庆空军总医院临床分子生物学研究中心北京100036

目的: 构建t-PA活性不被PAI-1抑制的新一代t-PA突变体.方法: 根据t-PA的结构特点,去除t-PA分子中的指状区、表皮生长因子和Kringle1区,以含全长t-PA编码区序列的pUC18质粒为模板,经PCR扩增编码氨基酸1～3和176～527位的截短式t-PA DNA序... 详细信息

目的: 构建t-PA活性不被PAI-1抑制的新一代t-PA突变体.方法: 根据t-PA的结构特点,去除t-PA分子中的指状区、表皮生长因子和Kringle1区,以含全长t-PA编码区序列的pUC18质粒为模板,经PCR扩增编码氨基酸1～3和176～527位的截短式t-PA DNA序列; 并将该t-PA分子中的PAI-1结合位点,即第373～384位核苷酸(AAG CAC AGG AGG)突变为(GCG GCC GCG GCG),相应的氨基酸KHRR则变为AAAA.结果:测序证实,t-PA突变体的DNA序列正确,将其克隆于大肠杆菌表达载体中,并在大肠杆菌中得到高效表达.表达蛋白占总菌体蛋白的30%,以包涵体形式存在.经蛋白质变性、复性,得到有活性的t-PA突变体.t-PA突变体与PAI-1反应后t-PA的活性未受到抑制.结论:t-PA突变体可能是一种用于治疗心肌梗死和脑血栓等血栓性疾病的强效且剂量要求低的新型生物工程药物.

关键词：组织型纤溶酶原激活剂突变体基因克隆表达纯化

+Gz反复暴露对大鼠主动脉和心脏组织中HO-1、p21及LCAD表达的影响

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中国应用生理学杂志 2006年第2期22卷 218-219,256页

作者：石缨宋志鸿朱美财陈涛空军总医院临床分子生物学研究中心北京100036

目的:观察+GZ反复暴露对大鼠心脏及主动脉组织HO-1、p21和LCAD基因表达的影响。方法:提取+GZ反复暴露后1h组及对照组大鼠心脏、主动脉组织总RNA,经半定量RT-PCR检测其mRNA水平。结果:+GZ反复暴露后心脏组织HO-1、p21和LCAD mRNA水平明... 详细信息

目的:观察+GZ反复暴露对大鼠心脏及主动脉组织HO-1、p21和LCAD基因表达的影响。方法:提取+GZ反复暴露后1h组及对照组大鼠心脏、主动脉组织总RNA,经半定量RT-PCR检测其mRNA水平。结果:+GZ反复暴露后心脏组织HO-1、p21和LCAD mRNA水平明显升高,主动脉组织中LCAD mRNA水平上调。结论:在+GZ反复暴露状态下,HO-1是心脏组织中一个早期重要的抗过氧化损伤,维持正常功能的保护性因子。

关键词： +Gz 暴露大鼠心脏

DnaJ类分子伴侣PBP基因的原核表达及兔抗PBP抗体的制备

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细胞与分子免疫学杂志 2005年第4期21卷 456-458页

作者：刘成刚朱美财李文石樱占志王荫静向培德空军总医院临床分子生物学中心北京100036

目的:在原核系统中表达DnaJ类分子伴侣感光受体外周蛋白结合蛋白(PBP)基因,并制备兔抗PBP的抗体鉴定其特性。方法:应用RTPCR从人胎脑组织总RNA中扩增PBPcDNA。测序后将其克隆到表达载体pET28a中,并在大肠杆菌中以IPTG诱导表达。表达产物... 详细信息

目的:在原核系统中表达DnaJ类分子伴侣感光受体外周蛋白结合蛋白(PBP)基因,并制备兔抗PBP的抗体鉴定其特性。方法:应用RTPCR从人胎脑组织总RNA中扩增PBPcDNA。测序后将其克隆到表达载体pET28a中,并在大肠杆菌中以IPTG诱导表达。表达产物经NiNTA亲和层析柱纯化后,用SDSPAGE进行鉴定。以所获纯化的PBP免疫新西兰白兔,制备兔抗PBP抗体。抗体的效价及特异性用Westernblot进行测定和分析。结果:扩增和克隆出了720bp的PBP基因。构建的重组质粒pET28aPBP在大肠杆菌中得到高表达,诱导表达的蛋白存在于包涵体和细菌裂解上清中,纯化的PBP经SDSPAGE鉴定呈单一条带。以纯化的PBP免疫兔,制备了兔抗PBP抗体。Westernblot鉴定证实,该抗体可与原核表达的PBP特异性结合,抗体效价为1∶1600。结论:在原核细胞中表达了具有生物学活性的PBP,并以其为免疫原制备了兔抗PBP的抗体,为进一步研究PBP的结构与生物学活性奠定了基础。

关键词： PBP 热休克蛋白基因表达多克隆抗体兔

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血小板生成素转导鼠T淋巴细胞的增殖和分化

免疫学杂志 1999年第1期15卷 24-26页

作者：赵建增郭子宽梅英杰空军总医院空军临床分子生物学研究中心

为探讨ＴＰＯ（血小板生成素）基因导入对Ｔ细胞增殖和分化影响的规律，将编码人ＴＰＯ的质粒ＤＮＡ６０μｇ用脂质体包裹后，经肌肉途径转导入Ｂａｌｂ／ｃ小鼠体内。用ＣＤ４和ＣＤ８的特异性抗体标记小鼠各种免疫组织中的Ｔ细胞，借... 详细信息

为探讨ＴＰＯ（血小板生成素）基因导入对Ｔ细胞增殖和分化影响的规律，将编码人ＴＰＯ的质粒ＤＮＡ６０μｇ用脂质体包裹后，经肌肉途径转导入Ｂａｌｂ／ｃ小鼠体内。用ＣＤ４和ＣＤ８的特异性抗体标记小鼠各种免疫组织中的Ｔ细胞，借助流式细胞术分析它们的组成和变化。结果发现ＴＰＯ基因导入使骨髓中的成熟和未成熟Ｔ细胞数量在经过短期下降后全部大幅度增多，胸腺未成熟Ｔ细胞增加；而脾脏和血液循环中成熟Ｔ细胞增多，特别是在血液中ＣＤ４阳性细胞的增加最为明显。这些特点大约在基因导入后两周内形成，并持续至少两周以上。本文所得的结果提示ＴＰＯ是一种免疫促进分子，ＴＰＯ基因导入后小鼠血液中多种淋巴因子的升高与它过量表达对Ｔ细胞的刺激有关。

关键词：血小板生成素免疫调节 T细胞

外源血小板生成素基因体内导入对循环免疫因子水平的影响

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中国免疫学杂志 1999年第3期15卷 103-105页

作者：赵建增刘丽梅英杰空军总医院空军临床分子生物学研究中心

目的：研究外源ＴＰＯ基因由质粒载体导入后，小鼠体内一些细胞因子的变化规律。方法：用脂质体将表达人ＴＰＯ的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｈＴＰＯ包裹后，注射到Ｂａｌｂ／ｃ鼠的后肢肌肉内，用ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血液中多种细胞... 详细信息

目的：研究外源ＴＰＯ基因由质粒载体导入后，小鼠体内一些细胞因子的变化规律。方法：用脂质体将表达人ＴＰＯ的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｈＴＰＯ包裹后，注射到Ｂａｌｂ／ｃ鼠的后肢肌肉内，用ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血液中多种细胞因子的水平。结果：在ＴＰＯｃＤＮＡ转移到体内后，血液中ＩＦＮγ、ＴＮＦα和ＩＬ２迅速升高。其中，ＩＦＮγ与血小板计数呈明显负相关，并且在血小板计数回落后，保持在对照水平的９～１２倍；ＴＮＦα仅在第１周内与之成正相关，但可达对照水平的１２０倍；ＩＬ２升高幅度较小，与ＴＰＯ水平相一致。血液中Ⅱ型组织相容性抗原分子也呈升高趋势，与ＩＬ２的变化类似；而Ⅰ型分子与ＴＮＦα的变化相似。结论：ＴＰＯ在多方面刺激了机体免疫机能，而免疫因子如ＩＦＮγ在血小板生成过程中起重要的调节作用。

关键词：血小板生成素免疫调节 IFN-γ TNF-α IL-2

应用增强化学发光法检测PCR扩增的人巨细胞病毒核酸

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中华微生物学和免疫学杂志 1994年第3期14卷 206-208页

作者：蔡庆卢强陈友纯林万明空军总医院临床分子生物学研究中心

本文报道用增强化学发光法（ＥＣＬ）检测ＰＣＲ扩增的人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）核酸。该检测系统用戊二醛将辣根过氧化物酶复合物（ＨＲｐ－ＰＢＱ－ＰＥＩ＋－ＮＨ３＋）与探针结合制成酶标基因探针。探针与靶ＤＮＡ结合后ＨＲＰ可催... 详细信息

本文报道用增强化学发光法（ＥＣＬ）检测ＰＣＲ扩增的人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）核酸。该检测系统用戊二醛将辣根过氧化物酶复合物（ＨＲｐ－ＰＢＱ－ＰＥＩ＋－ＮＨ３＋）与探针结合制成酶标基因探针。探针与靶ＤＮＡ结合后ＨＲＰ可催化检测系统中的发光底物，经增强剂将光信号放大，杂交信号通过Ｘ光片显影。实验证明，用ＥＣＬ检测ＰＣＲ扩增的ＨＣＭＶＤＮＡ产物，敏感性可达０．０１ｆｇ的ＤＮＡ片段，且仅与ＨＣＭＶＤＮＡ的扩增产物杂交。临床应用表明，此方法具有快速、简便、敏感、安全的特点。

关键词：聚合酶链反应巨细胞病毒