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大叶蛇葡萄类纤维素合成酶基因的克隆及其序列分析

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中国实验方剂学杂志 2019年第20期25卷 147-152页

作者：蒲天珍张秀桥周佩娜熊晓妹龚玲湖北中医药大学药学院武汉430065

目的:从药用植物大叶蛇葡萄Ampelopsis megalophylla中克隆得到类纤维素合酶(Cellulose synthase-like,Csl)基因(Am Csl)全长,并对序列进行生物信息学分析。方法:根据大叶蛇葡萄A. megalophylla转录组测序数据得到的Am Csl基因序列设计... 详细信息

目的:从药用植物大叶蛇葡萄Ampelopsis megalophylla中克隆得到类纤维素合酶(Cellulose synthase-like,Csl)基因(Am Csl)全长,并对序列进行生物信息学分析。方法:根据大叶蛇葡萄A. megalophylla转录组测序数据得到的Am Csl基因序列设计特异引物,以嫩叶总RNA逆转录的c DNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增Am Csl基因全长,并进行TA克隆测序,利用多种软件对该序列进行生物信息学分析。结果:Am Csl全长c DNA为1 438 bp,包含1个561 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码186个氨基酸,蛋白质分子式为C1011H1547N233O257S10,理论相对分子质量为22. 40 k Da,理论等电点(PI)为7. 59,脂肪族指数(AI)为116. 88,存在跨膜区,无信号肽,可能定位于内质网膜,平均疏水系数为0. 670,不稳定指数为42. 56,属于疏水性不稳定蛋白,保守结构域包含了1个纤维素合成酶超家族结构域,二级结构以α-螺旋为主。氨基酸多序列比对和系统进化树分析发现,Am Csl与同科植物葡萄有较高的同源性。结论:获得了大叶蛇葡萄Am Csl基因的全长,对其进行了初步的生物信息学分析,为进一步研究大叶蛇葡萄多糖的积累和生物合成的调控奠定了必要基础。

关键词：大叶蛇葡萄类纤维素合成酶基因克隆生物信息学分析

基于代谢组学和肠道菌群探讨栀子改善类风湿关节炎的作用机制

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中国中药杂志 2023年第13期48卷 3602-3611页

作者：童颖许杨鼎何江龚普阳洪怡郭瑜婕湖北中医药大学药学院药物制剂研究中心湖北武汉430065 西南民族大学药学院四川成都610041

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以持续性关节炎症为特征的自身免疫性疾病,RA的发生与内源性代谢产物及肠道菌群的紊乱密切相关。栀子是我国最常用的药食同源资源之一,常用于防治黄疸、炎症、疼痛、发热等,但栀子改善RA的... 详细信息

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以持续性关节炎症为特征的自身免疫性疾病,RA的发生与内源性代谢产物及肠道菌群的紊乱密切相关。栀子是我国最常用的药食同源资源之一,常用于防治黄疸、炎症、疼痛、发热等,但栀子改善RA的作用机制尚不明确。该研究采用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)血清非靶向代谢组学和16S rDNA高通量基因测序法关联分析,以阐释栀子改善弗氏完全佐剂诱导的RA的作用机制。药效学结果表明,栀子能显著改善佐剂关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠症状,且栀子低、高剂量能显著降低大鼠血清中炎症因子白细胞介素(interleukin,IL)-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α和IL-1β水平以及前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)水平(P<0.05,P<0.01)。代谢组学涉及的通路主要为α-亚麻酸代谢和甘油磷脂代谢。16S rDNA测序结果显示,链球菌属、费克蓝姆菌属、克雷伯菌属、肠球菌属和科萨克菌属可能是栀子改善AA大鼠的关键肠道微生物。Spearman相关性分析显示,PE-NMe[18:1(9Z)/20:0]、PC[20:1(11Z)/18:3(6Z,9Z,12Z)]和PC[20:0/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)]等差异代谢物与差异代谢菌具有显著相关性。综上,栀子可能通过调控肠道微生物组成和α-亚麻酸代谢、甘油磷脂代谢等相关代谢通路,从而间接发挥改善RA的作用,研究结果为从多组学角度阐释栀子改善RA的作用机制提供了新的思路与依据。

关键词：栀子类风湿关节炎代谢组学肠道菌群

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冬凌草IrCYP71基因的克隆和功能

中国实验方剂学杂志 2018年第14期24卷 29-35页

作者：陈延清胡志刚黄必胜刘迪湖北中医药大学药学院

目的：克隆冬凌草二萜类化合物生物合成途径下游关键酶基因Ir CYP71,进行序列特征分析,对此基因编码的蛋白进行原核表达分析以及亚细胞定位,并对蛋白在宿主细胞表达的条件进行了优化。方法：根据转录组测序所得的Ir CYP71基因片段,克隆... 详细信息

目的：克隆冬凌草二萜类化合物生物合成途径下游关键酶基因Ir CYP71,进行序列特征分析,对此基因编码的蛋白进行原核表达分析以及亚细胞定位,并对蛋白在宿主细胞表达的条件进行了优化。方法：根据转录组测序所得的Ir CYP71基因片段,克隆出全长c DNA序列;构建p ET28a（＋）-Ir CYP71重组质粒,转化到Rosetta感受态细胞,小量表达和大量表达蛋白并鉴定,进行包涵体蛋白的纯化与复性,再对复性蛋白纯化鉴定分析。基于gateway克隆技术构建出PCR8/GW/TOPO-Ir CYP71载体之后与改造Pearleygate104载体重组,之后与农杆菌GV3101重组,转入烟草中瞬时表达,从而进行蛋白亚细胞定位。结果：克隆得到的Ir CYP71基因全长c DNA为1 593 bp,编码530个氨基酸,并在Gen Bank注册（登录号MG800628）。经大肠埃希菌表达系统表达的重组蛋白相对分子质量正确,在62 k Da左右,纯化后的重组蛋白总量有1 mg,蛋白纯度为85%。此蛋白亚细胞定位在细胞核。结论：对冬凌草Ir CYP71基因进行了初步验证,并对基因表达的蛋白进行原核表达和亚细胞定位,使该基因在冬凌草二萜成分的生物合成过程中的作用得到了进一步的阐述。

关键词：冬凌草叶生物合成途径亚细胞定位原核表达功能基因研究

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纳米雄黄酸水飞品X射线衍射及拉曼光谱分析

中国实验方剂学杂志 2018年第20期24卷 89-94页

作者：明小芳尚祥伟张超梅衡黄齐万倩芸张秀桥湖北中医药大学药学院

目的：分析纳米雄黄酸水飞品（Realgar nanoparticles processed,NRPP）X射线衍射（XRD）图谱和拉曼光谱的图谱特征,并比较雄黄炮制前后晶形结构的异同。方法：采用X射线衍射法和拉曼光谱法对6批雄黄生品,6批雄黄水飞品,6批纳米雄黄酸... 详细信息

目的：分析纳米雄黄酸水飞品（Realgar nanoparticles processed,NRPP）X射线衍射（XRD）图谱和拉曼光谱的图谱特征,并比较雄黄炮制前后晶形结构的异同。方法：采用X射线衍射法和拉曼光谱法对6批雄黄生品,6批雄黄水飞品,6批纳米雄黄酸水飞品进行测定,确定各样品的物相组成及晶形结构成键情况。结果：XRD分析表明雄黄生品和雄黄水飞品均为β-As_4S_4,纳米雄黄酸水飞品中NRPP1,NRPP5及NRPP6批次为β-As_4S_4,NRPP2,NRPP3及NRPP4批次为β-As_4S_4和α-As S的混合体。拉曼光谱分析表明雄黄生品、雄黄水飞品和纳米雄黄酸水飞品均在360~362,342~344,185~187,164~166 cm^（-1）等波数位置出现了特征性较强的拉曼振动峰。结论：X射线衍射技术与拉曼光谱法相结合,能较好地反映出纳米雄黄酸水飞品的特征吸收峰,可用于纳米雄黄酸水飞品的鉴定与分析。雄黄经常规的水飞法炮制未造成晶型结构的变化,而经纳米化并酸水飞后晶形结构则发生改变。

关键词：雄黄炮制纳米雄黄酸水飞品 X射线衍射拉曼光谱

金银花提取物超分子水凝胶的制备和释放行为研究

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中草药 2020年第7期51卷 1862-1867页

作者：李菀湖北中医药大学药学院湖北武汉430065

目的制备局部给药的金银花提取物超分子水凝胶,并对其进行表征和体外释放行为研究。方法采用40%乙醇提取金银花,以酚酸类成分的含量为定量指标,选取N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸为凝胶因子,制备金银花提取物超分子水凝胶,采用体外释放实验... 详细信息

目的制备局部给药的金银花提取物超分子水凝胶,并对其进行表征和体外释放行为研究。方法采用40%乙醇提取金银花,以酚酸类成分的含量为定量指标,选取N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸为凝胶因子,制备金银花提取物超分子水凝胶,采用体外释放实验研究其释放行为。结果加入金银花提取物,不影响超分子水凝胶的形成及其抗菌性能,还有利于提高超分子水凝胶的稳定性。金银花提取物的释放行为与其负载量和释放介质pH值有关,金银花提取物的负载量为0.5 mg/mL时,其累积释放率最大;提取液的累积释放率随释放介质的pH值升高而增大,表现出明显的缓控释特征。结论超分子水凝胶作为金银花提取物的释放载体,具有明显的缓控释作用,为金银花在医药方面的开发和应用提供了新思路。

关键词：金银花提取物超分子水凝胶缓控释局部给药体外释放酚酸 N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸凝胶因子抗菌性能缓控释特征

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茅苍术药材不同年限部位品质差异研究

基因组学与应用生物学 2018年第10期37卷 4486-4492页

作者：邓娟蔡杰陈雷耿赛龙余坤刘合刚湖北中医药大学药学院

茅苍术药材不同部位的物质积累特征及品质差异尚不清楚,本研究针对这一问题研究该药材不同部位的性状、含水量、可溶性糖、淀粉、挥发油含量及成分差异,为阐明该药材不同部位的品质差异及有效成分在药材中的分布和积累规律提供帮助。本... 详细信息

茅苍术药材不同部位的物质积累特征及品质差异尚不清楚,本研究针对这一问题研究该药材不同部位的性状、含水量、可溶性糖、淀粉、挥发油含量及成分差异,为阐明该药材不同部位的品质差异及有效成分在药材中的分布和积累规律提供帮助。本研究以2年生茅苍术药材为研究材料,根据其生长部位分离出一年生和二年生药材,利用扫描电子显微镜和常规形态鉴定方法研究药材性状差异,并利用水蒸气蒸馏法测定挥发油含量、蒽酮比色法测定可溶性糖和淀粉含量、GC-MS法分析挥发油成分。结果显示,在性状上,一年生药材断面颜色偏白,二年生药材稍偏黄,且一年生药材较二年生药材松软。与二年生药材相比,一年生药材可溶性糖含量低30.26%,含水量、淀粉、挥发油含量则无显著差异,但二者挥发油成分有所不同。GC-MS共检测出22个成分,15个为二者共有成分。一年生药材中β-桉叶醇和香附烯含量较二年生药材高,而莪术烯、石竹烯等8个成分含量较二年生药材低。茅苍术药材不同部位的性状、初生和次生代谢产物积累均有所差异。

关键词：茅苍术根茎挥发油不同部位品质

鞘蕊苏贝壳杉烯酸氧化酶基因的克隆及表达载体的构建

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基因组学与应用生物学 2018年第9期37卷 3919-3925页

作者：马朝芝黄晓余坤尤朋涛刘焱文但汉雄湖北中医药大学药学院

为提高鞘蕊苏有效成分的含量,开展Coleus Ent-kaurenoic acid oxidase（KAO）基因的克隆以及表达载体构建方面的研究。提取鞘蕊苏叶片的总RNA,利用套式PCR技术克隆获得KAO基因全长,将该基因连接到克隆载体p MD-18T,经测序鉴定正确后,再... 详细信息

为提高鞘蕊苏有效成分的含量,开展Coleus Ent-kaurenoic acid oxidase（KAO）基因的克隆以及表达载体构建方面的研究。提取鞘蕊苏叶片的总RNA,利用套式PCR技术克隆获得KAO基因全长,将该基因连接到克隆载体p MD-18T,经测序鉴定正确后,再将该基因连接到p ET-28a表达载体中。结果显示,成功克隆出的鞘蕊苏KAO基因大小为1 500 bp,对克隆基因进行测序及酶切鉴定,均得到正确大小的DNA片段,说明表达载体构建成功。本研究成功克隆得到鞘蕊苏贝壳杉烯酸氧化酶基因并构建其表达载体,为提高鞘蕊苏有效成分含量提供了基础。

关键词：鞘蕊苏贝壳杉烯酸氧化酶 PCR 表达载体

DSAZn与槲皮素的配位结合及对槲皮素的高灵敏度检测

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光谱学与光谱分析 2023年第1期43卷 122-128页

作者：翟艳珂潘宜杏向浩徐黎朱泽策雷咪湖北中医药大学药学院湖北武汉430072 武汉纺织大学化学与化工学院湖北武汉430200

槲皮素为天然黄酮类化合物,可用于高血压、高血脂、心血管疾病、癌症等的预防和治疗;槲皮素的定量检测在生物化学、临床医学等领域尤为重要。利用分子荧光物质(DSAZn)的聚集诱导发光现象(AIE),通过配位作用识别靶标分子槲皮素,结合激发... 详细信息

槲皮素为天然黄酮类化合物,可用于高血压、高血脂、心血管疾病、癌症等的预防和治疗;槲皮素的定量检测在生物化学、临床医学等领域尤为重要。利用分子荧光物质(DSAZn)的聚集诱导发光现象(AIE),通过配位作用识别靶标分子槲皮素,结合激发态电子转移原理,提出了一种AIE型荧光分子对槲皮素的高灵敏度、高选择性检测方法。实验研究了pH 7.0的PBS缓冲液中DSAZn的荧光随着五种药物分子(槲皮素、淫羊藿素、异鼠李素、芦丁、多巴胺)加入后的变化情况。采用荧光分光光度计,以415 nm为激发波长,扫描435~680 nm的荧光发射光谱。采用紫外分光光度计,扫描DSAZn 250~750 nm的紫外吸收光谱。紫外检测表明中药分子槲皮素可以与AIE荧光探针形成复合物,因此加入槲皮素后AIE探针的荧光被静态猝灭。荧光检测表明五种药物分子对荧光探针的猝灭强弱有明显差异,槲皮素与DSAZn结合常数为1.34×10^(7) L·mol^(-1),比其他四种药物分子和DSAZn的结合常数高出一个数量级,显示出DSAZn对槲皮素具有较好的选择性。槲皮素的检测限为3.07 nmol·L^(-1),低于诸多文献已报道的参考值,表明DSAZn对槲皮素的识别具有较高的灵敏度。由荧光滴定光谱和荧光滴定曲线得到槲皮素对DSAZn的滴定方程为:y=0.0134x-0.29482,槲皮素浓度在0~5μmol·L^(-1)范围内线性关系良好,线性相关系数r=0.9943。由此构建出一种AIE型荧光分子对槲皮素的高选择性、高灵敏度检测方法,该方法操作简便、重复性好,为具有相似结构药物的检测提供了新的研究思路。

关键词：荧光探针荧光分析聚集诱导发光电子转移配位作用

胆汁酸检测技术研究进展与生物传感器开发现状

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生物工程学报 2020年第12期36卷 2779-2790页

作者：董恩鹏郑军平刘洪涛湖北中医药大学基础医学院湖北武汉430065 湖北中医药大学药学院湖北武汉430065

胆汁酸不仅促进脂质吸收,还可调节肠道菌群结构,影响多种疾病的发生。胆汁酸代谢过程涉及肝脏、肠道、血液等重要组织。胆汁酸组成复杂、同分异构体多、生物活性相差巨大,这给胆汁酸检测分析技术带来较大挑战,同时也限制了胆汁酸与多种... 详细信息

胆汁酸不仅促进脂质吸收,还可调节肠道菌群结构,影响多种疾病的发生。胆汁酸代谢过程涉及肝脏、肠道、血液等重要组织。胆汁酸组成复杂、同分异构体多、生物活性相差巨大,这给胆汁酸检测分析技术带来较大挑战,同时也限制了胆汁酸与多种疾病的关系研究,因此,对多种不同胆汁酸进行特异性检测可为生物研究、临床诊断、疾病预防提供有利条件。基于不同检测方法分析多种来源胆汁酸样品已获得较大进展,现有技术包括分光光度法、薄层色谱、色谱法、色谱质谱联用分析,但均存在较大限制。文中介绍了胆汁酸传统检测技术的研究情况,突出生物传感器的研究进展,并对其在胆汁酸检测方面的发展进行了展望。

关键词：胆汁酸特异性检测生物传感器疾病诊断