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蜜蜂克什米尔病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立和评价

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病毒学报 2021年第3期37卷 678-685页

作者：张体银邵碧英林素洁郑腾王武军张志灯福州海关技术中心福建省检验检疫技术研究重点实验室福州350003

蜜蜂克什米尔病毒(Kashmir bee virus,KBV)是一种高毒力的急性蜜蜂病毒,可以引起蜜蜂的死亡和蜂群崩溃。本研究旨在建立一种灵敏、快速检测KBV的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法。参照GenBank中polymerase polyprotein有关基因序列,设计... 详细信息

蜜蜂克什米尔病毒(Kashmir bee virus,KBV)是一种高毒力的急性蜜蜂病毒,可以引起蜜蜂的死亡和蜂群崩溃。本研究旨在建立一种灵敏、快速检测KBV的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法。参照GenBank中polymerase polyprotein有关基因序列,设计一组特异性引物和探针,并通过体外转录法制备RNA标准品作为阳性模板。在对反应体系进行优化的基础上,建立了KBV的实时荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样本验证。结果显示:该方法能有效扩增8×10^(0)拷贝/μL~8×10^(7)拷贝/μL的KBV标准品,建立的标准曲线呈现良好的线性关系。该方法的检测灵敏度为8拷贝/μL,对其他蜜蜂病毒不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示组内和组间的变异系数分别低于1%和2%,重复性良好。应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法的特异性优于常规RT-PCR。本研究建立的实时荧光RT-PCR检测具有良好的敏感性、特异性和重复性,为KBV的检测和流行病学调查提供技术支持。

关键词：蜜蜂克什米尔病毒实时荧光RT-PCR 检测方法

SERS活性基底的制备及其在腐竹中碱性橙Ⅱ的检测研究

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光谱学与光谱分析 2015年第11期35卷 3092-3095页

作者：许雪琴刘琼华杨方钱疆陈健林振宇邱彬食品安全分析与检测教育部重点实验室福建省食品安全分析与检测重点实验室福州大学化学系福建福州350108 福建省检验检疫技术研究重点实验室福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心福建福州350001

碱性橙Ⅱ是一种非食用物质,可能被非法用于食品染色。本文以十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）为表面活性剂,采用化学合成法制备了均匀的纳米金表面增强拉曼散射活性基底,建立了灵敏快速检测碱性橙Ⅱ的拉曼光谱检测方法。运用多元变量分析... 详细信息

碱性橙Ⅱ是一种非食用物质,可能被非法用于食品染色。本文以十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）为表面活性剂,采用化学合成法制备了均匀的纳米金表面增强拉曼散射活性基底,建立了灵敏快速检测碱性橙Ⅱ的拉曼光谱检测方法。运用多元变量分析方法验证各浓度之间存在显著性差异,选取碱性橙Ⅱ在1 594cm-1处的拉曼特征峰,单变量分析表明拉曼散射强度与碱性橙Ⅱ浓度的对数呈线性相关,线性范围0.001mmol·L-1~0.5mmol·L-1,相关系数r=0.990 2。将本法应用于腐竹中碱性橙Ⅱ的测定,在添加浓度为50和500μg·g-1时,添加回收率为82.4%~116.9%,相对标准偏差为3.8%~4.0%。与常规化学分析技术相比,本法具有无损、快速、环保、消耗化学试剂少、所需样品量少等特点,适于对大规模样品进行筛查。

关键词：表面增强拉曼光谱碱性橙Ⅱ 纳米金

超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱联用鉴定椴树蜂蜜中的抗氧化活性肽

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质谱学报 2020年第3期41卷 244-253,I0002页

作者：谢博傅红杨方福州大学生物科学与工程学院福建福州350108 福州海关技术中心福建福州350001 福建省检验检疫技术研究重点实验室福建福州350001 福州大学福建省海洋酶工程重点实验室福建福州350108

应用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱联用法(UPLC-Q-Exactive)鉴定椴树蜂蜜蛋白经胰蛋白酶水解后获得的肽类物质的组成和结构,并探讨椴树蜂蜜酶解多肽与其抗氧化活性的关系。椴树蜂蜜经三氯乙酸溶液沉淀,所得蛋白用胰蛋... 详细信息

应用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱联用法(UPLC-Q-Exactive)鉴定椴树蜂蜜蛋白经胰蛋白酶水解后获得的肽类物质的组成和结构,并探讨椴树蜂蜜酶解多肽与其抗氧化活性的关系。椴树蜂蜜经三氯乙酸溶液沉淀,所得蛋白用胰蛋白酶酶解,酶解肽段经C18固相萃取柱富集净化后,采用0.1%甲酸(A)-乙腈(B)作为流动相进行梯度洗脱,以高分辨质谱(Q-Exactive)的Full MS/ddMS2模式对其进行鉴定。采用MaxQuant软件分析质谱结果,所得肽段在Uniprot上进行Blast序列对比,共鉴定出52种椴树蜂蜜胰蛋白酶解多肽,其中71.15%来自蜂王浆主要蛋白(MRJPs),鉴定出的肽段归属于10种蛋白质,其中6种(60%)属于MRJP家族蛋白。对椴树蜂蜜酶解多肽质谱鉴定结果进行重复性分析,2次以上重复质谱分析可实现对椴树蜂蜜多肽(87.1%)的可靠鉴定。结合文献报道的蜂蜜多肽抗氧化活性的构效关系,筛选出11条可能具有抗氧化活性的多肽。化学合成11条多肽后,进行4种不同的抗氧化活性实验。结果表明,这11条多肽的抗氧化活性存在较大差异,其中1 g/L VIYEWK多肽显示出较强的ABTS自由基清除活性(33.8%±0.6%)、DPPH自由基清除活性(96.5%±0.0%),并表现出一定的还原力(0.010±0.001)和Fe2+螯合活性(4.0%±0.2%)。该方法能快速有效鉴定椴树蜂蜜多肽结构,可为揭示椴树蜂蜜多肽结构与抗氧化活性的关系提供依据。

关键词：多肽椴树蜂蜜超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Exactive) 抗氧化活性

检测蜜蜂急性麻痹病毒TaqMan实时荧光RT-PCR方法的建立和初步应用

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微生物学通报 2021年第12期48卷 5001-5007页

作者：张体银黄嫦娇田国宁林素洁王武军张志灯福州海关技术中心福建省检验检疫技术研究重点实验室福建福州350003 潍坊海关技术中心山东潍坊261041

【背景】蜜蜂急性麻痹病毒(Acute Bee Paralysis Virus,ABPV)是一种高毒力的蜜蜂病毒,可以引起蜜蜂的大批死亡和蜂群衰竭。【目的】建立一种快速、灵敏的ABPV实时荧光RT-PCR检测方法。【方法】根据ABPV衣壳蛋白基因保守序列设计引物和探... 详细信息

【背景】蜜蜂急性麻痹病毒(Acute Bee Paralysis Virus,ABPV)是一种高毒力的蜜蜂病毒,可以引起蜜蜂的大批死亡和蜂群衰竭。【目的】建立一种快速、灵敏的ABPV实时荧光RT-PCR检测方法。【方法】根据ABPV衣壳蛋白基因保守序列设计引物和探针,通过对引物、探针浓度和退火温度等反应条件进行优化,建立基于TaqMan探针检测ABPV的实时荧光RT-PCR方法,并对方法的灵敏性、特异性和稳定性进行验证。【结果】ABPV实时荧光RT-PCR检测方法在9.8×101-9.8×108 copies/μL之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R2为0.998,扩增效率为103.8%。该方法的检测灵敏度为9.8copies/μL;对其他蜜蜂病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性;重复性试验结果显示组内和组间的变异系数分别为0.19%-0.80%和0.57%-1.07%,重复性良好。对2018年-2019年在福建地区采集的70份蜜蜂样品进行ABPV检测,阳性率为2.86%。【结论】建立的ABPV实时荧光RT-PCR检测方法能用于该病的实验室检测、流行病学调查和疫情监测。

关键词：蜜蜂急性麻痹病毒实时荧光RT-PCR 衣壳蛋白基因

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多基因DNA条形码鉴定6个鳗鱼物种

食品科学 2018年第2期39卷 163-169页

作者：陈文炳邵碧英缪婷玉彭娟陈彬张志灯江树勋福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心福建省检验检疫技术研究重点实验室福建福州350003

建立6种鳗鱼的物种多基因DNA条形码精准鉴定方法。以鳗鱼DNA为模板,采用3对通用引物对6种鳗鱼的3个基因(16S rRNA、Cyt b、COⅠ)部分DNA片段进行聚合酶链式反应扩增、测序,结果6种鳗鱼各获得3条16S r DNA(638~643 bp)、Cyt b(464~466 bp... 详细信息

建立6种鳗鱼的物种多基因DNA条形码精准鉴定方法。以鳗鱼DNA为模板,采用3对通用引物对6种鳗鱼的3个基因(16S rRNA、Cyt b、COⅠ)部分DNA片段进行聚合酶链式反应扩增、测序,结果6种鳗鱼各获得3条16S r DNA(638~643 bp)、Cyt b(464~466 bp)、COⅠ(705~707 bp)基因部分DNA序列,从中选取各物种序列同源的片段设计3对新引物对6种鳗鱼的16S rRNA、Cyt b、COⅠ基因部分DNA片段进行PCR扩增,其产物大小分别为504~507、400、609 bp,再从各片段中筛选出具有6种鳗鱼物种特异性强的、碱基数分别为262、280、300 bp的3条DNA片段序列,作为6种鳗鱼物种的3个基因的标准DNA条形码,应用DNAMAN V6软件进行同源性分析,并通过Gen Bank数据库的比对验证,制定了供检测实践用的同源率判别指标,建立鳗鱼物种的多基因条形码检测方法。应用该方法对30个待检鳗鱼样品进行检测,结果表明,各样品基于3个基因DNA条形码的比对,符合同源率指标,物种判别结果互相吻合,从而精准判别样品的所属物种。该方法稳定、精准、易于操作,可应用于6种鳗鱼的物种鉴定,值得推广。

关键词： 16S rRNA基因 Cyt b基因 COⅠ基因多基因DNA条形码鳗鱼物种鉴定

蜜蜂慢性麻痹病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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中国动物传染病学报 2024年第3期32卷 72-78页

作者：张体银王武军林素洁张志灯李宋钰于师宇福州海关技术中心福建省检验检疫技术研究重点实验室福州350003

为建立慢性蜜蜂麻痹病毒(CBPV)快速诊断方法,本研究根据CBPV RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法,标准曲线具... 详细信息

为建立慢性蜜蜂麻痹病毒(CBPV)快速诊断方法,本研究根据CBPV RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法,标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数达0.998;该方法最低检出限为10拷贝/μL,与蜜蜂急性麻痹病毒等常见蜜蜂病毒无交叉反应,具有良好的灵敏性和特异性;组内和组间变异系数分别低于0.5%和2%,具有较好的稳定性。本研究建立的CBPV荧光定量RT-PCR检测方法,可用于实验室检测、流行病学调查和疫情监测。

关键词：蜜蜂慢性麻痹病毒荧光定量RT-PCR RNA依赖RNA聚合酶

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数字PCR技术在猪病检测中的研究进展

黑龙江畜牧兽医 2022年第24期 35-38,43页

作者：郑腾张体银李宋钰王武军张志灯林素洁于师宇福州海关技术中心/福建省检验检疫技术研究重点实验室福州350003

数字PCR(digital PCR,dPCR)技术是继常规PCR、实时荧光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR,qPCR)之后的第三代PCR基因检测技术,该技术不需要设置标准曲线,可实现绝对定量分析,具有敏感性和准确性高等特点,越来越多地被用... 详细信息

数字PCR(digital PCR,dPCR)技术是继常规PCR、实时荧光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR,qPCR)之后的第三代PCR基因检测技术,该技术不需要设置标准曲线,可实现绝对定量分析,具有敏感性和准确性高等特点,越来越多地被用于动物疫病的快速、准确检测。笔者主要介绍了dPCR技术的演变、原理、优缺点,尤其是在非洲猪瘟(African swine fever,ASF)、猪圆环病毒病(porcine circovirus disease,PCVD)、猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)、布鲁氏菌病(brucellosis)等常见猪病检测中的应用,以期为dPCR在动物疫病诊断中的推广应用提供参考。

关键词：数字PCR 猪病检测非洲猪瘟猪圆环病毒病伪狂犬病猪繁殖与呼吸综合征布鲁氏菌病

茶树秃房与茸房种质花器官差异表达基因的WGCNA分析

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园艺学报 2023年第3期50卷 620-634页

作者：王泽涵于文涛王鹏杰刘财国樊晓静谷梦雅蔡春平王攀叶乃兴福建农林大学园艺学院福州350002 福州海关技术中心福建省检验检疫重点实验室福州350001

以福建野生茶群体中的秃房和茸房种质为试验材料,对其花苞期和开放期花器官进行转录组测序分析,以期探明两种不同类型种质花器官在分子层面的差异。结果表明,两者之间的差异表达基因为2086~4733个,这些差异基因主要涉及植物与病原体的... 详细信息

以福建野生茶群体中的秃房和茸房种质为试验材料,对其花苞期和开放期花器官进行转录组测序分析,以期探明两种不同类型种质花器官在分子层面的差异。结果表明,两者之间的差异表达基因为2086~4733个,这些差异基因主要涉及植物与病原体的相互作用、类黄酮生物合成和谷胱甘肽代谢等途径。通过加权基因共表达网络(Weighted Gene Co-expression Network Analysis,WGCNA)方法鉴定到18个共表达基因模块,筛选出3个与茶树花器性状相关性最高的模块。通过计算模块内基因的连通性,挖掘网络中的核心基因并进行功能注释。研究结果表明秃房和茸房茶树花器官主要在应对胁迫和次生代谢产物的合成方面存在差异;秃房种质没有子房表皮茸毛,易受病原体入侵和逆境胁迫,通过调控GST(谷胱甘肽-S-转移酶)来提高自身应对胁迫的能力;CsLTP(脂质转运蛋白基因)可能是调控茶树子房茸毛发育起始的关键基因。

关键词：茶树秃房子房茸毛加权基因共表达网络分析转录组学

亲水色谱-轨道阱质谱检测饮料和酒类中36种色素

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分析试验室 2016年第8期35卷 880-884页

作者：钱疆陈健刘正才黄杰陈祥明张玉燕薛方财福建检验检疫局技术中心福建省检验检疫技术研究重点实验室福州350001

采用亲水色谱-静电场四极杆轨道阱质谱检测了饮料和酒类中36种合成色素。样品经调节p H、沉淀蛋白、稀释高速离心后上机。采用乙腈和缓冲盐梯度淋洗,亲水色谱柱分离。用静电场四极杆轨道阱质谱、电喷雾负离子源,选择离子扫描-数据依赖... 详细信息

采用亲水色谱-静电场四极杆轨道阱质谱检测了饮料和酒类中36种合成色素。样品经调节p H、沉淀蛋白、稀释高速离心后上机。采用乙腈和缓冲盐梯度淋洗,亲水色谱柱分离。用静电场四极杆轨道阱质谱、电喷雾负离子源,选择离子扫描-数据依赖的二级采集模式(Target SIM-dd MS2)检测。36种色素定量限为0.010~0.32 mg/kg。在0.50 mg/kg(n=6)水平添加,添加回收率在83.8%~98.2%之间,RSD为0.62%~9.3%。方法定性质量相对偏差在±5×10^(-6)之内。

关键词：轨道阱质谱亲水色谱合成色素高通量