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4个基因在副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织中DNA甲基化与mRNA表达联合验证

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中国畜牧兽医 2024年第4期51卷 1651-1659页

作者：杨雅琼程鸿星梁明霞刘玉兰付书林张晶陈洪波任红艳郭玲晁哲武汉轻工大学动物科学与营养工程学院动物遗传繁育与精准养殖实验室武汉430023 海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室海口570312 武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室武汉430023 动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室武汉430070

【目的】验证候选基因在副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis,GPS)感染仔猪脑组织中DNA甲基化与mRNA表达之间的联合调控关系,为揭示副猪嗜血杆菌引起仔猪脑膜炎的表观致病机理提供理论依据。【方法】选取6头28日龄断奶仔猪,随机均分为... 详细信息

【目的】验证候选基因在副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis,GPS)感染仔猪脑组织中DNA甲基化与mRNA表达之间的联合调控关系,为揭示副猪嗜血杆菌引起仔猪脑膜炎的表观致病机理提供理论依据。【方法】选取6头28日龄断奶仔猪,随机均分为对照组和GPS组,GPS组仔猪腹腔注射1 mL 2×109 CFU/mL副猪嗜血杆菌SH0165菌液,对照组仔猪腹腔注射等量生理盐水,7 d后采集仔猪脑组织提取DNA和RNA。采用实时荧光定量PCR检测4个候选基因(LYPD1、PITPNM1、SYP、ACVR1B)的mRNA表达量,并利用重亚硫酸盐测序(bisulfite sequencing PCR,BSP)、甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测副猪嗜血杆菌感染前后4个基因在仔猪脑组织中的DNA甲基化变化。【结果】本研究成功将MSP方法应用于基因的DNA甲基化测序研究,使其不局限于定点检测甲基化位点。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,GPS组仔猪LYPD 1、PITPNM 1、SYP、ACVR 1 B基因mRNA表达均显著或极显著下调(P<0.05;P<0.01)。DNA甲基化测序结果显示,除ACVR 1 B基因外,各基因DNA甲基化均上调。【结论】除ACVR 1 B基因外,LYPD 1、PITPNM 1、SYP 3个基因DNA甲基化与mRNA表达水平呈反向关联调控,副猪嗜血杆菌感染后仔猪脑组织DNA甲基化变化对4个候选基因的表达具有不同的调控模式。

关键词：副猪嗜血杆菌 LYPD 1基因 PITPNM 1基因 SYP基因 ACVR 1 B基因 DNA甲基化

体外靶向筛选小鼠精子特异性PRSS37基因最适siRNA

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生物技术 2024年

作者：高斯赵萍刘晓雅方桂杰任红艳毕延震湖北工业大学生物工程与食品学院发酵工程教育部重点实验室湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室

[目的]细胞水平靶向筛选出小鼠精子特异性PRSS37基因的最适si RNA序列。[方法]构建PRSS37过表达载体pc DNA3.1-Kozak-3×Flag-PRSS37,将过表达载体转染至GC-2细胞Western Blot检测PRSS37的异位表达。基于PRSS37设计并合成3对si RNA序列,... 详细信息

[目的]细胞水平靶向筛选出小鼠精子特异性PRSS37基因的最适si RNA序列。[方法]构建PRSS37过表达载体pc DNA3.1-Kozak-3×Flag-PRSS37,将过表达载体转染至GC-2细胞Western Blot检测PRSS37的异位表达。基于PRSS37设计并合成3对si RNA序列,将PRSS37过表达载体和si RNA共转染于GC-2细胞,实时荧光定量PCR检测si RNA对PRSS37干扰效率,筛选最有效的si RNA。[结果]PRSS37过表达载体在GC-2细胞中成功表达,与对照组相比实验组中PRSS37蛋白表达显著升高;设计合成的3对si RNA均能有效干扰PRSS37的表达,与未干扰组相比差异显著(P<0.05),其中si RNA-1干扰效率最高,干扰效率约为63%。[结论]成功实现了PRSS37在GC-2中的异位表达,细胞水平筛选出小鼠PRSS37最适si RNA序列。

关键词：丝氨酸蛋白酶37 表达载体异位表达 siRNA 共转染干扰效率

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不同日龄非洲鸵鸟盲肠微生物多样性分析

家畜生态学报 2024年

作者：蒋金凤谢洋张妍周峰兰忠岐沈爽罗青平王家乡李鹏南京农业大学动物科技学院湖北省农业科学院畜牧兽医研究所宜昌市夷陵区畜牧兽医服务中心长江大学动物科学技术学院

盲肠是机体消化粗纤维,促进营养物质发酵的主要部位,有着庞大的微生物群落,许多动物的盲肠微生物已被分析研究,而非洲鸵鸟的相关研究还未见报道。因此,本试验采用宏基因组学测序技术对7日龄、30日龄、60日龄和180日龄非洲鸵鸟盲肠中的... 详细信息

盲肠是机体消化粗纤维,促进营养物质发酵的主要部位,有着庞大的微生物群落,许多动物的盲肠微生物已被分析研究,而非洲鸵鸟的相关研究还未见报道。因此,本试验采用宏基因组学测序技术对7日龄、30日龄、60日龄和180日龄非洲鸵鸟盲肠中的微生物进行多样性分析。结果显示,非洲鸵鸟盲肠中的微生物群分布于9个菌门,16个菌纲,29个菌目,58个菌科和128个菌属,且随着日龄增加,盲肠中微生物的丰富度和多样性先增高后降低,其中60日龄时微生物最丰富,30日龄时微生物多样性最高。门水平上,7日龄、60日龄和180日龄均以厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)为最优势菌门,而30日龄时的优势菌门为厚壁菌门、柔膜菌门(Tenericutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes);属水平上,各日龄盲肠中的优势菌属均不相同,7日龄时不动杆菌属(Acinetobacter)、大肠埃希氏菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)、阿克曼菌属(Ackermansia)丰度最高,30日龄时厌氧原体属(Anaeroplasma)和拟杆菌属(Bacteroides)丰度最高,不动杆菌属和假单胞菌属(Pseudomonas)分别为60日龄和180日龄时的优势菌属;各日龄盲肠中均存在差异菌群,7日龄、30日龄、60日龄和180日龄时分别有28个、24个、8个和6个差异菌群,随着日龄增大,差异菌群的数量逐渐减少。综上显示,非洲鸵鸟盲肠微生物复杂多样,且随着日龄的增加,微生物组成及优势物种会产生变化,这为进一步研究年龄对肠道微生物的影响以及肠道微生物与机体之间的相互作用提供理论依据。

关键词：非洲鸵鸟盲肠肠道微生物宏基因组学

山羊circFDXR的鉴定及其在卵巢颗粒细胞中高效表达的研究

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中国畜牧兽医 2024年第6期51卷 2330-2341页

作者：刘杰李之瀚郭聪慧冯光杭薛文哲刘德武柳广斌孙宝丽郭勇庆邓铭邹娴李耀坤华南农业大学动物科学学院广州510642 华南农业大学畜禽育种国家地方联合工程研究中心广州510642 华南农业大学广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室广州510642 广东省农业科学院动物科学研究所畜禽育种国家重点实验室广东省畜禽育种与营养研究重点实验室广州510640

【目的】鉴定山羊环状RNA(circular RNA,circRNA)铁氧还蛋白还原酶(circFDXR)的表达,建立其在山羊原代卵巢颗粒细胞中的高效表达方式。【方法】利用PCR扩增、DNA测序、RNase R酶消化、实时荧光定量PCR鉴定circFDXR的环状性质。通过核质... 详细信息

【目的】鉴定山羊环状RNA(circular RNA,circRNA)铁氧还蛋白还原酶(circFDXR)的表达,建立其在山羊原代卵巢颗粒细胞中的高效表达方式。【方法】利用PCR扩增、DNA测序、RNase R酶消化、实时荧光定量PCR鉴定circFDXR的环状性质。通过核质分离、荧光原位杂交(FISH)检测circFDXR亚细胞定位。利用同源重组将circFDXR的线性序列无缝克隆至慢病毒载体pLC5-ciR,转染至293T细胞包装病毒后进行病毒滴度测定,并确定最佳感染复数(MOI),并以最佳MOI感染山羊原代卵巢颗粒细胞,通过实时荧光定量PCR检测过表达效率,并测序验证circFDXR是否正确环化。【结果】山羊circFDXR主要定位于卵巢颗粒细胞的细胞质中,耐受RNase R酶的消化。成功构建circFDXR慢病毒过表达载体,浓缩病毒滴度为5.49×10~9 TU/mL,感染山羊卵巢颗粒细胞的最佳MOI为100。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,过表达组circFDXR表达量极显著升高(P研究circFDXR在山羊原代卵巢颗粒细胞中的功能奠定了理论基础。

关键词：山羊 circFDXR 慢病毒包装卵巢颗粒细胞

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肠舌状绦虫线粒体基因组特征及系统发育分析

畜牧兽医学报 2024年

作者：陈秀琴邱阳元吕庆博黄梅清福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心吉林大学动物医学学院人兽共患病研究所人兽共患病研究教育部重点实验室

本研究旨在获得肠舌状绦虫线粒体基因组全序列，了解其序列的结构特征，探究肠舌状绦虫系统发育相关信息。从麦穗鱼中获得肠舌状绦虫，提取基因组DNA，通过Illumina测序技术对肠舌状绦虫的线粒体全基因组进行测序、组装和注释，并进行... 详细信息

本研究旨在获得肠舌状绦虫线粒体基因组全序列，了解其序列的结构特征，探究肠舌状绦虫系统发育相关信息。从麦穗鱼中获得肠舌状绦虫，提取基因组DNA，通过Illumina测序技术对肠舌状绦虫的线粒体全基因组进行测序、组装和注释，并进行生物信息学分析；从GenBank数据库中下载8个科34种绦虫的线粒体基因组序列，运用最大似然法和贝叶斯法构建系统发育树。结果显示，肠舌状绦虫线粒体基因组全长为13 655 bp，A+T含量为67.6%，其碱基组成具有明显的AT偏向性。肠舌状绦虫线粒体基因组包括12个蛋白编码基因（protein-coding genes， PCGs）、22个tRNA基因、2个rRNA基因和2个非编码控制区。在12个PCGs中，除cox3基因使用TTG作为起始密码子外，其余11个PCGs均使用ATG作为起始密码子；终止密码子方面，5个PCGs使用TAA，5个PCGs使用TAG，而cox3基因和nad3基因均没有终止密码子。PCGs使用密码子频率最高的是UUA，最低的是CGA。22个tRNA基因总长为1 272 bp，大多数tRNA能形成典型的三叶草结构，但是trnS1和trnR由于缺少二氢尿嘧啶臂无法形成典型的三叶草结构。nad2、nad6和nad4基因更适合作为肠舌状绦虫的分子标记。系统发育树结果表明，肠舌状绦虫与双线绦虫亲缘关系最近，并与双槽头属绦虫（Dibothriocephalus）形成姐妹群。本研究获得了肠舌状绦虫的线粒体全基因组，为研究肠舌状绦虫的分类学和系统学提供参考。

关键词：肠舌状绦虫线粒体基因组结构特征系统发育

安徽新安江水牛mtDNA D-Loop区遗传多样性与系统进化研究

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中国草食动物科学 2024年第1期44卷 1-7页

作者：赵拴平金海刘峻李永胜金磊李倩徐磊贾玉堂安徽省农业科学院畜牧兽医研究所畜禽产品安全工程安徽省重点实验室合肥230031 休宁县畜牧兽医技术推广站休宁245000 黄山市畜牧兽医推广中心黄山245700

试验旨在分析安徽省黄山市新安江流域上游地区新安江水牛群体的分子遗传特性,探究其母系起源与遗传多样性。利用PCR扩增和测序技术测定28头新安江水牛的mtDNA D-Loop序列,下载GenBank数据库中24个中国水牛群体的693条D-Loop序列,利用生... 详细信息

试验旨在分析安徽省黄山市新安江流域上游地区新安江水牛群体的分子遗传特性,探究其母系起源与遗传多样性。利用PCR扩增和测序技术测定28头新安江水牛的mtDNA D-Loop序列,下载GenBank数据库中24个中国水牛群体的693条D-Loop序列,利用生物信息学分析其遗传多样性,构建Neighbor-joining系统发生树和Media-joining网络,探索不同水牛群体的遗传距离。结果显示,28头新安江水牛的mtDNA D-Loop序列共有117个变异位点,构成25种单倍型,其核苷酸多样性为0.02602±0.00303,单倍型多样性为0.989±0.014。新安江水牛群体的变异性水平与中国其他水牛群体接近。N-J系统进化树显示,新安江水牛25个单倍型分为A、B两个支系,具有A支系和B支系2个母系来源,其中A支系占据主导地位。Media-joining进化网络显示,中国水牛主要为沼泽型水牛,分为沼泽型水牛A支系和B支系,B支系又分为b1亚支系和b2亚支系。综上,新安江水牛群体变异水平与中国其他地方水牛群体接近,群体遗传多样性丰富;且新安江水牛属于沼泽型水牛,具有2个线粒体母系来源,与我国其他地方水牛群体具有一定的遗传距离。

关键词：水牛线粒体DNA 遗传多样性单倍型

生物素连接酶BirA及其突变体在病原与宿主互作研究中的应用进展

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生物工程学报 2024年第7期40卷 1981-1996页

作者：张含煜李鹏飞廖浙屿张梦佳孙玉梅张敏何启盖李文涛农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室湖北武汉430070 华中农业大学动物医学院湖北武汉430070 农业农村部兽用诊断制剂创制重点实验室湖北武汉430070 湖北洪山实验室湖北武汉430070 宜昌市畜牧兽医中心湖北宜昌443000

蛋白质是机体进行生命活动的主要承担者,研究蛋白质的亚细胞定位及蛋白质之间的相互作用对了解蛋白质功能、阐述机体内分子机制至关重要。邻近标记技术是最新发展的能够在活细胞中检测蛋白质相互作用的有效方法之一。相较于传统研究蛋... 详细信息

蛋白质是机体进行生命活动的主要承担者,研究蛋白质的亚细胞定位及蛋白质之间的相互作用对了解蛋白质功能、阐述机体内分子机制至关重要。邻近标记技术是最新发展的能够在活细胞中检测蛋白质相互作用的有效方法之一。相较于传统研究蛋白质相互作用的方法,邻近标记技术具有灵敏度高、特异性强和背景低等优势,被广泛应用于病原与宿主间蛋白质的相互作用研究中。本文对近些年生物素连接酶BirA及其突变体的发展和应用进行了综述,阐述了几种经典生物素连接酶的作用原理,以期进一步明确基于BirA及其突变体的邻近标记技术在病原-宿主间蛋白质相互作用鉴定中的重要作用。

关键词：蛋白质相互作用邻近标记 BirA 生物素

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鹅VDR基因克隆及其多克隆抗体制备与鉴定

中国畜牧兽医 2024年第3期51卷 1194-1202页

作者：秦逸飞陈蓉施振旦仲恺农业工程学院动物科技学院广州510225 江苏省农业科学院畜牧研究所农业农村部种养结合重点实验室南京210014

【目的】维生素D3(vitamin D3,VD3)是一类重要的类固醇激素,参与调控动物体内多种生理活动,具有生物活性的VD3代谢物1,25(OH)2D3通过与维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)结合发挥生物学功能。试验旨在克隆鹅VDR基因CDS序列并制备鹅VD... 详细信息

【目的】维生素D3(vitamin D3,VD3)是一类重要的类固醇激素,参与调控动物体内多种生理活动,具有生物活性的VD3代谢物1,25(OH)2D3通过与维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)结合发挥生物学功能。试验旨在克隆鹅VDR基因CDS序列并制备鹅VDR多克隆抗体,为后续开展VDR介导VD3调控鹅体内多种生理活动的分子机制研究提供基础支撑。【方法】通过基因克隆方法获得鹅VDR基因CDS序列,并采用生物信息学方法对其编码蛋白进行结构和功能预测分析。通过基因合成和亚克隆方法构建鹅VDR基因重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达和镍柱纯化后获得鹅VDR重组蛋白。以纯化的鹅VDR重组蛋白作为免疫原,制备兔抗鹅VDR多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体效价,采用Western blotting检测抗体特异性。【结果】试验成功克隆了鹅VDR基因编码区序列,长度为1356 bp,编码451个氨基酸残基。该编码蛋白与鸡VDR蛋白的相似性高达91.4%,无信号肽和跨膜结构域,N-端含有核定位序列,且含有DNA结合域和配体结合域2个保守结构域,属于类固醇/甲状腺激素受体超家族成员。试验成功构建了pET-30a(+)-VDR重组质粒,并诱导表达鹅VDR重组蛋白。纯化后的重组蛋白纯度高达90%以上,且大小符合预期(52 ku)。试验制备了兔抗鹅VDR多克隆抗体,其抗体效价>1∶1093500;除肝脏组织外,该多克隆抗体在产蛋鹅肾脏、十二指肠、空肠和回肠组织中均能够识别天然VDR蛋白的2种亚型。【结论】试验成功克隆了鹅VDR基因CDS序列,并制备了兔抗鹅VDR多克隆抗体,该多克隆抗体特异性高,可用于后续鹅体内VDR介导的生物学功能研究。

关键词：鹅 VDR基因克隆多克隆抗体

CRISPR/Cas9技术高效制备山羊SOCS2基因编辑胚胎

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 129-141页

作者：张晨俭李隐侠丁强刘伟佳王慧利何南吴家顺曹少先南京农业大学动物科技学院南京210095 江苏省农业科学院畜牧研究所江苏省畜禽精准育种工程研究中心农业农村部种养结合重点实验室南京210014 山东农业大学动物科技学院泰安271017

旨在设计、筛选高效编辑山羊胚胎生长负调控因子SOCS2基因的sgRNA,为通过SOCS2基因编辑创制快长型山羊奠定技术基础。本研究利用在线网站对山羊SOCS2基因SH2结构域保守序列设计2条sgRNA,构建表达载体,体外转录获得sgRNA及Cas9 mRNA;体... 详细信息

旨在设计、筛选高效编辑山羊胚胎生长负调控因子SOCS2基因的sgRNA,为通过SOCS2基因编辑创制快长型山羊奠定技术基础。本研究利用在线网站对山羊SOCS2基因SH2结构域保守序列设计2条sgRNA,构建表达载体,体外转录获得sgRNA及Cas9 mRNA;体外检测sgRNA+Cas9蛋白切割靶DNA的效率;在此基础上将屠宰场山羊卵巢分离培养的442个孤雌胚胎进行分组,2个试验组显微注射sgRNA和Cas9 mRNA混合物,对照组注射超纯水,以单个囊胚全基因组DNA扩增产物为模板,PCR扩增靶区域并测序鉴定,发生编辑的样本进行T-A克隆测序检测编辑形式;根据在线网站预测,每条sgRNA选择5个错配数最少的潜在脱靶位点进行脱靶检测。结果表明,在SOCS2基因83和96号氨基酸密码子附近区域获得2条sgRNA并成功构建表达载体,体外转录获得高质量sgRNA和Cas 9 mRNA;两条sgRNA均可引导Cas9蛋白在体外完全切割靶DNA;SOCS2-sg-83对胚胎的编辑效率为94.1%,160个T-A克隆中有152个在靶位点出现插入、缺失或替换,概率为95.0%,其中81.3%发生了移码突变,9.4%的克隆缺失83号氨基酸密码子,累计90.6%的克隆实现了SOCS2基因功能性敲除;SOCS2-sg-96对胚胎的编辑效率为50.0%,80个T-A克隆中有70个在靶位点出现插入、缺失或替换,概率为87.5%,移码突变概率为75.0%,5.0%的克隆缺失了96号氨基酸密码子,累计80.0%的克隆实现了SOCS2基因功能性敲除。另外,在所有已编辑胚胎中均未发现脱靶。综上,SOCS2-sg-83可实现山羊胚胎SOCS2基因的高效、精准编辑和敲除,为高效制备SOCS2基因敲除山羊,培育快长型肉用山羊奠定了技术基础。

关键词：山羊胚胎细胞因子信号传导抑制因子2 CRISPR/Cas9 基因编辑