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D-阿洛酮糖3-差向异构酶的功能表征及其高活性突变体的高通量筛选

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微生物学通报 2025年

作者：高鑫杨锋毛淑红路福平秦慧民工业发酵微生物教育部重点实验室天津科技大学生物工程学院工业酶国家工程实验室

【背景】稀少糖D-阿洛酮糖(D-allulose)是一种理想的低能量甜味剂替代品，其在食品加工和医疗健康领域具有广泛的应用前景。D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase， DAEase)是生物法催化D-果糖异构化生成D-阿洛酮糖的关键酶... 详细信息

【背景】稀少糖D-阿洛酮糖(D-allulose)是一种理想的低能量甜味剂替代品，其在食品加工和医疗健康领域具有广泛的应用前景。D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase， DAEase)是生物法催化D-果糖异构化生成D-阿洛酮糖的关键酶。【目的】基于酶数据库进行新酶基因的挖掘，拓宽DAEase的酶库资源，并结合理性设计筛选获得催化性能优良的新型DAEase酶分子。【方法】将来源于氧化微杆菌(Microbacterium oxydans) 的新酶基因 (MoDAEase)构建重组表达系统，研究该酶的酶学性质，通过分子结构模型预测，理性设计突变热点氨基酸，结合高通量筛选平台筛选潜在的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体。【结果】重组目标蛋白实现可溶性表达，酶最适反应条件为60 ℃，pH 8.0，且在40-60 ℃及pH 6.5-8.5条件下具有较好稳定性。筛选获得催化效率提高5.35倍的优势突变体M110S/P249G，且用于转化100、300、及500 g/L的D-果糖时，均展示出优良的催化性能。【结论】本研究从氧化微杆菌中挖掘得到了一种DAEase的新酶，并筛选得到催化活性显著提高的优势突变体，为酶法合成D-阿洛酮糖提供了理论及实践依据。

关键词： D-阿洛酮糖 D-阿洛酮糖3-差向异构酶定向进化超高通量筛选

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代谢工程改造酵母生产琥珀酸的研究进展

微生物学报 2025年第2期65卷 467-488页

作者：顾子蕴唐永圣陈修来江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡

琥珀酸是一种重要的四碳二羧酸,广泛应用于食品、医药和化工等行业。与传统基于石化原料的化学合成方法相比,微生物发酵法生产琥珀酸是一种更具经济性和环境友好性的替代方案,具有较大的应用潜力。酵母具有良好的环境耐受性,因此酵母细... 详细信息

琥珀酸是一种重要的四碳二羧酸,广泛应用于食品、医药和化工等行业。与传统基于石化原料的化学合成方法相比,微生物发酵法生产琥珀酸是一种更具经济性和环境友好性的替代方案,具有较大的应用潜力。酵母具有良好的环境耐受性,因此酵母细胞工厂生产琥珀酸逐渐成为研究热点。本文以酵母生产琥珀酸为出发点,综述了构建酵母细胞工厂生产琥珀酸的相关代谢工程与调控策略,包括琥珀酸合成路径构建、辅因子供应优化、跨膜转运改造等,总结了利用廉价原料进行琥珀酸生物合成的最新研究进展,探讨了增强酵母菌株抗逆性的方法,最后展望了酵母在琥珀酸生物合成中的未来发展前景。

关键词：代谢工程微生物细胞工厂酵母琥珀酸

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代谢工程改造马克斯克鲁维酵母生产l-乳酸

生物工程学报 2025年

作者：王雨欣李晓敏刘佳高聪刘立明安徽科技学院食品工程学院江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室

l-乳酸作为一种重要的有机酸，在食品、医药和生物塑料等领域广泛应用。传统的l-乳酸生产主要依赖乳酸菌，但由于其对底物要求高且对酸性环境的耐受性差，导致其工业化应用面临一定挑战。相比之下，马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces mar... 详细信息

l-乳酸作为一种重要的有机酸，在食品、医药和生物塑料等领域广泛应用。传统的l-乳酸生产主要依赖乳酸菌，但由于其对底物要求高且对酸性环境的耐受性差，导致其工业化应用面临一定挑战。相比之下，马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）因其快速生长、耐高温、底物利用广泛等优势，成为了乳酸生产的潜在宿主。为了优化马克斯克鲁维酵母的l-乳酸生产能力，本研究对其进行了代谢工程改造。首先，筛选并表征了高效的乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase， LDH），然后利用CRISPR基因编辑技术在不同基因位点过表达LDH并敲除编码丙酮酸脱羧酶的基因PDC1，构建了菌株LA2.1，其l-乳酸产量达到72.6 g/L。通过筛选并组合耐酸靶点，进一步提升了菌株的耐酸性和乳酸产量。最终，通过工艺优化，菌株LA4.3发酵72 h积累了112.4 g/L的l-乳酸，得率为84%。在降低CaCO3使用量的条件下，l-乳酸产量达到101.5 g/L，发酵结束后的pH值为3.52。本研究为l-乳酸的高效生产提供了理论基础和技术支持。

关键词： l-乳酸马克斯克鲁维酵母耐酸性代谢工程

体外靶向筛选小鼠精子特异性PRSS37基因最适siRNA

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生物技术 2025年第1期 20-24页

作者：高斯赵萍刘晓雅方桂杰任红艳毕延震湖北工业大学生物工程与食品学院发酵工程教育部重点实验室湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室

[目的]细胞水平靶向筛选出小鼠精子特异性PRSS37基因的最适siRNA序列。[方法]构建PRSS37过表达载体pcDNA3.1-Kozak-3×Flag-PRSS37,并将其转染至GC-2细胞，通过Western Blot检测PRSS37的异位表达。基于PRSS37序列设计并合成3对siRNA序... 详细信息

[目的]细胞水平靶向筛选出小鼠精子特异性PRSS37基因的最适siRNA序列。[方法]构建PRSS37过表达载体pcDNA3.1-Kozak-3×Flag-PRSS37,并将其转染至GC-2细胞，通过Western Blot检测PRSS37的异位表达。基于PRSS37序列设计并合成3对siRNA序列，将PRSS37过表达载体和siRNA共转染于GC-2细胞，实时荧光定量PCR检测siRNA对PRSS37干扰效率，筛选最有效的siRNA。[结果]PRSS37过表达载体在GC-2细胞中成功表达，与对照组相比，实验组中PRSS37蛋白表达显著升高；设计合成的3对siRNA均能有效干扰PRSS37的表达，与未干扰组相比差异显著(P<0.05),其中siRNA-1干扰效率最高，干扰效率约为63%。[结论]成功实现了PRSS37在GC-2细胞中的异位表达，并在细胞水平筛选出小鼠PRSS37最适siRNA序列。

关键词：丝氨酸蛋白酶37 表达载体异位表达 siRNA 共转染干扰效率

茶叶不同添加方式对太平猴魁绿茶啤酒风味影响

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食品与发酵工业 2025年第1期51卷 81-89页

作者：林睿吴殿辉彭政聪谢广发陆健工业生物技术教育部重点实验室粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心江南大学生物工程学院江苏无锡214122 浙江省污染暴露与健康干预重点实验室浙江树人学院生物与环境工程学院浙江杭州310015

绿茶作为辅料增添啤酒风味已被众多研究者们广泛关注,但绿茶的添加方式对啤酒风味的影响鲜有研究。该文将太平猴魁以3种不同投料方式加入到啤酒的发酵中,来研究清香型绿茶投料方式对啤酒挥发性风味物质的影响。采用GC-MS对不同组啤酒的... 详细信息

绿茶作为辅料增添啤酒风味已被众多研究者们广泛关注,但绿茶的添加方式对啤酒风味的影响鲜有研究。该文将太平猴魁以3种不同投料方式加入到啤酒的发酵中,来研究清香型绿茶投料方式对啤酒挥发性风味物质的影响。采用GC-MS对不同组啤酒的风味物进行鉴定分析,通过对多种风味物质的香味活性值(odor activity values,OAV)筛选以及偏最小二乘-判别分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA),研究不同工艺下绿茶啤酒的香气组分差异和关键香气组分标记物。结果表明,不同工艺下太平猴魁绿茶啤酒的挥发性成分差异显著(P<0.05)。在太平猴魁绿茶啤酒中,以OAV≥0.1筛选出了20种香气成分,其中β-紫罗兰酮、异戊醛、β-环柠檬醛、蘑菇醇和香茅醇这5种挥发性成分来源于太平猴魁,并且在冷萃的条件下能更多保留这类风味成分,使得啤酒具有更加丰富的风味属性。根据PLS-DA模型进一步筛选得到了9种变量投影重要性值大于1的物质,其中月桂酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂醇、正癸醛和壬醛这类香气化合物对啤酒的清香和花香风味属性具有重要贡献,可作为区分不同工艺下太平猴魁绿茶啤酒的香气组分标记物。

关键词：绿茶啤酒太平猴魁气相色谱-质谱联用挥发性成分偏最小二乘-判别分析

于细胞培养鱼肉生产的乌鳢前脂肪细胞高效分离与培养

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食品与发酵工业 2025年

作者：张夕敏李妍关欣堵国成江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江南大学未来食品科学中心江苏省合成生物基础研究中心

为了高效获取种子细胞以促进细胞培养鱼肉的工业化生产，该研究建立了一种高效可行的乌鳢前脂肪细胞分离和培养技术。该文探讨了胶原酶消化时间和用量对细胞分离效率的影响，检测了细胞外基质对细胞增殖的影响，并利用免疫荧光染色和成... 详细信息

为了高效获取种子细胞以促进细胞培养鱼肉的工业化生产，该研究建立了一种高效可行的乌鳢前脂肪细胞分离和培养技术。该文探讨了胶原酶消化时间和用量对细胞分离效率的影响，检测了细胞外基质对细胞增殖的影响，并利用免疫荧光染色和成脂诱导实验鉴定了乌鳢前脂肪细胞的生物学特性，最后评估了细胞的体外增殖能力。结果显示，以0.25%的型胶原酶进行组织消化，酶用量为2 mL胶原酶每克脂肪组织，消化时间为45 min时前脂肪细胞的分离效率最高；每克脂肪组织的初始细胞释放量可达5 × 106个，贴壁培养后每克脂肪组织的细胞收获数可达1 × 105个；用1%猪明胶预包被有利于前脂肪细胞的增殖；成脂诱导后细胞分化率达100%，表明所培养的细胞具有生产培养脂肪的潜力；分离所获的乌鳢前脂肪细胞可体外连续培养54 d，传代至第6代，细胞扩增约70倍。综上，该研究为未来大规模的细胞扩增和细胞培养鱼肉的工业化生产提供了基础。

关键词：培养脂肪细胞培养鱼肉未来食品细胞分离乌鳢前脂肪细胞胶原酶

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)利用未脱毒纤维素水解液开放式发酵产甘油

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食品与发酵工业 2025年第05期 70-77页

作者：赵晓红宗红陆信曜诸葛斌江南大学工业生物技术教育部重点实验室江南大学生物工程学院工业微生物及多元醇研究设计中心

未脱毒水解液中的醛类、酚类等物质抑制菌株的生长发酵。产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)具有多重抗逆性能，过表达相关抗性基因构建重组菌株并进行筛选。相比于对照菌株，过表达CgGCN4的重组菌株在含有3.0 g/L糠醛、2.0 g/L香... 详细信息

未脱毒水解液中的醛类、酚类等物质抑制菌株的生长发酵。产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)具有多重抗逆性能，过表达相关抗性基因构建重组菌株并进行筛选。相比于对照菌株，过表达CgGCN4的重组菌株在含有3.0 g/L糠醛、2.0 g/L香草醛、3.5 g/L乙酸的高糖培养基中生物量分别提高25.2%、14.6%、5.2%;葡萄糖消耗速率分别提高9.9%、5.5%、13.1%;在3.0 g/L糠醛的胁迫下甘油产量提高23.4%。在糠醛、香草醛或乙酸的胁迫下，重组菌株胞内活性氧水平的提高程度分别降低35.2%、28.0%、15.3%,与碘化丙啶的结合水平均有不同程度的降低，表明重组菌株可通过降低胞内活性氧的积累、保持细胞膜的完整性来保持菌株优良的生长与发酵性能。将抗性重组菌株应用于未脱毒甘蔗渣水解液开放式发酵生产甘油，可使耗糖速率提高20.0%;生物量提高12.3%;甘油产量提高21.7%。该研究为未脱毒纤维素水解液的应用提供了新思路及遗传资源。

关键词：产甘油假丝酵母未脱毒水解液 GCN4 甘油糠醛香草醛乙酸开放式发酵

耐盐产香埃切假丝酵母的筛选、特性分析及其在豆瓣酱的应用

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食品与发酵工业 2025年第2期51卷 68-76页

作者：邢先雷左汶骏汪溢恒左宗炽刘福明刘春凤郑飞云王金晶李崎钮成拓江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 楚雄云泉酱园有限责任公司云南楚雄675000 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

为丰富豆瓣酱的风味,从自然发酵酱醅中筛选得到一株耐盐产香酵母,经鉴定为埃切假丝酵母(Starmerella etchellsii)Y18。该酵母的耐盐性较好,能耐受200 g/L盐度,且具有较好的产香代谢能力。将Y18菌株豆瓣酱发酵过程中进行生物强化接种,能... 详细信息

为丰富豆瓣酱的风味,从自然发酵酱醅中筛选得到一株耐盐产香酵母,经鉴定为埃切假丝酵母(Starmerella etchellsii)Y18。该酵母的耐盐性较好,能耐受200 g/L盐度,且具有较好的产香代谢能力。将Y18菌株豆瓣酱发酵过程中进行生物强化接种,能够显著提高酱醅中的挥发性风味物质种类和含量,具有更强的果香和酱香,其中酯类和醇类物质的种类分别增加26种和3种,含量分别提高了8.28倍和6.71倍。此外,接种埃切假丝酵母Y18酱醅中苯乙酸乙酯、苯乙醇、3-甲硫基丙醇和2,3,5-三甲基吡嗪等重要挥发性风味物质的含量也有显著的提高。因此,埃切假丝酵母Y18有利于提升酱醅的风味,在豆瓣酱的工业化生产过程中具有潜在的应用价值。

关键词：埃切假丝酵母耐盐代谢特性筛选豆瓣酱

瑞士乳杆菌与耐酸乳杆菌复合强化对液态发酵食醋风味的影响

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食品与发酵工业 2025年第1期51卷 143-150页

作者：黄浩伦陆震鸣柴丽娟张晓娟许泓瑜李信史劲松许正宏江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏无锡214122 江苏恒顺醋业股份有限公司江苏镇江212143 江南大学生命科学与健康工程学院江苏无锡214122

该研究将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)与耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)分阶段接种于液态发酵食醋的发酵过程中,以提升食醋品质。采用高效液相色谱、顶空固相微萃取-气质联用和电子舌等分析方法,对液态发酵食醋的有... 详细信息

该研究将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)与耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)分阶段接种于液态发酵食醋的发酵过程中,以提升食醋品质。采用高效液相色谱、顶空固相微萃取-气质联用和电子舌等分析方法,对液态发酵食醋的有机酸含量、挥发性化合物含量进行分析并对其进行感官评价。结果表明,*** L-6与*** L-9复合强化后,液态发酵食醋总酸可达5.15 g/100 mL;还原糖残留量为3.41 g/L;乳酸、丙酮酸含量提升显著,其中乳酸含量提升幅度最大,可达12.8 g/L;复合强化可以显著提升乙酸乙酯、乳酸乙酯、苯乙酸等具有花果香、奶香和甜香风味的挥发性化合物含量;感官评价结果表明,两种乳酸菌分阶段复合强化发酵的食醋甜味和鲜味增加且酸味明显减弱,风味品质明显提升。该研究证实了在液态发酵食醋的发酵过程中进行*** L-6与*** L-9复合强化,有助于优化食醋有机酸组成,提升食醋的风味品质,为食醋的酿造工艺优化和产品创新提供参考。

关键词：乳酸菌液态发酵食醋生物强化有机酸风味