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融合大肠杆菌素DNA结合域的Taq DNA聚合酶的性质表征

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生物工程学报 2024年第3期40卷 812-820页

作者：王亚平平啸寅赵艺刘阳吴林马立新湖北大学生命科学学院省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室湖北武汉430062

Taq DNA聚合酶发现自水生热栖菌(Thermus aquaticus),是一种同时具有逆转录酶活性以及DNA聚合酶活性的工具酶。Colicin E(简称CE)蛋白质是一类以维生素受体BtuB为跨膜受体的大肠杆菌素,其中CE2、CE7、CE8和CE9是非特异性的DNase型大肠... 详细信息

Taq DNA聚合酶发现自水生热栖菌(Thermus aquaticus),是一种同时具有逆转录酶活性以及DNA聚合酶活性的工具酶。Colicin E(简称CE)蛋白质是一类以维生素受体BtuB为跨膜受体的大肠杆菌素,其中CE2、CE7、CE8和CE9是非特异性的DNase型大肠杆菌素。Taq DNA聚合酶由5′→3′核酸外切酶结构域、3′→5′核酸外切酶结构域以及聚合酶结构域组成。缺失5′→3′核酸外切酶结构域的Taq DNA聚合酶(ΔTaq)具有更高的产量,但是其进行性很低,无法扩增长片段。为了提高ΔTaq的进行性,本研究融合dCE和ΔTaq,发现dCE-ΔTaq的进行性相比于Taq DNA聚合酶和dCE-Taq显著提升,并且其逆转录酶活性也比ΔTaq更高。dCE8-ΔTaq的提升最明显,不仅能够1 min内扩增8 kb的DNA片段,并且产量高于其他突变体。综上所述,本研究通过将ΔTaq DNA聚合酶和dCE进行融合,提升了Taq DNA聚合酶的PCR效率和逆转录活性,为改造Taq DNA聚合酶提供了新的方法,有望开发出性质更好的Taq DNA聚合酶。

关键词： Taq DNA聚合酶 CE PCR效率逆转录活性

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碳水化合物结合域对木聚糖酶酶学性质的影响

生物技术通报 2024年第5期40卷 269-279页

作者：蒋文萍冉秋萍刘家书张慧敏张迪江正兵李华南湖北大学省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室武汉430062 湖北大学生命科学学院武汉430062

【目的】旨在探究不同来源碳水化合物结合域(CBM)对山毛榉木聚糖的结合能力,并将具有较高结合能力的外源CBM融合到链霉菌L10904木聚糖酶(XYN)的C端和N端,以探究外源CBM对木聚糖酶酶学性质的影响。【方法】通过底物吸附方法,利用考马斯亮... 详细信息

【目的】旨在探究不同来源碳水化合物结合域(CBM)对山毛榉木聚糖的结合能力,并将具有较高结合能力的外源CBM融合到链霉菌L10904木聚糖酶(XYN)的C端和N端,以探究外源CBM对木聚糖酶酶学性质的影响。【方法】通过底物吸附方法,利用考马斯亮蓝G250法检测溶液中CBM在吸附前后的浓度,计算CBM的底物结合率,筛选到了结合木聚糖能力较好的CBM1和CBM4。为了探究对底物结合能力高的CBM融合位置对木聚糖酶酶学性质的影响,将CBM1和CBM4通过柔性连接肽分别与XYN的C端和N端融合,并在大肠杆菌中表达获得4种重组酶,分别命名为CBM1-XYN、XYN-CBM1、CBM4-XYN和XYN-CBM4。【结果】CBM1和CBM4与木聚糖结合率分别为89%和95%。在60℃,pH 7.0反应条件下,XYN、CBM1-XYN、XYN-CBM1、CBM4-XYN和XYN-CBM4的比活力分别是32 274.81、49 342.21、602.48、230.42和2 362.24 U/mg,CBM1-XYN比活力较XYN比活力提高了1.5倍。酶学性质分析表明,CBM1使XYN温度稳定性和pH稳定性得到了提高,将XYN和CBM1-XYN分别在60℃孵育1 h,CBM1-XYN残余酶活力和XYN残余酶活力分别为81%和28%;在pH 3-11范围内,CBM1-XYN在4℃孵育12 h后能够保持90%以上的酶活力。【结论】在大肠杆菌中成功异源表达了链霉菌来源的木聚糖酶,筛选到了对底物结合率高的两种CBM1和CBM4,并通过蛋白质融合技术成功将CBM融合到XYN上,获得酶学性质得到改良的CBM1-XYN,能够提高木聚糖酶的温度稳定性、pH耐受性及比酶活。

关键词：碳水化合物结合域木聚糖酶融合蛋白可溶性表达比活力温度稳定性 pH稳定性

TEAD1转录本的鉴定及其在鸡前脂肪细胞中的功能研究

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生物化学与生物物理进展 2024年第1期51卷 215-229页

作者：彭敏徐虎贾子秋杨清竹潘林王维禹孔令喆孙婴宁齐齐哈尔大学生命科学与农林学院生物技术系齐齐哈尔161006

目的 TEAD1转录因子1 (TEAD1)在前脂肪细胞中表达,但是功能还不清楚。本研究旨在探讨TEAD1的两个转录本对永生化鸡前脂肪细胞系(immortalized chicken preadipocyte 1,ICP1)细胞增殖、迁移、凋亡和分化的影响。方法克隆TEAD1基因的全... 详细信息

目的 TEAD1转录因子1 (TEAD1)在前脂肪细胞中表达,但是功能还不清楚。本研究旨在探讨TEAD1的两个转录本对永生化鸡前脂肪细胞系(immortalized chicken preadipocyte 1,ICP1)细胞增殖、迁移、凋亡和分化的影响。方法克隆TEAD1基因的全长序列,对获得的两个转录本进行生物信息学分析。利用间接免疫荧光分析TEAD1转录本的亚细胞定位。通过RT-qPCR、CCK-8和EdU等方法,检测过表达TEAD1转录本对ICP1细胞增殖的影响。利用划痕实验检测TEAD1转录本对ICP1细胞迁移的影响。利用细胞凋亡-Hoechst染色和RT-qPCR,分析过表达TEAD1转录本对ICP1细胞凋亡的影响。通过RT-qPCR检测TEAD1转录本在不同组织、不同细胞系和ICP1细胞分化过程中的表达。利用油红O染色、BODIPY染色、RT-qPCR、Western blot和双荧光素酶报告基因技术,分析过表达TEAD1转录本对ICP1细胞脂滴积累及成脂相关基因转录的影响。最后,测定过表达TEAD1转录本的ICP1细胞中甘油三酯(TG)含量。结果克隆TEAD1全长编码区,鉴定出两个TEAD1转录本。TEAD1-V1主要定位于细胞核,TEAD1-V2定位于细胞质与细胞核。过表达TEAD1-V1和TEAD1-V2均抑制ICP1细胞增殖。过表达TEAD1-V1促进ICP1细胞迁移,而过表达TEAD1-V2对ICP1细胞迁移没有影响。且过表达TEAD1-V1和TEAD1-V2均促进ICP1细胞凋亡。两个转录本在不同组织和细胞系中的表达模式相似,在前脂肪细胞分化过程中的表达先下降后上升。过表达TEAD1-V1能显著减少ICP1细胞中脂滴的积累(P0.05)。过表达TEAD1-V1能显著降低ICP1细胞中甘油三脂的含量(P0.05)。结论本研究首次克隆并鉴定了鸡TEAD1基因的两个转录本。过表达转录本TEAD1-V1和TEAD1-V2抑制鸡前脂肪细胞增殖并且促进鸡前脂肪细胞凋亡;TEAD1-V1抑制前脂肪细胞分化并促进前脂肪细胞迁移,而TEAD1-V2对前脂肪细胞分化和迁移没有影响。

关键词： TEAD转录因子1 鸡转录本 ICP1

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原核Argonaute的应用研究进展

华中农业大学学报 2024年第4期43卷 82-93页

作者：王飞李文强刘洋王珑瑜陈晚苹崔佳凯马立新省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室/工业生物技术湖北省重点实验室/湖北大学生命科学学院武汉430062

原核生物Argonautes(pAgos)是参与细胞防御外来DNA入侵的可编程核酸酶。在体外,pAgos可以结合小的单链核酸(ssDNA/ssRNA)向导来识别和切割互补DNA/RNA。在体内,pAgos优先靶向多拷贝遗传元件、噬菌体和质粒,从而抑制入侵核酸的扩增和噬... 详细信息

原核生物Argonautes(pAgos)是参与细胞防御外来DNA入侵的可编程核酸酶。在体外,pAgos可以结合小的单链核酸(ssDNA/ssRNA)向导来识别和切割互补DNA/RNA。在体内,pAgos优先靶向多拷贝遗传元件、噬菌体和质粒,从而抑制入侵核酸的扩增和噬菌体感染。pAgos作为一类新兴的可编程核酸酶,比目前应用最为广泛的CRISPR-Cas系统更具灵活性,在生物技术方面展现出巨大的潜力。早期的研究聚焦于嗜热的pAgo,目前基于嗜热pAgos的主要应用包括分子诊断和体外DNA组装。为了推进基于Ago的体内生物技术,如基因编辑的应用,研究人员的焦点逐渐转移到中温生物来源的pAgos,虽然目前pAgos还未实现基因组编辑,但是随着越来越多的pAgo被发掘以及研究人员对pAgos催化机制的深入研究,有望开发基于pAgos的下一代基因编辑技术。本文总结了已知代表性pAgos和基于pAgos发展的生物技术,并简要分析了pAgos在原核生物和真核生物体内应用面临的挑战和可能的应对策略。

关键词：可编程核酸酶原核Argonaute 基因编辑分子诊断 DNA组装

水稻OsCNGC10基因抗倒伏性以及抗旱性功能研究

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作物学报 2024年第5期50卷 1351-1360页

作者：朱忠林文月周棋巫燕飞杜雪竹盛锋湖北大学生命科学学院/省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室湖北武汉430062 湖北洪山实验室湖北武汉430062

环核苷酸门控离子通道是一种配体门控的阳离子通道,存在于动物和植物体内,是真核生物信号级联反应的重要组成部分。本研究利用水稻环核苷酸门控离子通道(cyclic nucleotide-gated channel,OsCNGC10)基因,构建了超表达载体pU1301-CNGC10-... 详细信息

环核苷酸门控离子通道是一种配体门控的阳离子通道,存在于动物和植物体内,是真核生物信号级联反应的重要组成部分。本研究利用水稻环核苷酸门控离子通道(cyclic nucleotide-gated channel,OsCNGC10)基因,构建了超表达载体pU1301-CNGC10-Flag和双靶点敲除载体pRGEB32-CRISPR/cas9-cngc10,通过农杆菌介导的遗传转化法获得敲除和过表达材料,并从T2代中分离到纯合植株oscngc10-2及OE-CNGC10-6。转基因植株茎秆特性以及抗倒伏性分析表明,突变体oscngc10-2茎秆强度和抗倒伏性增强;茎秆细胞壁组织切片以及组织成分分析则表明突变体oscngc10-2植株抗倒伏性增强是由于茎秆细胞壁茎壁厚度、薄壁组织细胞丰度以及木质素含量增加所致;过表达OsCNGC10降低了茎秆壁厚、茎秆木质素含量以及茎秆细胞壁细胞丰度,敲除OsCNGC10增加了茎秆木质素含量且增加了茎秆细胞壁薄壁细胞丰度,初步证明OsCNGC10与水稻茎秆细胞壁成分合成相关,负调控水稻抗倒伏性;T2代田间试验结果表明,与野生型相比,突变体oscngc10-2植株的株高、有效穗、穗长、穗粒数、结实率、千粒重和单株产量等农艺性状显著提升;苗期干旱胁迫实验结果表明,在干旱胁迫下,OsCNGC10基因缺陷型植株体内丙二醛(MDA)含量积累速度加快,且无法形成足够的游离脯氨酸,而过表达OsCNGC10植株在遭受干旱胁迫时,体内游离脯氨酸(Pro)含量大量升高,且MDA积累速度相对变慢,初步说明OsCNGC10正向调控水稻苗期抗旱性。本研究结果表明水稻OsCNGC10可能在水稻抗倒伏及抗旱方面有潜在功能,为培育抗倒伏且高产的水稻新品种提供了理论基础和新的种质资源。

关键词：水稻 OsCNGC10 抗倒伏抗旱细胞壁

沼泽红假单胞菌重组LH2表达体系的构建及功能评价

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微生物学通报 2024年

作者：黄晓萍罗家福林若欣赵春贵杨素萍华侨大学生物工程与技术系

【背景】外周捕光色素蛋白复合体（peripherallight-harvestingcomplex，LH2）在光合作用中执行光能捕获和传递功能，对于不产氧光合细菌（anoxygenicphototrophicbacteria，APB）的光合生长至关重要。在APB中，LH2的αβ亚基通常是由... 详细信息

【背景】外周捕光色素蛋白复合体（peripherallight-harvestingcomplex，LH2）在光合作用中执行光能捕获和传递功能，对于不产氧光合细菌（anoxygenicphototrophicbacteria，APB）的光合生长至关重要。在APB中，LH2的αβ亚基通常是由多拷贝pucBA基因编码，尤其是红假单胞菌属菌株，可高达5-7拷贝。由于不同pucBA基因合成的异质性LH2彼此之间难以分离纯化，极大限制了LH2结构与功能的深入研究。【目的】构建以沼泽红假单胞菌为宿主菌的重组LH2表达体系，利用该重组表达体系在体内和体外评价LH2的光能传递活性。【方法】以5对pucBA基因全部缺失的沼泽红假单胞菌CGA009（ΔpucBA）为宿主菌，采用基因重组方法，以pucBAd和mrfp（红色荧光蛋白基因）基因共表达产物为检测指标，对表达载体进行遗传改造和启动子筛选；采用光谱法测定重组菌的生物量和基因表达产物光谱特征，以及纯化LH2的光谱特征、光合色素分析和能量传递活性。【结果】T7启动子(PT7)和T7RNA聚合酶基因联合使用，可使pucBAd和mrfp在ΔpucBA宿主菌中共表达。用启动子PbadR、PpckA和Pars替换PT7，启动子活性从高到低依次为PpckA、Pars、PbadR和PT7，并与重组菌mrfp基因表达量、pucBAd表达产物（d-LH2）合成量和光合生长速率呈正相关关系，其中以PpckA启动子构建的重组LH2表达体系ΔpucBA（pucBAd）表达活性最高。在此基础上，以CGA009菌株的pucBAa基因（编码a-LH2）替换ΔpucBA（pucBAd）菌株的pucBAd基因，获得ΔpucBA（pucBAa）重组菌。与ΔpucBA（pucBAa）重组菌相比，低光时ΔpucBA（pucBAd）重组菌生长速率显著升高，高光时有升高趋势，但未呈显著差异。纯化的d-LH2和a-LH2分别呈现典型的B800-only和B800-850特征光谱，d-LH2产生～863 nm荧光的量子效率高于a-LH2，但采用经典法测定的类胡萝卜素（carotenoids， Cars）到细菌叶绿素（bacteriochlorophylls， BChs）的光能传递效率却低于a-LH2，2种结果不一致的原因是“经典法”未考虑不同光谱类型LH2对～863 nm光子吸收的差异。【结论】构建沼泽红假单胞菌的重组LH2表达系统，从基因纯LH2水平和重组菌光合生长水平评价了多拷贝pucBA基因菌株中2种不同光谱类型的LH2能量传递活性，证明异常光谱LH2（d-LH2）能量传递活性高于典型光谱LH2（a-LH2），本研究为多拷贝pucBA菌株光适应过程中LH2形成和组装的分子调控机制的全面理解奠定了基础。

关键词：不产氧光合细菌沼泽红假单胞菌重组LH2 光能传递量子效率

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新时代背景下遗传学课程教学改革探索

创新教育研究 2024年第2期12卷 523-528页

作者：李海涛李圣纯湖北大学生命科学学院湖北武汉

遗传学是一门研究生物遗传和变异规律的科学,是高等院校生物、农林及医学等相关专业的一门重要基础课程。现代生物技术的飞速发展,促使了遗传学教学内容的不断扩充。在课时有限的情况下,如何保证课堂教学质量成为一个至关重要的问题。... 详细信息

遗传学是一门研究生物遗传和变异规律的科学,是高等院校生物、农林及医学等相关专业的一门重要基础课程。现代生物技术的飞速发展,促使了遗传学教学内容的不断扩充。在课时有限的情况下,如何保证课堂教学质量成为一个至关重要的问题。为适应新时代的人才培养要求,遗传学课程教学改革势在必行。本文以湖北大学生命科学学院遗传学课程为例,通过借助网络课堂、重构教学内容、整合科学前沿和社会热点等多个方面进行了改革探索。此外,我们还注重思想政治教育的融入,有助于提高学生综合素质,以期达到立德树人的根本目的。

关键词：遗传学教学改革思政教育

三个大豆ms3雄性不育突变体的等位突变分析

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植物遗传资源学报 2024年第6期25卷 967-977页

作者：朱玉雪黄圆圆徐研付爱根徐敏余君萍西北大学生命科学学院/西部资源与生物技术教育部重点实验室/陕西省生物技术与生化工程重点实验室西安710069

大豆雄性不育系对发挥大豆杂种优势具有重要价值,然而传统的三系杂交存在恢复系来源受限等问题,而环境敏感型细胞核雄性不育系在不同条件下育性可以改变。本文对ms3(Washington)、ms3(Flanagan)和ms3(Plainview)3个独立突变体的表型和... 详细信息

大豆雄性不育系对发挥大豆杂种优势具有重要价值,然而传统的三系杂交存在恢复系来源受限等问题,而环境敏感型细胞核雄性不育系在不同条件下育性可以改变。本文对ms3(Washington)、ms3(Flanagan)和ms3(Plainview)3个独立突变体的表型和突变位点展开了进一步研究,分别进行了不育表型鉴定、高通量测序、分子标记设计及突变位点验证、分析突变对MS3蛋白结构的影响、ms3(Plainview)花药半薄切片等实验。实验结果表明突变体花粉大量败育,只有零星被I_(2)-KI染液染成黑色的不规则花粉粒。高通量测序结果显示,ms3(Washington)和ms3(Flanagan)在MS3第3个外显子的PHD编码区域出现了大片段插入,导致MS3蛋白PHD结构域被破坏,这个等位基因命名为ms3-1;ms3(Plainview)在MS3第1个外显子缺失了一个A,导致移码突变,开放读码框仅编码40个氨基酸,蛋白功能完全丧失,这个等位基因命名为ms3-2。半薄切片结果显示,在花药发育中后期ms3(Plainview)的绒毡层和花粉发育出现异常。综上,本研究的结果为ms3的应用和MS3基因改造提供了材料和依据。

关键词：大豆细胞核雄性不育 MS3 PHD结构域

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LncRNA 606938抑制结直肠癌细胞增殖

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中国生物化学与分子生物学报 2024年第7期40卷 964-975页

作者：武海丽段冰杜锦娥马佳晶李卓玉山西大学生命科学学院生物工程系太原030006 山西大学生物技术研究所生物工程系化学生物学与分子工程教育部重点实验室生物工程系太原030006

近年来,关于长非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)在疾病中的应用研究被广泛关注。LncRNAs被证实在肿瘤治疗中发挥至关重要的作用,通常作为肿瘤因子或抑癌基因参与调控肿瘤的发生发展。课题组前期通过转录组学发现了在结直肠癌中... 详细信息

近年来,关于长非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)在疾病中的应用研究被广泛关注。LncRNAs被证实在肿瘤治疗中发挥至关重要的作用,通常作为肿瘤因子或抑癌基因参与调控肿瘤的发生发展。课题组前期通过转录组学发现了在结直肠癌中可以作为靶点的新lncRNA 606938,然而关于其在结直肠癌中的功能及作用机制尚不清楚。本研究通过反转录-实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验发现,相比正常结肠上皮细胞,lncRNA 606938在结直肠癌细胞株中低表达。过表达DLD-1与SW620细胞株中lncRNA 606938的表达,结直肠癌细胞的克隆形成能力显著下降(分别下降了97%和54.5%)。流式细胞术的结果显示,lncRNA 606938过表达使细胞周期阻滞在G_(1)期(分别延长了50.5%和63.9%),且促进结直肠癌细胞的凋亡(分别增加了1.9%和3.3%)。Western印迹结果显示,lncRNA 606938过表达之后,结直肠癌细胞中相关癌基因(β-联蛋白、c-Myc、cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3、CDK 4、CDK 6)的表达下调,抑癌基因(TRIM33、caspase 2、actived caspase 3)的表达上调。而在沉默lncRNA 606938之后得到相反的结果。在机制方面,通过核糖核酸交互沉降实验(RNA pulldown)、RNA免疫共沉淀(RIP)和功能挽救实验(Rescue)证实,lncRNA 606938可以靶向结合并促进TRIM33的表达,进而促进β-联蛋白的降解,并抑制β-联蛋白及下游的原癌基因c-Myc、cycline D1等的表达,最终抑制结直肠癌的进程。本研究阐明了lncRNA 606938通过靶向TRIM33/β-catenin信号途径抑制结直肠癌细胞增殖与凋亡的分子机制,揭示了lncRNA 606938作为抑癌基因的潜力,为结直肠癌的临床治疗提供了新靶点和新策略。

关键词：长非编码RNA 606938 TRIM33/β-catenin信号结直肠癌细胞增殖细胞凋亡