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四种藏兽医药用植物和屎肠球菌联用对大肠杆菌E6生物被膜的影响

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中国动物传染病学报 2024年第2期32卷 12-20页

作者：谭敏杨丹娇汪露黄志宏陈朝喜西南民族大学畜牧兽医学院成都610041 四川省甘孜藏族自治州畜牧业科学研究所康定626000

采用改良结晶紫半定量法和微量肉汤稀释法分别对152株大肠杆菌进行生物被膜形成能力分析和12种常用抗菌药物敏感性试验。同时,利用棋盘稀释法评价四种藏兽医药用植物(马蹄黄、偏翅唐松草、华丽龙胆和岩生忍冬)不同提取部位(甲醇、二氯... 详细信息

采用改良结晶紫半定量法和微量肉汤稀释法分别对152株大肠杆菌进行生物被膜形成能力分析和12种常用抗菌药物敏感性试验。同时,利用棋盘稀释法评价四种藏兽医药用植物(马蹄黄、偏翅唐松草、华丽龙胆和岩生忍冬)不同提取部位(甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和石油醚)、屎肠球菌乙酸乙酯提取物与高耐药率抗生素(氯霉素、土霉素、氨苄西林和磺胺甲噁唑)联合对10株多重耐药大肠杆菌(E1-E10)杀菌活性,以探讨不同药物组合对E6生物被膜的清除作用。实验结果显示:152株大肠杆菌多表现为中等成膜能力和无成膜能力表型,对氯霉素、磺胺二甲嘧啶、土霉素、氨苄西林、磺胺甲噁唑的耐药率均高于90%,对二氟沙星、环丙沙星、阿米卡星、头孢噻呋、妥布霉素和头孢曲松的耐药率均低于50%,其中阿米卡星的敏感率最高,耐药率仅为19.90%;马蹄黄甲醇提取物、偏翅唐松草乙酸乙酯提取物、华丽龙胆甲醇提取物和岩生忍冬乙酸乙酯提取物、屎肠球菌S16和S17乙酸乙酯提取物对E1~E10的MIC范围分别为3.93~15.63、3.93~31.52,7.81~15.63、7.81~31.52、0.42~13.38和0.45~3.63 mg/mL;四种藏兽医药用植物不同提取部位和屎肠球菌乙酸乙酯提取物与高耐药率抗菌药物分别呈现不同的联合作用;在MIC浓度下,药物联合对E6表现出较强的生物被膜清除能力,其中岩生忍冬和偏翅唐松草乙酸乙酯提取物与土霉素和氨苄西林联用对E6生物被膜的抑制率高于其他组合,岩生忍冬和偏翅唐松草乙酸乙酯提取部位与土霉素联用的抑制率分别为48.92%、42.58%,与氨苄西林联用的抑制率分别为48.58%、47.84%。选用的四种藏兽医药用植物、益生菌和抗菌药物联合应用在一定程度上能够解决本研究藏猪和藏鸡源大肠杆菌耐药性和生物被膜形成等问题。

关键词：藏兽医药用植物生物被膜形成能力多重耐药性耐药谱型

产气荚膜梭菌α-β2-ε融合蛋白原核表达及其间接ELISA方法的建立

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微生物学通报 2024年第8期51卷 3189-3200页

作者：潘瑶任小侠胡云皓王雅茜刘燕蓝岚王豪杰岳怀宁吴建平朱良全四川省甘孜藏族自治州畜牧业科学研究所四川康定626000 中国兽医药品监察所北京100081

【背景】产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是引起牛魏氏梭菌病(猝死症)的主要病原,严重危害养牛业。酶联免疫吸附法(ELISA)是诊断疫病及抗体检测的重要手段。【目的】表达重组α-β2-ε融合蛋白,并以此为靶抗原建立间接ELISA抗体... 详细信息

【背景】产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是引起牛魏氏梭菌病(猝死症)的主要病原,严重危害养牛业。酶联免疫吸附法(ELISA)是诊断疫病及抗体检测的重要手段。【目的】表达重组α-β2-ε融合蛋白,并以此为靶抗原建立间接ELISA抗体检测方法,为临床检测牦牛***及流行病学调查提供技术支持。【方法】利用生物信息学软件(EditSeq、Protean)和Jameson-Wolf方法分析牛源***的α、β2和ε蛋白抗原指数,截取抗原指数较高肽段并用柔性Linker连接,经密码子优化后克隆至载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-32α-β2-ε,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,经培养、诱导表达、纯化后采用SDS-PAGE和Western blotting鉴定。以重组α-β2-ε融合蛋白作为包被抗原,经棋盘法和控制单一变量法优化反应条件,建立间接ELISA抗体检测方法,通过受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线确定临界值并对其敏感性、特异性、重复性和临床效果进行评价。【结果】α的241‒403肽段、β2的161‒355肽段、ε的154‒331肽段抗原指数较高,将它们连接并融合表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定融合蛋白表达正确。ELISA抗体检测方法最佳工作条件为:抗原包被浓度5μg/mL 4℃过夜或37℃孵育60 min;5%脱脂乳于37°C封闭1 h;血清稀释度为1:150于37°C孵育30 min;酶标二抗1:2000于37°C孵育30 min;避光显色10 min。检测临界值为0.4702;敏感性高,可检测阳性血清最大稀释度为1:3200;特异性强,与溶血性曼氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等阳性血清均无交叉反应;重复性好,批内和批间变异系数均小于10%。四川省甘孜藏族自治州部分地区共277份牦牛血清样品检测结果显示,***抗体阳性率为89.89%,与商品化产气荚膜梭菌α毒素ELISA检测试剂盒检测结果基本一致。【结论】成功制备重组α-β2-ε融合蛋白并建立检测***的间接ELISA抗体检测方法。

关键词：产气荚膜梭菌 α毒素 β2毒素 ε毒素融合表达间接ELISA

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藏猪源细环病毒的全基因组测序和分析

中国兽医杂志 2024年第10期60卷 32-39页

作者：杨丹娇范燕迪张敏刘怡雯叶忠明吴建平且华敏王靖皓周菡蓝岚周泷汤承甘孜藏族自治州畜牧业科学研究所四川康定626000 西南民族大学畜牧兽医学院四川成都610041

为了解四川省甘孜藏族自治州藏猪群体内猪细环病毒(TTSuV)的流行情况和遗传变异特点,本试验从该地区17个藏猪养殖场采集呼吸道症状明显的猪鼻拭子、肺脏组织和肺泡灌洗液样本共计101份进行宏基因组测序、TTSuV PCR检测和鉴定、全基因组... 详细信息

为了解四川省甘孜藏族自治州藏猪群体内猪细环病毒(TTSuV)的流行情况和遗传变异特点,本试验从该地区17个藏猪养殖场采集呼吸道症状明显的猪鼻拭子、肺脏组织和肺泡灌洗液样本共计101份进行宏基因组测序、TTSuV PCR检测和鉴定、全基因组和ORF1基因遗传演化和遗传变异分析以及ORF1蛋白氨基酸遗传变异分析和ORF1蛋白预测分析。结果显示,TTSuV总阳性率为19.8%(20/101),其中,TTSuV1总阳性率为6.93%(7/101),TTSuVk2总阳性率为15.84%(16/101),TTSuV1和TTSuVk2混合阳性率为2.97%(3/101);获得3株TTSuV全基因组序列,分别命名为Scgz-1(2 815 bp)、Scgz-2(2 578 bp)和Scgz-3(2 757 bp);3株毒株均属于TTSuVk2型,其中Scgz-1毒株属于TTSuVk2b亚型,Scgz-2和Scgz-3毒株属于TTSuVk2a亚型;3株毒株全基因组序列彼此之间的相似性为56.2%~74.9%,其中ORF1基因核苷酸序列相似性为53.6%~73.6%;3株毒株ORF1蛋白氨基酸序列与参考毒株氨基酸序列相似性为43.2%~98.5%,序列之间差异性均较大;3株毒株的ORF1蛋白均为不稳定蛋白且复杂。本试验对川西高原地区藏猪的TTSuV开展调查分析,发现藏猪群中流行TTSuV毒株基因变异较大,可为该地区藏猪呼吸道疾病的防控提供参考。

关键词：藏猪猪细环病毒流行性序列分析蛋白预测分析

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牛传染性腹泻病的防治技术研究

粮油与饲料科技 2024年第2期 168-170页

作者：宋子红甘南藏族自治州夏河县畜牧兽医工作站

牛传染性腹泻病是牛群养殖中常见的疾病之一，发生率较高，通常在冬季和早春更易发生，如果不能及时发现，牛群未得到有效的治疗，会引发大批牛腹泻，甚至造成大批牛死亡。在日常饲养中，引起牛腹泻的因素有很多，如细菌感染、病毒感染... 详细信息

牛传染性腹泻病是牛群养殖中常见的疾病之一，发生率较高，通常在冬季和早春更易发生，如果不能及时发现，牛群未得到有效的治疗，会引发大批牛腹泻，甚至造成大批牛死亡。在日常饲养中，引起牛腹泻的因素有很多，如细菌感染、病毒感染、饮食因素、寄生虫感染等，若一些因素同时出现，牛腹泻的可能性更大，此时临床表现更明显，病情更复杂。在养殖过程中，如果养殖户没有及时发现牛腹泻初期症状，就会错失治疗的最佳时机，影响后续的治疗效果。因此，分析牛日常生活中出现腹泻的因素、类型，深入研究牛传染性腹泻病的预防办法，根据牛表现出的具体病情提出针对性的、可行的治疗措施。

关键词：牛传染性腹泻病疾病防治

蝶豆花提取物-马铃薯氧化羟丙基淀粉/果胶指示标签的制备及应用

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食品与发酵工业 2024年第5期50卷 156-163页

作者：董春娟曹银娟苟俏敏余群力张丽曹晖孔祥颖甘肃农业大学食品科学与工程学院甘肃兰州730070 陕西秦宝牧业发展有限公司陕西宝鸡721000 青海省海北藏族自治州畜牧兽医科学研究所青海海北812200

为实现冷鲜牛肉新鲜度的无损、实时及可视化监测,以马铃薯氧化羟丙基淀粉(potato oxidized hydroxypropyl starch,POHS)和果胶(pectin,P)作为成膜基材,添加蝶豆花提取物(Clitoria ternatea extract,CT)制备智能指示标签(P/POHS/CT),并将该标签应用于冷鲜牛肉的货架期检测。结果表明,CT添加量为1.0%(体积分数)的标签性能最佳,其拉伸强度为16.62 MPa,溶胀度为367.68%,显著高于其他组(P<0.05),含水率为10.42%,水蒸气渗透率为1.32×10^(-7)g/(m·s·Pa),显著低于其他组(P<0.05),扫描电镜结构紧密,红外光谱显示各组分间相容性较好。在贮藏过程中,随着贮藏时间延长,冷鲜牛肉的pH值、挥发性盐基氮含量、硫代巴比妥酸反应物值及菌落总数均显著升高(P<0.05),贮藏第4天时为次级新鲜度,第7天时腐败,智能指示标签的色泽对应的从紫色变为蓝色、绿色。结果表明,适量CT的添加可以改善智能标签的性能,且该标签对冷鲜牛肉新鲜度的变化响应能力强,具有作为预测冷鲜牛肉新鲜度变化的智能包装材料的潜质。

关键词：马铃薯氧化羟丙基淀粉果胶蝶豆花提取物指示标签冷鲜牛肉

青藏高原4省牦牛源肠球菌分离鉴定及其毒力耐药基因与生物被膜检测

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中国兽医学报 2024年

作者：辛娇娇高桂琴赵小龙娄永志李晶潘自如德吉卓玛庆巴塔庆王祎祺苏雪繁常攀宋仁德孔祥颖石红梅罗晓林格桑卓玛索朗斯珠贡嘎西藏农牧学院动物科学学院甘肃省白银市白银区农业综合行政执法队西藏昌都市畜牧总站西藏自治区动物疫病预防控制中心青海玉树藏族自治州畜牧兽医工作站青海省海北藏族自治州畜牧兽医科学研究所甘南州畜牧工作站四川省草原科学研究院

为了解青藏高原牦牛源肠球菌流行情况，耐药性、毒力基因特点及生物被膜黏附能力情况。从青藏高原4省（西藏、四川、甘肃、青海）采集新鲜牦牛粪样346份，奶样311份，共计657份，对其进行细菌分离鉴定，16S rDNA基因检测并构建系统进化... 详细信息

为了解青藏高原牦牛源肠球菌流行情况，耐药性、毒力基因特点及生物被膜黏附能力情况。从青藏高原4省（西藏、四川、甘肃、青海）采集新鲜牦牛粪样346份，奶样311份，共计657份，对其进行细菌分离鉴定，16S rDNA基因检测并构建系统进化树。使用PCR方法对分离菌株进行耐药、毒力基因检测，利用18种抗菌药物进行药敏试验。采用改良半定量结晶紫染色法确定分离菌株生物被膜黏附能力。结果显示，肠球菌总分离率为32.27%，其中四川最高，达60.23%，其次甘肃、青海和西藏，分别为42.70%、23.47%和18.31%。从样品种类来看，粪样分离率为36.71%，奶样为27.33%。经PCR扩增得到大小约1400 bp目的条带，选取5株菌株进化分析单独聚成一簇。212株分离菌对克林霉素、庆大霉素、利奈唑胺、利福平、链霉素产生较高耐药性，并存在多种耐药现象，占60.85%。12种耐药基因只有5种被检测出，分别为erm(B)、tet(L)、tet(O)、tet(M)、ant(6)-Ia。13种毒力基因均有在肠球菌中检测出，其中cpd检出率为95.76%，gelE为91.98%，efaA为86.79%，asal为86.32%，其余的在5.19%-55.66%之间。而奶源肠球菌中暂未检测出fsr毒力基因。分离菌中强黏附能力占3.30%，弱黏附能力占48.59%，无黏附能力占48.11%。综上研究揭示了牦牛源肠球菌流行情况、耐药基因和毒力基因携带情况、生物被膜表型相关性，为掌握青藏高原牦牛源肠球菌研究数据奠定基础。

关键词：青藏高原牦牛肠球菌毒力基因耐药性生物被膜

高寒区披碱草属种质资源花序分支与种子产量的关系分析

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草地学报 2024年第3期32卷 804-811页

作者：于辉张永超刘文辉马兴赟青海大学青海省畜牧兽医科学院青海西宁810016 青海省海北藏族自治州草原站青海西海810029

披碱草属牧草生态适应性强,是青藏高原地区草地质量改善的主要种质资源。为探究披碱草属花序分支与未分支花序的种子产量差异及花序分支性状与种子产量的关系,本研究以来自青藏高原不同地区的75份披碱草属种质资源为试验材料,分析比较... 详细信息

披碱草属牧草生态适应性强,是青藏高原地区草地质量改善的主要种质资源。为探究披碱草属花序分支与未分支花序的种子产量差异及花序分支性状与种子产量的关系,本研究以来自青藏高原不同地区的75份披碱草属种质资源为试验材料,分析比较了发生分支和未发生分支的花序种子产量,同时对花序分支性状与种子产量进行相关性分析、主成分分析和通径分析。结果发现:花序分支种子产量均显著高于花序未发生分支的种子产量(P<0.05);分支穗种子重、总花序重、分支穗种子数、小穗数与种子产量关系密切,相关系数分别为:0.94,0.99,0.71和0.86。试验结果表明,在生产中可通过增加总花序重、分支穗种子数、主轴种子数来增加分支穗种子重,进而显著提高种子产量。披碱草属花序分支性状对种子产量影响较大,可为披碱草属牧草种质资源筛选利用和小麦族的育种提供帮助。

关键词：披碱草属花序分支种子产量

2012—2021年青藏高原牦牛源沙门菌流行病学调查

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中国动物传染病学报 2024年第1期32卷 202-206页

作者：班马泽郎李天娇周赛赛吴丹卢姊豪宋仁德罗晓林赵索南马进寿参木友石红梅索朗斯珠西藏农牧学院动物科学学院林芝860000 青海玉树藏族自治州畜牧兽医工作站玉树815400 四川省草原科学研究院成都610097 青海省海北畜牧兽医科学研究所海北812200 青海省大通种牛场大通810102 西藏农牧科学院草原研究所拉萨850000 甘南州畜牧工作站甘南747000

为了明确青藏高原地区牦牛感染沙门菌(SE)情况,该研究采用ELISA双抗体夹心法,对2012—2021年采集自西藏、青海、甘肃、四川1725份牦牛血清样品进行SE抗体检测。结果显示:1725份牦牛血清中检测出SE抗体总阳性率为23.54%(406/1725),西藏... 详细信息

为了明确青藏高原地区牦牛感染沙门菌(SE)情况,该研究采用ELISA双抗体夹心法,对2012—2021年采集自西藏、青海、甘肃、四川1725份牦牛血清样品进行SE抗体检测。结果显示:1725份牦牛血清中检测出SE抗体总阳性率为23.54%(406/1725),西藏地区牦牛SE阳性率与其他地区相比较高;2012—2021年青藏高原地区牦牛血清SE抗体年阳性率分别为7.35%、46.02%、15.31%、17.68%、8.79%、19.84%、6.04%、23.64%、14.81%、74.64%;牦牛在不同海拔感染SE的阳性率分别为13.67%(2900~3400 m)、14.61%(3400~3900 m)、28.62%(3900~4400 m)、34.72%(4400 m以上);不同性别牦牛感染SE平均阳性率分别为公(25.61%)、母(21.99%);4省牦牛感染SE阳性率分别为西藏(27.67%)、青海(13.50%)、甘肃(13.33%)、四川(1.89%)。本研究结果可为了解青藏高原牦牛SE病的流行病学情况,提供参考。

关键词：青藏高原牦牛沙门菌流行病学

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11种致牛腹泻病原一步法多重PCR/RT-PCR检测方法的建立

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微生物学通报 2024年

作者：金美君胡云皓辛凌翔刘燕潘瑶王秀丽赵浩然汤承陈曦李锦铨朱良全中国兽医药品监察所华中农业大学四川省甘孜藏族自治州畜牧业科学研究所西南民族大学

【背景】单病原或多病原混合感染导致的牛腹泻综合征严重制约养牛业发展，病原快速准确诊断是防控该病的重要前提。【目的】建立11种致牛腹泻的细菌或病毒病原一步法多重PCR/RT-PCR检测方法，实现快速诊断病原。【方法】通过文献检索，... 详细信息

【背景】单病原或多病原混合感染导致的牛腹泻综合征严重制约养牛业发展，病原快速准确诊断是防控该病的重要前提。【目的】建立11种致牛腹泻的细菌或病毒病原一步法多重PCR/RT-PCR检测方法，实现快速诊断病原。【方法】通过文献检索，调查了引起牛腹泻病的主要病原及其高覆盖率的引物，选择以产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens） α-toxin、肠道沙门氏菌（Salmonella enterica） invA、大肠杆菌（Escherichia coli） K99、牛肠道病毒（BEV） 5′-UTR、牛星状病毒（BAstV） ORF1a、牛轮状病毒（BRoV） VP6、牛嵴病毒（BKoV） D4、牛诺如病毒（BNoV） ORF1、牛冠状病毒（BCoV） N、牛环曲病毒（BToV） N、牛病毒性腹泻黏膜病病毒（BVDV） 5′-UTR为靶标序列的引物，通过温度梯度PCR及单一控制变量法优化退火温度、引物浓度、循环数，建立11种病原的多重PCR/RT-PCR检测方法，对该方法进行了特异性、灵敏度和重复性评价，并应用该方法进行临床样品检测。【结果】最佳退火温度为54.4 ℃，C. perfringens、S. enterica、E. coli K99、BEV、BAstV、BRoV、BKoV、BNoV、BCoV、BToV和BVDV对应基因片段最优引物浓度分别为0.2、0.25、0.25、0.2、0.25、0.25、0.35、0.5、0.25、0.25、0.3 μmol/L，最优循环数为35个循环。该方法特异性强，仅对靶标病原检测为阳性，对溶血性曼氏杆菌（Mansiella haemolyticus）、化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）、牛支原体（Mycoplasma bovine）分离株等病原检测均为阴性；敏感性高，对重组质粒标准品最低检出限依次为7.5×103、7.5×104、7.5×103、7.5×101、7.5×104、7.5×102、7.5×103、7.5×102、7.5×102、7.5×104、7.5×103copies/μL；重复性好，批间与批内试验均一致。用该方法检测江苏地区临床样品490份，结果显示，BEV、BAstV、BRoV、BKoV、BNoV、BCoV、BToV、BVDV阳性率分别0.61%、0.41%、0.61%、0.21%、27.14%、3.27%、0.21%、1.02%。通过单重PCR对该多重PCR临床样品检测结果进行重复验证，结果显符合率为100%。随机挑选50个检测为阳性的PCR产物进行测序验证，结果均为相应病原的基因片段。【结论】成功建立一种同时检测11种牛腹泻主要病原的一步法多重PCR/RT-PCR检测方法。

关键词：牛腹泻细菌病毒多重PCR RT-PCR