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一株致普通棉耳狨猴严重下呼吸道感染的副粘病毒种系进化分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2007年第7期27卷 603-606页

作者：李梅石建党石立莹李晓眠张国际秦宇袁立军天津医科大学医学微生物教研室 300070 天津南开大学分子生物学研究所

目的探讨副粘病毒Tianjin株的种系进化地位。方法将副粘病毒Tianjin株HN核苷酸、氨基酸序列与GenBank发布的副粘病毒相应序列进行比较,构建种系进化树,阐明副粘病毒Tianjin株在副粘病毒科中的分类地位。结果基于HN核苷酸序列的种系进化... 详细信息

目的探讨副粘病毒Tianjin株的种系进化地位。方法将副粘病毒Tianjin株HN核苷酸、氨基酸序列与GenBank发布的副粘病毒相应序列进行比较,构建种系进化树,阐明副粘病毒Tianjin株在副粘病毒科中的分类地位。结果基于HN核苷酸序列的种系进化分析表明,副粘病毒Tianjin株属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、呼吸道病毒属,与仙台病毒亲缘关系最近。Tianjin株与仙台病毒BB1株HN核苷酸、氨基酸序列同源性分别为94.8%、95.1%,与其他仙台病毒,在84.8%～88.7%和89.6%～91.7%之间。Tianjin株与BB1株HN核苷酸序列的差异明显大于同一进化分支内的仙台病毒之间的差异。Tianjin株HN蛋白存在18个独特的氨基酸残基变异。结论结合种系进化分析结果、病毒的宿主来源和致病特点,提示副粘病毒Tianjin株不属于仙台病毒现有的3个进化分支而自成独立的一支。

关键词：副粘病毒仙台病毒 HN序列种系进化分析

树突状细胞疫苗的制备及其体外诱导细胞毒性T淋巴细胞对宫颈癌CaSki细胞的杀伤作用

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肿瘤 2011年第2期31卷 106-110页

作者：焦庆昉易发平陈全兰欢艾青符少月俞垚宋方洲重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学免疫学教研室重庆400016 重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室重庆400016

目的:制备树突状细胞(dendritic cells,DCs)疫苗并观察其在体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)对宫颈癌CaSki细胞的杀伤效应。方法:分离培养小鼠未成熟DCs,FCM检测小鼠未成熟DCs表面标志物CD40、CD86、主要组织... 详细信息

目的:制备树突状细胞(dendritic cells,DCs)疫苗并观察其在体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)对宫颈癌CaSki细胞的杀伤效应。方法:分离培养小鼠未成熟DCs,FCM检测小鼠未成熟DCs表面标志物CD40、CD86、主要组织相容性复合体-Ⅱ(major histocompatibility complex-Ⅱ,MHC-Ⅱ)和CD11c;将已成功构建的携带人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16E6E7基因的重组腺病毒pAd-E6E7感染体外培养的小鼠未成熟DCs,提取CaSki细胞裂解物负载DCs,制备DC疫苗,激光共聚焦显微镜下观察pAd-E6E7感染的小鼠未成熟DCs绿色荧光蛋白表达,Western印迹法检测E6蛋白的表达;DCs疫苗诱导产生CTLs后与CaSki细胞共培养,CCK8(cell countingkit8)法检测其对CaSki细胞的杀伤效应。结果:成功分离培养了小鼠未成熟DCs,并制备获得了HPV16E6E7特异性DCs疫苗。DCs疫苗诱导产生的CTLs对CaSki细胞具有杀伤作用,pAd-E6E7感染组对CaSki的杀伤效应明显高于CaSki细胞裂解物负载组及未处理DCs组(P病毒感染DCs制备基因修饰的DCs疫苗,具有诱导CTLs体外杀伤子宫颈癌CaSki细胞的作用。

关键词：宫颈癌疫苗,合成人乳头瘤病毒 T淋巴细胞,细胞毒性树突状细胞 CaSki细胞

小鼠PD-1及其配体PD-L1胞外区基因的原核表达及亲和性

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温州医科大学学报 2018年第6期48卷 401-407,412页

作者：吕开绩陈旭东程开王路得朱进顺 Kamara Saidu 张丽芳朱冠保温州医科大学附属第一医院胃肠外科浙江温州325015 温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室浙江温州325035

目的:制备小鼠PD-1胞外区(mPD-1)与其配体PD-L1胞外区(mPD-L1)原核表达蛋白,并制备mPDL1兔多克隆抗体,在体外对mPD-L1和mPD-1的结合亲和性进行验证。方法:通过分子克隆方法分别构建重组质粒pET21a/mPD-L1和p GEX4T-1/mPD-1,并通过原核... 详细信息

目的:制备小鼠PD-1胞外区(mPD-1)与其配体PD-L1胞外区(mPD-L1)原核表达蛋白,并制备mPDL1兔多克隆抗体,在体外对mPD-L1和mPD-1的结合亲和性进行验证。方法:通过分子克隆方法分别构建重组质粒pET21a/mPD-L1和p GEX4T-1/mPD-1,并通过原核表达系统制备相应的重组蛋白并纯化,通过Western blot进行鉴定;将纯化的mPD-L1蛋白免疫健康日本大耳白兔制备兔多克隆血清抗体,用ELISA、Western blot分析得到的多克隆抗体的效价和特异性,并且将该多克隆抗体作为免疫荧光的阳性对照。最后应用ELISA和免疫荧光验证mPD-1与其配体mPD-L1蛋白的亲和性。结果:SDS-PAGE和Western blot结果显示原核表达的重组蛋白与预期大小一致,mPD-L1和mPD-1分别为25 kDa和40 kDa。经mPD-L1蛋白免疫后的日本大耳白兔能够产生特异性抗体,抗体效价在免疫后第6周达到高峰,Western blot检测结果显示多克隆血清可特异性识别mPD-1。ELISA结果表明,原核表达的mPD-L1蛋白能够和mPD-1蛋白结合,实验组OD450值明显高于对照组。免疫荧光结果显示,在小鼠PD-L1阳性细胞B16(小鼠黑色素瘤细胞株)的胞膜区出现绿色荧光团块。结论:利用原核细胞表达并纯化后获得mPD-L1和mPD-1蛋白,并在体外成功验证了mPD-L1和mPD-1之间的结合特性,为后期利用mPD-1和PD-L1的生物学特性研究提供了基础。

关键词： mPD-1 mPD-L1 原核表达干扰素 ELISA 免疫荧光小鼠

MAGE-A3多克隆抗体的制备及在胃癌细胞检测中的应用

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温州医科大学学报 2017年第5期47卷 318-324页

作者：蔡一奇程开陈旭东陈孝冬岑丹维张婵琼宋易玲毛姗姗叶晓鲜张丽芳朱冠保温州医科大学附属第一医院胃肠外科浙江温州325015 温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室浙江温州325035

目的:通过原核表达系统制备人黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)蛋白,制备其多克隆抗体,经鉴定后用于胃癌细胞检测。方法:将MAGE-A3全长核酸序列经原核密码子优化后全基因序列合成,克隆至原核表达载体pET21a(+),构建pET21a(+)/MAGE-A3重组质粒,... 详细信息

目的:通过原核表达系统制备人黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)蛋白,制备其多克隆抗体,经鉴定后用于胃癌细胞检测。方法:将MAGE-A3全长核酸序列经原核密码子优化后全基因序列合成,克隆至原核表达载体pET21a(+),构建pET21a(+)/MAGE-A3重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达MAGE-A3蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化后的MAGE-A3蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆血清抗体,用ELISA、Western blot、免疫荧光技术分析该多克隆抗体的特异性,并用免疫组织化学技术鉴定MAGE-A3兔多克隆抗体在人胃癌细胞免疫检测应用中的可行性。结果:成功构建重组质粒pET21a(+)/MAGE-A3,并经原核表达系统表达MAGE-A3蛋白。SDS-PAGE显示目的蛋白分子质量大小约为48 k Da,与预期蛋白大小一致,并以His单抗进行Western blot鉴定,出现了特异性的单一条带。MAGEA3蛋白免疫日本大耳白兔,可诱导兔产生特异性抗体,免疫后第8周达到高峰,经Western blot检测显示多克隆血清可特异性识别靶蛋白,出现阳性单一条带;经免疫荧光检测显示,在MAGE-A3阳性细胞A-375(黑色素瘤细胞株)和SGC-7901细胞(胃癌细胞株)的胞浆内出现荧光团块。表明兔多克隆抗体可特异性识别天然的MAGE-A3蛋白。结合免疫荧光结果后经ELISA检测,可认为该多克隆Ig G抗体效价可达1:40 000;免疫组织化学检测显示在A-375和SGC-7901肿瘤组织的胞浆内出现团块状棕黄色颗粒样沉淀,而在BGC-823肿瘤组织中呈阴性,表明制备的MAGE-A3兔多克隆抗体能够特异性地识别肿瘤组织中MAGE-A3蛋白。结论:通过原核表达系统制备了MAGE-A3蛋白,并免疫兔制备了MAGE-A3蛋白特异性兔多克隆抗体,同时可以特异性地识别人胃癌细胞中的MAGE-A3蛋白,可作为免疫诊断用抗原。

关键词：人黑色素瘤抗原A3 原核表达系统多克隆抗体胃肿瘤

DENV-2作用于HUVECs和人巨噬细胞对黏附分子表达的影响

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中国免疫学杂志 2019年第15期35卷 1802-1807页

作者：罗玉左丽来涛张妮周恩正陈俊豪贵州医科大学免疫学教研室

目的:研究登革Ⅱ型病毒(DENV-2)感染人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人巨噬细胞,且感染后共培养对主要黏附分子表达的影响。方法:水平密度梯度离心法提取浓缩白细胞中的外周血单核细胞(PBMC),贴壁分离单核细胞,用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF... 详细信息

目的:研究登革Ⅱ型病毒(DENV-2)感染人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人巨噬细胞,且感染后共培养对主要黏附分子表达的影响。方法:水平密度梯度离心法提取浓缩白细胞中的外周血单核细胞(PBMC),贴壁分离单核细胞,用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)刺激5~7 d,流式细胞术鉴定细胞表面CD14和CD11b分子。用10 3 TCID50 DENV-2分别感染HUVECs和人巨噬细胞,且感染后两者共培养,qRT-PCR检测细胞内不同时间点DENV NS1、VCAM-1、ICAM-1和E-selectin mRNA相对表达量。双抗体夹心ELISA法分别检测不同时间点各组培养上清液中可溶性分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的表达水平变化。结果:流式细胞术鉴定人巨噬细胞纯度为(92.15±1.24)%。DENV-2感染HUVECs后病毒基因NS1的相对表达量呈先升后降趋势,在24 h达到峰值后下降,DENV-2感染人巨噬细胞的DENV NS1基因相对表达量呈先递减后增加趋势,共培养组HUVECs的NS1 mRNA各时间点表达水平均高于HUVECs单独感染组。DENV-2感染巨噬细胞后,ICAM-1 mRNA相对表达量于4、8 h高于巨噬细胞未感染组,12、24、48、72 h相对表达水平与未感染组相比差异无统计学意义;E-selectin mRNA相对表达量于4 h明显高于巨噬细胞未感染组,8 h与未感染组相比表达量无统计学意义差异,12、24、48、72 h与未感染组相比表达量下调;但未检测到VCAM-1 mRNA的表达。共培养组HUVECs的ICAM-1和VCAM-1 mRNA相对表达量与HUVECs单独感染组相比8 h后均上调,且均在24 h达峰值。感染后的HUVECs E-selectin mRNA于4 h表达水平最高,且各组相对表达量均低于共培养组。共培养组中感染DENV-2的HUVECs培养上清液中ICAM-1表达量均高于HUVECs单独感染组;共培养组中感染DENV-2的HUVECs中E-selectin表达量随时间呈先增后降趋势,且在24 h表达量达峰值;但未检测到培养上清液中VCAM-1的表达。结论: DENV-2能在HUVECs和人巨噬细胞中复制且能激活内皮细胞,被DENV-2感染的巨噬细胞能增强被感染的HUVECs的细胞活化并增加其黏附分子的表达。

关键词：登革病毒人脐静脉内皮细胞人巨噬细胞黏附分子

人IL-6、TNF-α对登革病毒感染人树突状细胞的影响

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细胞与分子免疫学杂志 2006年第4期22卷 469-471页

作者：史毓杰江振友曾抗暨南大学医学院微生物学与免疫学教研室广东广州510632 南方医科大学南方医院皮肤科广东广州510515

目的:探讨IL-6和TNF-α对登革病毒感染人树突状细胞(DC)的影响。方法:从人外周血中常规分离单核细胞,以GM-CSF和IL-4诱导成DC并进行形态学特征、细胞表型和淋巴细胞刺激能力的鉴定。用不同浓度的IL-6、TNF-α作用于Ⅱ型登革病毒(DV2)感... 详细信息

目的:探讨IL-6和TNF-α对登革病毒感染人树突状细胞(DC)的影响。方法:从人外周血中常规分离单核细胞,以GM-CSF和IL-4诱导成DC并进行形态学特征、细胞表型和淋巴细胞刺激能力的鉴定。用不同浓度的IL-6、TNF-α作用于Ⅱ型登革病毒(DV2)感染的DCs,于感染后6、24、48、72、96h收集上清,采用甲基纤维素微量病毒空斑法检测病毒的滴度,以MTT比色法测定IL-6和TNF-α对DV感染DC及正常DC数量的变化。结果:中、低浓度的IL-6对DC中DV2的增殖均有增强作用;高、中浓度的TNF-α对DC中DV2的增殖具有抑制作用。IL-6和TNF-α对DV感染DC及正常DC数量无明显影响。结论:IL-6和TNF-α通过对DC的影响在DV2感染中具有重要作用。

关键词：登革病毒人树突状细胞细胞因子感染

诱导特异性CTL为基础的EBV相关肿瘤免疫治疗策略

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细胞与分子免疫学杂志 2002年第2期18卷 198-200页

作者：彭光勇南京医科大学微生物与免疫学教研室江苏南京210029

Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒（ＥＢＶ）属于γ－疱疹病毒家族，在人群中感染非常普遍，在体内以潜伏和增殖状态存在。它是传染性单核细胞增多症（ＩＭ）的病原，同时也能引起Ｂ淋巴细胞增生性疾病。ＥＢＶ也是重要的肿瘤ＤＮＡ病毒，... 详细信息

Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒（ＥＢＶ）属于γ－疱疹病毒家族，在人群中感染非常普遍，在体内以潜伏和增殖状态存在。它是传染性单核细胞增多症（ＩＭ）的病原，同时也能引起Ｂ淋巴细胞增生性疾病。ＥＢＶ也是重要的肿瘤ＤＮＡ病毒，目前发现其与非洲儿童Ｂｕｒｋｉｔｔ＇ｓ淋巴瘤（ＢＬ）和鼻咽癌（ＮＰＣ）、何杰金氏淋巴瘤（ＨＤ）、成人Ｔ细胞淋巴瘤及各种免疫抑制剂治疗病人和器官移植病人的淋巴细胞增生紊乱引起的淋巴瘤等密切相关。ＥＢＶ感染在体内能激发强烈的特异性杀伤性Ｔ细胞（ＣＴＬ），其能控制病毒的潜伏、增殖、维持及转化。大量研究表明，ＥＢＶ相关肿瘤患者体内也存在着一定的ＥＢＶ特异性ＣＴＬ前体细胞，用各种方式激发这些

关键词： Epstein-Barr病毒 LCL CTL DC 免疫治疗肿瘤

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人呼吸道禽流感病毒受体的分布趋势(英文)

生物化学与生物物理进展 2008年第12期35卷 1387-1393页

作者：张增峰樊晓晖李康生黄楷罗殿中冯振博韦敏怡管轶陈鸿霖张锦霞汕头大学医学院国际感染与免疫研究所汕头515031 香港大学医学院微生物系新发传染病国家重点实验室广西医科大学微生物与免疫学教研室南宁530021 广西医科大学病理学教研室南宁530021

禽类流感病毒和人类流感病毒具有很强的受体识别特异性,分别与唾液酸α-2,3Gal和α-2,6Gal受体分子结合而感染各自的宿主细胞.这种受体结合特异性是流感病毒在禽类和人类之间跨种属传递的主要障碍.应用凝集素组织化学染色技术,探讨人呼... 详细信息

禽类流感病毒和人类流感病毒具有很强的受体识别特异性,分别与唾液酸α-2,3Gal和α-2,6Gal受体分子结合而感染各自的宿主细胞.这种受体结合特异性是流感病毒在禽类和人类之间跨种属传递的主要障碍.应用凝集素组织化学染色技术,探讨人呼吸道各解剖学部位流感病毒唾液酸受体的分布特征.结果显示,唾液酸α-2,3Gal受体,即禽类流感受体,主要分布在下呼吸道的呼吸部即呼吸细支气管和肺泡,而在主气管、支气管和细支气管仅少量分布.相反,人类流感病毒受体,唾液酸α-2,6Gal受体在气管、支气管呈高密度分布,随着支气管分级逐渐降低分布减少,至肺泡分布最少.但比较人呼吸道发育成熟过程中,唾液酸α-2,3Gal和α-2,6Gal受体的表达,未发现明显差别.禽流感H5N1病毒体外感染人呼吸道组织试验结果表明,肺泡上皮较支气管和气管上皮易感染,与唾液酸α-2,3Gal受体分布特点相符合.结果提示,人呼吸道可被禽流感病毒感染,目前H5N1病毒极少发生人传人的特点,可能与个体间上呼吸道唾液酸α-2,3Gal受体表达差异有关.

关键词： A型流感病毒唾液酸 SAα2,6Gal受体 SAα2,3Gal受体 H5N1病毒

水痘-带状疱疹病毒临床分离株基因型别分析以及与Oka疫苗株的区别

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中华微生物学和免疫学杂志 2009年第3期29卷 224-228页

作者：刘静静王明丽甘霖杨森陈敬贤安徽医科大学微生物学教研室合肥230032 安徽医科大学皮肤性病研究所哥伦比亚大学病理与细胞生物学教研室纽约NY10032

目的运用分子牛物学方法对从水痘或带状疱疹患者皮肤疱疹液巾分离得到的水痘．带状疱疹（VZV）株进行基因型研究，并区分感染是由野生株还足由Oka疫苗株引起的。方法从水痘或带状疱疹患者的皮肤水疱液中分离VZV，然后利用聚合酶链反应... 详细信息

目的运用分子牛物学方法对从水痘或带状疱疹患者皮肤疱疹液巾分离得到的水痘．带状疱疹（VZV）株进行基因型研究，并区分感染是由野生株还足由Oka疫苗株引起的。方法从水痘或带状疱疹患者的皮肤水疱液中分离VZV，然后利用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性分析对病毒株的ORF38、54、62和R5可变区基因进行分析。结果在所分离的19株VZV中，存在PstⅠ^＋BglⅠ^＋R5A和PstⅠ^＋BglⅠ^＋RSB两种基因型，其中PstⅠ^＋BglⅠ^＋R5A占52．7％，PstⅠ^＋BglⅠ^＋RSB占47．3％，没有发现与Oka疫苗株相同的基因型。结论本研究中所分离的VZV毒株均系野生株，它们的基因型与欧洲、美国、日本的VZV分离株均不相同。利用病毒基因组中ORF38和ORF62区域的单一核苷酸多态性，能够区分疫苗株和野毒株。

关键词：水痘-带状疱疹病毒基因分型 Oka疫苗株野毒株