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S1P/S1PR1信号通路通过调控ROS/NLRP3对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞上皮间充质转化的影响

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中国药理学通报 2023年第6期39卷 1143-1148页

作者：黄太平王菁徐焕雨杨佳薛媛张婷婷田继华山西医科大学微生物学与免疫学教研室山西太原030001

目的探究S1P/S1PR1信号通路对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响及其可能的作用机制。方法采用不同浓度葡萄糖处理细胞,ELISA法检测细胞内S1P表达,Western blot检测S1PR1蛋白表... 详细信息

目的探究S1P/S1PR1信号通路对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响及其可能的作用机制。方法采用不同浓度葡萄糖处理细胞,ELISA法检测细胞内S1P表达,Western blot检测S1PR1蛋白表达;将细胞分为正常对照组、HG组及HG+siS1PR1组,RT-PCR检测细胞E-cadherin、Vimentin、Fibronectin及Twist mRNA的表达,Western blot检测E-cadherin、α-SMA、Vimentin、NLRP3、ASC及NF-κB蛋白表达,流式细胞术检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;将细胞分为正常对照组、S1P组及S1P+siS1PR1组,Western blot检测Vimentin、Snail、α-SMA、NLRP3、ASC及NF-κB蛋白表达,荧光显微镜测定ROS水平。结果ELISA结果显示,高糖刺激下细胞内S1P含量明显升高。Western blot结果显示,30 mmol·L^(-1)浓度时S1PR1蛋白表达量与对照组相比明显升高;阻断S1PR1后可以抑制高糖诱导的Fibronectin、Vimentin及Twist mRNA表达,上调E-cadherin mRNA的表达,Western blot结果显示,E-cadherin蛋白表达升高,Vimentin,α-SMA蛋白表达下降,同时可抑制细胞内ROS的产生和NLRP3,ASC,NF-κB蛋白水平;加入S1P激活剂后细胞内ROS水平,Vimentin、α-SMA、Snail、NLRP3、ASC及NF-κB蛋白水平表达均升高,阻断S1PR1后表达均降低。结论高糖能诱导肾小管上皮细胞EMT,其机制可能与S1P/S1PR1信号通路作用于ROS/NLRP3轴有关。

关键词： S1P/S1PR1信号通路 ROS NF-κB NLRP3 上皮间充质转化肾小管上皮细胞

HPV16 E5蛋白免疫优势肽段分析及其多克隆抗体的制备

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中国生物制品学杂志 2021年第6期34卷 725-729,739页

作者：唐婉林王路得顾美萍 Kamara SAIDU 汪琪李明洋陈韶张丽芳温州医科大学微生物学与免疫学教研室浙江温州325035

目的预测人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus 16,HPV16)E5蛋白的免疫优势肽段,并制备其多克隆抗体。方法以人HPV16 E5蛋白全长氨基酸序列为基础,采用Hopp&Woods的亲水性方案、Zimmerman极性参数、Jameson-Wolf抗原指数方案和Emini... 详细信息

目的预测人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus 16,HPV16)E5蛋白的免疫优势肽段,并制备其多克隆抗体。方法以人HPV16 E5蛋白全长氨基酸序列为基础,采用Hopp&Woods的亲水性方案、Zimmerman极性参数、Jameson-Wolf抗原指数方案和Emini表面可及性方案及抗原性指数(antigenic index,AI)等生物信息学方法,综合分析E5蛋白免疫优势肽段。通过免疫日本大耳白兔进行E5蛋白免疫优势肽段的免疫原性验证并制备多克隆抗体;进一步采用ELISA法和间接免疫荧光试验分别检测多克隆抗体的效价及特异性。结果HPV16 E5蛋白N-端1~17氨基酸序列(MTNLDTASTTLLACFLL)为免疫优势肽段,可诱导兔产生高水平的E5蛋白特异性IgG抗体,抗体滴度随免疫次数增加而升高;间接细胞免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体可特异性识别TC-1-E5细胞胞浆内表达的E5蛋白。结论HPV16 E5蛋白氨基酸肽段(MTNLDTASTTLLACFLL)具有良好的免疫原性;成功制备了HPV16 E5蛋白多克隆抗体,为进一步研究HPV16 E5蛋白的生物学特性奠定了基础。

关键词：人乳头瘤病毒 E5蛋白免疫优势肽段多克隆抗体

遗传密码扩充技术及其在蛋白质功能研究及标记成像中的应用

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生物工程学报 2022年第2期38卷 620-631页

作者：李哲凌虹哈尔滨医科大学微生物学教研室黑龙江哈尔滨150081 哈尔滨医科大学免疫学教研室黑龙江哈尔滨150081

遗传密码扩充(genetic code expansion,GCE)技术利用终止密码子将非天然氨基酸掺入到蛋白质中,再结合点击反应对蛋白质实现定点标记。相较于荧光蛋白、标签抗体等其他标记工具,该技术在蛋白标记中使用的化合物分子较小、对蛋白空间结构... 详细信息

遗传密码扩充(genetic code expansion,GCE)技术利用终止密码子将非天然氨基酸掺入到蛋白质中,再结合点击反应对蛋白质实现定点标记。相较于荧光蛋白、标签抗体等其他标记工具,该技术在蛋白标记中使用的化合物分子较小、对蛋白空间结构影响较小,且能通过点击反应实现蛋白分子与染料分子1︰1的化学计量比,从而能够依据荧光强度对蛋白质定量。因此,在活细胞单分子追踪和超分辨率显微成像等需要细胞长时间暴露在高激光功率下的研究中,GCE技术具有极大的优势。同时,该技术也为提高活细胞成像过程中的定位精度和分子计数准确度奠定了基础。文中旨在总结近年来GCE技术在蛋白质研究中的应用进展,特别是在蛋白质标记成像方面的应用进展。

关键词：遗传密码扩充非天然氨基酸活细胞成像蛋白质

ERK抑制剂U0126通过下调cyclin D1与survivin蛋白表达抑制乳腺癌细胞增殖

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中国药理学通报 2019年第8期35卷 1061-1066页

作者：田继华常思佳郭海秀冀贺王艳红山西医科大学微生物学与免疫学教研室

目的研究ERK通路抑制剂U0126对乳腺癌细胞增殖的抑制作用,并探讨其调控机制。方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB231,将细胞分组干预,MTT法检测各组细胞增殖情况;流式细胞仪检测各组细胞周期及细胞凋亡;Western blot检测细胞中p-ERK/... 详细信息

目的研究ERK通路抑制剂U0126对乳腺癌细胞增殖的抑制作用,并探讨其调控机制。方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB231,将细胞分组干预,MTT法检测各组细胞增殖情况;流式细胞仪检测各组细胞周期及细胞凋亡;Western blot检测细胞中p-ERK/ERK、cyclin D1、survivin及cleaved caspase-3蛋白表达。结果 MTT结果显示,U0126干预24、48 h后,MCF-7、MDA-MB231细胞抑制率明显增加(P<0.01);MCF-7、MDA-MB231细胞经U0126干预24 h后,检测细胞周期及细胞凋亡,G 0/G 1期细胞比例较对照组明显增加,S及G 2期细胞比例下降(P<0.05);而干预组细胞凋亡率较未干预组明显增多(P<0.01);U0126处理人乳腺癌细胞2 h后,可阻断ERK的磷酸化,减少cyclin D1的蛋白表达,抑制survivin而上调cleaved caspase-3的表达,与对照组相比差异有显著性(P<0.01)。结论 U0126通过阻断MCF-7、MDA-MB231细胞中ERK信号通路,调控cyclin D1,将细胞周期阻断在G 0/G 1期,抑制survivin而增加cleaved caspase-3表达,增加细胞凋亡,继而使乳腺癌细胞MDA-MB231、MCF-7的增殖受到抑制。

关键词： ERK U0126 MCF-7 MDA-MB231 cyclin D1 survivin

C57BL/6小鼠外周淋巴组织和肝脏中CD11c^(+)B220^(+)NK细胞分析

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细胞与分子免疫学杂志 2022年第2期38卷 116-121页

作者：王玉袁欣秦欢徐运娥孙欣遵义医科大学微生物学教研室贵州遵义563000

目的研究CD11c^(+)B220^(+)自然杀伤(NK)细胞在外周淋巴组织和肝脏中的分布及其表面浆细胞样树突状细胞抗原1(PDCA-1)分子的表达情况。方法采集C57BL/6小鼠脾脏、淋巴结和肝脏组织,制备单个核细胞悬液,通过多色流式细胞术检测3个组织器... 详细信息

目的研究CD11c^(+)B220^(+)自然杀伤(NK)细胞在外周淋巴组织和肝脏中的分布及其表面浆细胞样树突状细胞抗原1(PDCA-1)分子的表达情况。方法采集C57BL/6小鼠脾脏、淋巴结和肝脏组织,制备单个核细胞悬液,通过多色流式细胞术检测3个组织器官中CD11c^(+)B220^(+)NK细胞的比例及其表面PDCA-1分子的表达情况。结果脾脏、淋巴结和肝脏均存在CD11c^(+)B220^(+)NK细胞,在脾脏中比例最高,达到(2.82±0.45)%。3个组织中均有部分CD11c^(+)B220^(+)NK细胞表达PDCA-1,脾脏最明显。结论CD11c^(+)B220^(+)NK细胞是小鼠外周淋巴组织和肝脏中NK细胞的重要亚群,因组织不同其表面PDCA-1表达存在差异。

关键词：脾脏淋巴结肝脏 CD11c^(+)B220^(+)NK细胞浆细胞样树突状细胞抗原1(PDCA-1)

氢气抑制白细胞介素22(IL-22)反应缓解胶原蛋白诱导关节炎(CIA)小鼠症状

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细胞与分子免疫学杂志 2022年第5期38卷 400-405页

作者：田艳康行杨昊张淑婷王雨樊卫平山西医科大学基础医学院微生物学与免疫学教研室山西太原030001

目的探讨氢气(H2)对胶原诱导关节炎(CIA)小鼠的治疗作用及相关机制。方法18只DBA/1小鼠随机分为正常对照组、CIA组和H2治疗组,每组6只。CIA组和H_(2)治疗组小鼠采用牛Ⅱ型胶原蛋白诱导CIA模型,H2治疗组小鼠在第15~60天进行H_(2)吸入治疗... 详细信息

目的探讨氢气(H2)对胶原诱导关节炎(CIA)小鼠的治疗作用及相关机制。方法18只DBA/1小鼠随机分为正常对照组、CIA组和H2治疗组,每组6只。CIA组和H_(2)治疗组小鼠采用牛Ⅱ型胶原蛋白诱导CIA模型,H2治疗组小鼠在第15~60天进行H_(2)吸入治疗(300 mL/L,3 h/d)。比较各组小鼠关节炎症状评分;HE染色进行关节病理评分;流式细胞术、免疫组织化学染色检测脾和关节中白细胞介素22(IL-22)阳性细胞变化;ELISA检测血清及关节软骨中IL-22水平;Western blot法检测关节软骨中磷酸化的信号转导子和转录激活子3(p-STAT3)和磷酸化的核因子κB(p-NF-κB)蛋白表达。结果与正常对照组相比,CIA组关节炎症状评分和病理评分显著升高、脾细胞和关节软骨中IL-22+细胞比例升高、血清和关节软骨中IL-22含量增加,关节软骨中p-STAT3和p-NF-κB蛋白表达增高,H_(2)治疗后均显著降低。结论H2可能通过抑制STAT3/NF-κB通路抑制IL-22炎症反应,缓解CIA小鼠症状。

关键词：氢气(H2) 胶原蛋白诱导关节炎(CIA) 白细胞介素22(IL-22) 信号转导子与转录激活子3(STAT3) 核因子kB(NF-kB)

中介素通过抑制内质网应激保护缺氧复氧损伤的大鼠肾小管上皮细胞

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中国药学杂志 2020年第2期55卷 105-110页

作者：亢晶王娟娟田继华王桂琴王艳红山西医科大学微生物学与免疫学教研室太原030001

目的探讨中介素(intermedin,IMD)通过抑制内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)途径的细胞凋亡,发挥对大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤的保护机制。方法 NRK-52E细胞随机分为对照组;H/R组;空质粒(H/R+p IRES2)组;IMD(H/R+IMD)组。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力;Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡;Realtime PCR法和Western-blot法分别检测ERS相关经典分子GRP78、CHOP、Caspase 12在mRNA及蛋白水平的表达;ER特异性荧光染料Dapoxyl用于观察ER形态变化。结果 MTT结果显示,H/R组NRK-52E细胞存活率较对照组明显下降,而IMD转染后细胞存活率提高;肾小管上皮细胞NRK-52E经H/R处理后出现凋亡,细胞凋亡率显著增加,同时H/R可导致ERS途径经典分子GRP78、CHOP、Caspase 12的mRNA和蛋白表达均显著上调;IMD转染后可显著降低NRK-52E细胞凋亡,细胞凋亡率降低,ERS途径经典分子GRP78、CHOP、Caspase 12的mRNA和蛋白表达均明显下降。内质网染色结果显示,H/R可以导致内质网结构受损,Dapoxyl染料聚集,荧光强度加强,内质网颗粒感增强,荧光颗粒分布不均、浓集,并有空泡;IMD转染后内质网结构受损减轻。结论大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E H/R损伤过程中可能存在ERS凋亡途径的活化,IMD可以通过抑制ERS相关的凋亡信号通路,从而减少肾小管上皮细胞凋亡,减轻肾脏IRI。

关键词：中介素缺氧复氧损伤内质网应激凋亡

人乳头瘤病毒58型L1蛋白B细胞表位预测和分析

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中国病原生物学杂志 2017年第5期12卷 407-411,415页

作者：宋易玲叶晓鲜毛珊珊岑丹维张婵琼蒋朋飞张丽芳温州医科大学微生物学与免疫学教研室浙江温州325035

目的对人乳头瘤病毒58型(HPV58)主要结构蛋白(L1)的B细胞表位进行预测和分析。方法利用生物信息学软件EXPASY在线分析HPV58型L1蛋白的二级结构及生物学特性,包括跨膜趋势、表面可及性、抗原性、亲水性,溶性等,从而对其B细胞表位进行综... 详细信息

目的对人乳头瘤病毒58型(HPV58)主要结构蛋白(L1)的B细胞表位进行预测和分析。方法利用生物信息学软件EXPASY在线分析HPV58型L1蛋白的二级结构及生物学特性,包括跨膜趋势、表面可及性、抗原性、亲水性,溶性等,从而对其B细胞表位进行综合分析和预测。结果通过亲水性参数,Zimmcrman极性,柔韧性参数,表面可及性及抗原性进行综合分析,预测人乳头瘤病毒58型L1蛋白的B细胞表位可能位于其N端的29-37,43,46-58,64-67,74,79-88,93,100-101,103-125,133-139,149,151-180,187-213,220-213,235,238-247,252-271,277-282,286-309,320-323,327-338,341-348,351,353-368,373-396,408,427,419-425,433-444,453-468,470,475-486,488-490,493-494,497-524肽段区域;进一步用Protien Plast在线同源匹配分析,79-88、190-216、373-396、453-468、497-524肽段区段为可能的B细胞表位。结论用多参数预测分析HPV58型L1蛋白可能的B细胞表位,为进一步研究高危型58型L1蛋白的生物学特性提供了理论基础。

关键词：人乳头瘤病毒58型(HPV58) B细胞表位 L1蛋白同源性匹配分析

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1复合抗原优势表位免疫原性研究

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中华传染病杂志 2016年第1期34卷 32-38页

作者：吕金辉汪文寰熊一融杜王琪叶璐璐张丽芳李文姝温州医科大学微生物学与免疫学教研室 325032

目的分析弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）和膜表面蛋白1（SAGl）复合抗原免疫优势表位的免疫原性。方法利用生物信息学技术预测和筛选出弓形虫复合抗原ROP2-SAG1免疫优势T、B淋巴细胞表位组合，将优势表位相应基因片段克隆至pET32a（＋）载... 详细信息

目的分析弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）和膜表面蛋白1（SAGl）复合抗原免疫优势表位的免疫原性。方法利用生物信息学技术预测和筛选出弓形虫复合抗原ROP2-SAG1免疫优势T、B淋巴细胞表位组合，将优势表位相应基因片段克隆至pET32a（＋）载体并转化至表达感受态（大肠埃希菌Rosetta菌株）中诱导表达，通过离子螯合亲和层析柱（Ni—NTA）纯化表达产物，经SDS—PAGE鉴定表达产物纯化效果。以纯化的优势表位蛋白作为免疫原，皮下多点注射日本大耳兔，设pET32a（＋）载体蛋白和PBS为对照，以纯化的优势表位蛋白作包被抗原，ELISA法检测第0、2和4周免疫兔血清中表位特异性抗体IgG的产生时间及效价，免疫斑点实验验证免疫兔血清多克隆抗体的特异性。以纯化的优势表位免疫BALB／c小鼠，酶联免疫斑点分析技术检测免疫鼠脾细胞7干扰素产生能力。结果在原核表达体系中获得了相对分子质量为30000的优势表位融合表达产物。纯化的表位蛋白免疫大耳白兔血清中可检测到相应的表位特异性抗体IgG，其抗体水平随着免疫次数的增加而呈现逐渐升高的趋势，优势表位免疫组第2、4周兔血清抗体显著高于载体pET32a（＋）蛋白对照组（1．454±0．098比0．616±0．084，F=0．000，P〈0．05；2．299±0．224比1．580±0．192，F=0．112，P〈O．05），第4周的免疫血清多克隆抗体效价可达1：40960。免疫斑点实验证实多克隆抗体针对优势表位具有良好的特异性。原核体系制备的优势表位蛋白免疫鼠脾细胞受3种不同的CTL表位肽刺激产生的7干扰素水平，分别为表位肽1[（19．333±1．528）／10万细胞]、表位肽2[（40．333±1．528）／10万细胞]、表位肽3E（70．667±1．890）／10万细胞]，与PBS免疫对照组[表位肽1（1．033±0．150）／10万细胞、表位肽2（1．045±0．110）／10万细胞、表位肽3（1．041±0．120）／10万细胞]比较差异均有统计学意义（F值分别为0．284、0．000、0．284，均P〈0．05）。免疫鼠脾细胞受到优势表位中特异性CTL表位肽刺激后，γ干扰素产生水平显著升高，而且CTL表位联合Th表位的组合肽刺激（表位肽3），7干扰素产生水平分别显著高于单独的CTL表位肽刺激组（表位肽1和2，F值分别为5．796、0．000，均P〈0．05）。结论筛选的弓形虫复合抗原ROP2一SAGl免疫优势表位通过原核表达体系制备的重组表位蛋白，具有显著的免疫原性。

关键词：弓形虫 ROP2-SAG1 表位免疫原性