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HPV16型E6蛋白的B细胞线性表位预测及分析

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中国病原生物学杂志 2015年第3期10卷 220-223,227页

作者：杨恩张燕侯柏龙杜王琪张丽芳温州医科大学第一临床医学院浙江温州325035 温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室

目的对高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus)16型E6蛋白的B细胞线性表位进行预测。方法以HPV16型E6蛋白(P03126)的全长氨基酸序列为基础,采用EXPASY网站上的生物信息学软件和DNAstar软件包中的Protean软件分析E6蛋白的二级结构,跨... 详细信息

目的对高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus)16型E6蛋白的B细胞线性表位进行预测。方法以HPV16型E6蛋白(P03126)的全长氨基酸序列为基础,采用EXPASY网站上的生物信息学软件和DNAstar软件包中的Protean软件分析E6蛋白的二级结构,跨膜趋势及其亲水性,表面可及性,抗原性,极性和柔韧性等特性。综合以上参数预测HPV16型E6蛋白的B细胞线性表位,并进一步进行同源性匹配分析。结果综合多个参数分析显示B细胞线性表位可能位于E6蛋白N端2-7、9-19、30-36、45-49、105-109、119-125和148-158区段及其附近,进一步同源性匹配分析支持其中区段2-7、9-19、119-125及148-158为可能的B细胞线性表位,其中区段148-158(RSSRTRRETQL)为HPV16型E6蛋白所特有的序列,而区段2-7(HQKRTA)、9-19(FQDPQERPRKL)与HPV9型E6蛋白具有同源性,区段119-125(PEEKQRH)与HPV31型E6蛋白具有同源性。结论综合分析预测HPV16型E6蛋白的B细胞线性表位可能位于E6蛋白N端2-7、9-19、119-125及148-158区段,为HPV16型E6蛋白的进一步研究奠定了基础。

关键词： HPV16型 E6蛋白 B细胞线性表位预测同源性匹配分析

人颗粒酶B融合蛋白的原核表达及其免疫血清的制备

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中国生物制品学杂志 2017年第3期30卷 234-238页

作者：汪文寰冯方方蔡一奇张婵琼岑丹维宋易玲郭刚强张丽芳李文姝温州医科大学微生物学与免疫学教研室浙江温州325035

目的在原核体系中表达人颗粒酶B(granzyme B,Gzm B)融合蛋白,并制备Gzm B免疫血清多克隆抗体。方法构建Gzm B原核表达重组质粒p ET32a-Gzm B,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组Gzm B(r Gzm B)蛋白,镍离子螯合亲和层析柱纯化表... 详细信息

目的在原核体系中表达人颗粒酶B(granzyme B,Gzm B)融合蛋白,并制备Gzm B免疫血清多克隆抗体。方法构建Gzm B原核表达重组质粒p ET32a-Gzm B,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组Gzm B(r Gzm B)蛋白,镍离子螯合亲和层析柱纯化表达产物。以纯化的r Gzm B蛋白为免疫原,皮下多点注射BALB/c小鼠,共免疫3次,分别于免疫后2、4、6周经小鼠尾静脉采血,分离血清,间接ELISA法检测免疫血清中Gzm B特异性Ig G抗体水平,并确定其抗体最大稀释度,免疫斑点试验检测免疫血清多克隆抗体对Gzm B的特异免疫结合特性。结果质粒p ET32aGzm B经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的r Gzm B蛋白相对分子质量为48 000;纯化的r Gzm B蛋白免疫小鼠血清中Gzm B特异性Ig G抗体水平随免疫时间延长至第4周达到高峰,随后维持一定水平;抗体最大稀释度为1∶1 600;r Gzm B免疫血清能够特异地结合Gzm B,显示了其免疫结合特性。结论制备了r Gzm B蛋白和Gzm B小鼠免疫血清多克隆抗体,为后续开展Gzm B的靶向杀伤、靶向检测等应用研究奠定了基础。

关键词：颗粒酶B 原核表达多克隆抗体

人乳头瘤病毒58型L1蛋白B细胞表位预测和分析

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中国病原生物学杂志 2017年第5期12卷 407-411,415页

作者：宋易玲叶晓鲜毛珊珊岑丹维张婵琼蒋朋飞张丽芳温州医科大学微生物学与免疫学教研室浙江温州325035

目的对人乳头瘤病毒58型(HPV58)主要结构蛋白(L1)的B细胞表位进行预测和分析。方法利用生物信息学软件EXPASY在线分析HPV58型L1蛋白的二级结构及生物学特性,包括跨膜趋势、表面可及性、抗原性、亲水性,溶性等,从而对其B细胞表位进行综... 详细信息

目的对人乳头瘤病毒58型(HPV58)主要结构蛋白(L1)的B细胞表位进行预测和分析。方法利用生物信息学软件EXPASY在线分析HPV58型L1蛋白的二级结构及生物学特性,包括跨膜趋势、表面可及性、抗原性、亲水性,溶性等,从而对其B细胞表位进行综合分析和预测。结果通过亲水性参数,Zimmcrman极性,柔韧性参数,表面可及性及抗原性进行综合分析,预测人乳头瘤病毒58型L1蛋白的B细胞表位可能位于其N端的29-37,43,46-58,64-67,74,79-88,93,100-101,103-125,133-139,149,151-180,187-213,220-213,235,238-247,252-271,277-282,286-309,320-323,327-338,341-348,351,353-368,373-396,408,427,419-425,433-444,453-468,470,475-486,488-490,493-494,497-524肽段区域;进一步用Protien Plast在线同源匹配分析,79-88、190-216、373-396、453-468、497-524肽段区段为可能的B细胞表位。结论用多参数预测分析HPV58型L1蛋白可能的B细胞表位,为进一步研究高危型58型L1蛋白的生物学特性提供了理论基础。

关键词：人乳头瘤病毒58型(HPV58) B细胞表位 L1蛋白同源性匹配分析

表达乙型肝炎表面抗原及前 S2蛋白120～146片段重组酵母菌的构建及全菌体免疫效应评价

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中华传染病杂志 2014年第11期32卷 660-665页

作者：陈向敏张跃进田晓娟夏平潘唯文夏天俞陈慧张丽芳薛向阳温州医科大学生物学实验教学中心 325035 温州医科大学诊断学实验室 325035 温州医科大学分子病毒与疫苗研究所微生物与免疫学教研室 325035 仁济学院

目的：构建表达 HBsAg 及前 S2蛋白120～146片段（PreS2120-146）-HBsAg 的重组酵母菌，并评价其全菌体免疫效应。方法根据酵母密码子偏爱性优化 PreS2120-146区及 HBsAg 基因序列，串联后克隆到毕赤酵母 pPIC3．5K 表达载体，构建 pPIC... 详细信息

目的：构建表达 HBsAg 及前 S2蛋白120～146片段（PreS2120-146）-HBsAg 的重组酵母菌，并评价其全菌体免疫效应。方法根据酵母密码子偏爱性优化 PreS2120-146区及 HBsAg 基因序列，串联后克隆到毕赤酵母 pPIC3．5K 表达载体，构建 pPIC3．5K／PreS2120-146-HBsAg 质粒，重组质粒经 BgkⅡ酶切线性化后，电转化至 GS115菌株中，筛选 PreS2120-146-HBsAg 重组毕赤酵母，通过 SDS-PAGE、Western 印迹、ELISA 分析目的蛋白的表达；以表达目的蛋白的灭活酵母全菌体免疫 BALB／c 小鼠，采用 ELISA 检测其产生的 HBsAg 特异性抗体；以 HBsAg CTL 表位肽刺激免疫小鼠脾细胞，通过实时PCR 检测γ干扰素表达，分析其诱导的 CTL 反应。采用独立样本 t 检验。结果PCR、酶切和测序分析表明成功构建了 pPIC3．5K／PreS2120-146-HBsAg 重组质粒。重组毕赤酵母甲醇诱导后，SDS-PAGE、Werstern 印迹和 ELISA 证实 PreS2120-146-HBsAg 目的蛋白表达。与 HBsAg 纯抗原免疫比较，灭活重组酵母菌免疫小鼠产生抗 HBsAg 特异性 IgG 抗体水平相当（t＝0．946，P ＝0．381）。CTL 反应检测显示， HBsAg CTL 表位肽刺激灭活重组酵母菌免疫组小鼠的脾细胞产生更高水平的γ干扰素（t＝2．305，P ＝0．044）。结论利用整合型重组毕赤酵母表达系统成功表达了 PreS2120-146-HBsAg 目的蛋白，全菌体免疫小鼠后能诱导产生特异的体液免疫和细胞免疫反应。

关键词：肝炎表面抗原,乙型 PreS2 毕赤酵母免疫反应

细胞周期蛋白依赖性激酶4重组蛋白兔血清抗体的制备及鉴定

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中国生物制品学杂志 2021年第4期34卷 406-409,414页

作者：慈兴元王艾俐叶一鸣徐思诗王佳贝潘依琦陈俊张丽芳赵孔南温州医科大学分子病毒与免疫学研究所浙江温州325035

目的制备细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)重组蛋白兔血清抗体并鉴定其特性。方法将设计合成的CDK4基因克隆至载体pET21a(+)中,构建重组质粒pET21a(+)/CDK4,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产... 详细信息

目的制备细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)重组蛋白兔血清抗体并鉴定其特性。方法将设计合成的CDK4基因克隆至载体pET21a(+)中,构建重组质粒pET21a(+)/CDK4,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物经镍螯合亲和层析纯化,将纯化的重组蛋白CDK4与等量弗式佐剂混合,经背部皮下多点免疫日本大耳白兔,隔周1次,共免疫3次。于末次免疫后0(当天)、2、4、6、8周采血,分离血清。间接ELISA法检测效价,免疫荧光及免疫组化法检测特异性。结果经酶切及测序鉴定,重组质粒pET21a(+)/CDK4构建正确。重组蛋白CDK4相对分子质量约为19 100。第8周CDK4兔血清抗体效价达1∶163 840,能特异性识别宫颈癌Siha细胞及宫颈癌组织中表达的CDK4蛋白。结论成功制备了高效价、特异性强的CDK4兔血清抗体,为进一步研究CDK4生物学特性奠定了基础。

关键词：细胞周期蛋白依赖性激酶4 重组蛋白原核细胞基因表达血清抗体

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中HCMV基因表达谱及其特异性抗体特征

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病毒学报 2023年第1期39卷 113-123页

作者：施昕妤谢尚丹项超丽李宝青陈朝生薛向阳章慧娣温州医科大学基础医学院、分子病毒学与免疫学研究所、微生物与免疫学教研室温州325000 浙江大学医学院免疫研究所杭州310000 温州医科大学附属第二医院温州325000 温州医科大学附属第一医院温州325000

人类巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)感染是系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)的重要病因,并会加剧疾病进展。然而,SLE患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中HCMV基因的表达谱及其特异性抗体特征尚未完全阐明,并且HCMV蛋白特异性抗体水平与SLE患者临床特征的相关性尚未得到证实。通过Poly(A)建库的mRNA转录组测序(Poly(A)RNA-Seq)检测3例SLE患者和3例健康对照者(Healthy control,HC)的PBMC中的HCMV基因表达谱。然后在10例SLE患者和10例HC的链特异性建库的mRNA转录组测序(strand-specific RNA-seq)结果中验证检测到的HCMV基因。除此之外,通过免疫信息学分析筛选HCMV基因的B细胞表位。ELISA用于检测120例SLE患者和75例HC血清中的HCMV特异性抗体水平,并将其与患者的临床特征相关联。本研究在SLE患者和HC的PBMC中检测到8个HCMV基因。免疫信息学分析筛选出7个HCMV基因的优势B细胞表位。与HC相比,SLE患者血清中UL32和UL82特异性抗体显著降低。UL32特异性抗体可能与SLE患者血细胞功能异常有关。UL82特异性抗体可能参与SLE患者免疫系统功能异常和肾脏功能障碍。受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic,ROC)分析表明,其中UL32特异性抗体可以有效区分SLE患者和HC。

关键词：人巨细胞病毒系统性红斑狼疮外周血单个核细胞 B细胞表位

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HBV上PHSA受体与循环中PHSA结合情况研究

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免疫学杂志 1989年第4期 273-235页

作者：蔡美英,张子康,蒋孔(?) 华西医科大学微生物学与免疫学教研室华西医科大学微生物学与免疫学教研室成都铁路卫生学校成都成都

乙型肝炎病毒(HBV)是环状部分双股的DNA病毒,它在许多特性上不同于其它已知的人类病毒。目前尽管在分子水平上进行了比较深入的研究,但关于HBV的嗜肝机理至今没有得到令人满意的解释。1979年Imai等证实了HBV上有一种与人血清中老化白蛋... 详细信息

乙型肝炎病毒(HBV)是环状部分双股的DNA病毒,它在许多特性上不同于其它已知的人类病毒。目前尽管在分子水平上进行了比较深入的研究,但关于HBV的嗜肝机理至今没有得到令人满意的解释。1979年Imai等证实了HBV上有一种与人血清中老化白蛋白分子(PHSA)结合的受体,Thung等于1982年证实肝细胞表面也有PHSA受体。因此不少学者提出HBV上的PHSA受体通过PHSA的桥介导作用以达到嗜肝的目的。为了研究PHSA在HBV嗜肝过程中的桥介导作用,作者应用ELISA法着重检测了血循环中PHSA与HBV的结合情况,现简要报告如下。

关键词： HBV PHSA 血清受体结合介导作用

HPV-16-11 L1双价重组杆状病毒的构建及VLP形成

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中华微生物学和免疫学杂志 2006年第9期26卷 771-776页

作者：庄敏谷鸿喜李迪崔洪波刘希君魏兰兰凌虹哈尔滨医科大学微生物学教研室 150086

目的将本地区流行株HPV-16 L1基因与HPV-11 L1基因双表达于杆状病毒昆虫细胞表达系统,组装成类病毒颗粒(virus like particles,VLP)。为研制同时预防宫颈癌和尖锐湿疣等多种疾病的HPV-16-11型基因工程疫苗奠定基础。方法对本地流行株HPV... 详细信息

目的将本地区流行株HPV-16 L1基因与HPV-11 L1基因双表达于杆状病毒昆虫细胞表达系统,组装成类病毒颗粒(virus like particles,VLP)。为研制同时预防宫颈癌和尖锐湿疣等多种疾病的HPV-16-11型基因工程疫苗奠定基础。方法对本地流行株HPV-16 L1基因进行亚克隆,构建pBluescript-HPV-16L1克隆质粒,并对其测序。再将质粒中HPV-16 L1基因切下,连接到pFastBacDual的强启动子phol后;从克隆质粒pSP73-HPV-11 L1切下HPV-11 L1,连接到pFastBacDual的弱启动子p10后,利用Bac to Bac系统在昆虫细胞Sf9中表达外源蛋白。SDS-PAGE和Western blot鉴定HPV-16 L1和HPV-11 L1蛋白的表达量及特异性,电镜观察昆虫细胞内VLP的存在。结果酶切和PCR法证实pFastBacDual-HPV-16 L1-HPV-11 L1转移质粒连接正确,转染昆虫细胞Sf9后,检测到HPV-16和HPV-11 L1特异蛋白,两种蛋白的相对分子质量(Mr)相近,约56×103;电镜观察到了VLP。结论本研究利用Bac to Bac系统构建Bacmid／HPV-16-HPV-11 L1,转染到Sf9昆虫细胞后重组外源蛋白得到高效表达,并经电镜证实昆虫细胞内存在较大量VLP,用此VLP免疫BALB／c小鼠后产生抗L1蛋白的抗体。共表达HPV L1蛋白可能为预防多型别HPV感染提供新途径。

关键词：人乳头状瘤病毒16型人乳头状瘤病毒11型 L1基因共表达类病毒颗粒杆状病毒

人乳头瘤病毒16型致瘤基因E6在昆虫细胞中表达及其蛋白抗原特性的初步研究

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中华微生物学和免疫学杂志 1998年第6期18卷 444-448页

作者：栾怡于修平赵蔚明贾继辉山东医科大学微生物学教研室

目的研究人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）相关肿瘤患者的ＨＰＶ１６Ｅ６抗体水平及其流行病学意义；探讨用杆状病毒－昆虫细胞表达载体系统表达的ＨＰＶ１６Ｅ６蛋白的抗原性。方法用ＰＣＲ从ＨＰＶ１６基因组中扩增出ＨＰＶ１６Ｅ６完整基因，... 详细信息

目的研究人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）相关肿瘤患者的ＨＰＶ１６Ｅ６抗体水平及其流行病学意义；探讨用杆状病毒－昆虫细胞表达载体系统表达的ＨＰＶ１６Ｅ６蛋白的抗原性。方法用ＰＣＲ从ＨＰＶ１６基因组中扩增出ＨＰＶ１６Ｅ６完整基因，克隆至转移载体ｐＶＬ１３９３中，重组质粒ＤＮＡ与线性杆状病毒ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ－９，经噬斑筛选获得带有编码Ｅ６基因的重组杆状病毒株，并在昆虫细胞中表达。结果Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和高效液相色谱法检测ＨＰＶ１６Ｅ６表达蛋白，其分子量约为１８０００。免疫印迹检测显示其能与兔抗ＨＰＶ１６Ｅ６多抗特异性结合。酶联免疫吸附试验表明此重组蛋白能被人ＨＰＶ１６阳性血清所识别。结论昆虫细胞表达的ＨＰＶ１６Ｅ６蛋白，具有良好的抗原性。

关键词：乳头瘤病毒 E6基因基因表达抗原特性