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HPV16型E6重组蛋白的表达及其兔多克隆抗体的制备

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细胞与分子免疫学杂志 2020年第3期36卷 264-270页

作者：张庆媛朱进顺王路得汪琪朱珊丽陈韶张丽芳蒋朋飞温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室浙江温州325000

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E6原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法通过PCR法从Siha细胞株中获取HPV16 E6基因后克隆至pET21a(+)载体,构建pET21a(+)/HPV16 E6重组质粒,并经测序鉴定;将重组质粒pET21a(+)/HPV16 E6转化至*** BL21(DE3)中... 详细信息

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E6原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法通过PCR法从Siha细胞株中获取HPV16 E6基因后克隆至pET21a(+)载体,构建pET21a(+)/HPV16 E6重组质粒,并经测序鉴定;将重组质粒pET21a(+)/HPV16 E6转化至*** BL21(DE3)中,通过异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达HPV16 E6-His标签融合蛋白,经镍柱亲和层析纯化,然后通过Western blot法鉴定;将纯化的HPV16型E6重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,ELISA检测免疫后血清多克隆抗体效价,并用Western blot法和免疫荧光技术分析HPV16 E6兔多克隆抗体的特异性。结果成功构建pET21a(+)/HPV16 E6重组质粒,并经测序鉴定;在重组质粒pET21a(+)/HPV16 E6转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,经亲和层析法获得纯化的HPV16型E6重组蛋白,用于免疫日本大耳白兔获得多克隆抗体,抗体效价为1∶40000,并用Western blot法和免疫荧光技术确认了多克隆抗体的特异性。结论HPV16 E6原核表达成功并制备了HPV16 E6兔多克隆抗体。

关键词：人乳头瘤病毒(HPV) E6蛋白原核表达多克隆抗体

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HPV16 E5多表位肽免疫原性研究

免疫学杂志 2023年第4期39卷 341-347页

作者：张静李青峰汪琪朱珊丽陈韶张丽芳温州医科大学微生物学与免疫学教研室分子病毒与免疫研究所 325035

目的筛选人乳头瘤病毒16型(HPV16)E5蛋白多表位肽段,并评估其诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫的免疫原性反应。方法通过Uniprot获得HPV16 E5蛋白的氨基酸序列,采用EXPASY和SYFPEITHI等软件预测HPV16 E5蛋白的表位,筛选出富含B细胞... 详细信息

目的筛选人乳头瘤病毒16型(HPV16)E5蛋白多表位肽段,并评估其诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫的免疫原性反应。方法通过Uniprot获得HPV16 E5蛋白的氨基酸序列,采用EXPASY和SYFPEITHI等软件预测HPV16 E5蛋白的表位,筛选出富含B细胞和CTL表位的氨基酸肽段——HPV16 E5蛋白N端处aa28-46(LIRPLLLSVSTYTSLIILV),进一步用该多表位肽免疫C57BL/6小鼠,评估其诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫的反应。结果该肽段可诱导小鼠产生较高水平的特异性IgG抗体,且抗体滴度随着免疫次数增加而升高,同时可诱导小鼠产生特异性的CTL反应,在效靶比为40∶1时,对靶细胞产生显著的特异性杀伤作用。结论HPV16 E5蛋白多表位肽aa28-46(LIRPLLLSVSTYTSLIILV)具有良好的免疫原性,可为基于HPV16 E5蛋白的疫苗研究提供基础。

关键词： HPV16型 E5蛋白多表位免疫原性

EB病毒潜伏膜蛋白2多表位DNA联合多肽的免疫效应研究

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中国病原生物学杂志 2014年第2期9卷 117-121页

作者：李文姝田晓娟林晓云刘建晓朱珊丽薛向阳张丽芳温州医科大学分子病毒与免疫研究所/微生物学与免疫学教研室浙江温州325035

目的研究HPV L1携带EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)多表位DNA联合多肽的免疫效应。方法BALB/c雌性小鼠随机分为4组。pcHPVL1-EBV LMP2DNA免疫组,肌肉注射pcDNA3.1(+)/HPVL1-EBV LMP2多表位DNA,每鼠每次100μg;DNA联合多肽免疫组:先用DNA免疫,每鼠每次50μg,同时皮下注射EBV LMP2多表位肽,每鼠每次5μg;DNA免疫对照组:肌肉免疫空载体pcDNA3.1(+),每鼠每次100μg;多肽免疫对照组:每鼠每次10μg皮下注射不相关多肽。共免疫4次,间隔2周。免疫后第7周收集小鼠血清,采用ELISA法检测小鼠EBV LMP2特异性抗体IgG、IgA以及HPVL1特异性抗体IgG;免疫后第9周测定EBV特异性抗体IgG1与IgG2a亚类,同时采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定小鼠脾细胞CTL的杀伤活性。结果多肽联合DNA免疫组小鼠血清EBV LMP2特异性抗体IgG、IgA A值分别为1.573±0.025和0.436±0.033,单独DNA免疫组分别为1.282±0.051和0.317±0.022,差异有统计学意义(F=80.393,27.722,P免疫组小鼠血清HPV L1特异性IgG A值别为0.648±0.063和0.702±0.023,差异无统计学意义(F=1.952,P>0.05)。DNA免疫组IgG1和IgG2aA值别为0.723±0.023和0.594±0.084,差异无统计学意义(F=6.643,P>0.05),是混合Th1/Th2免疫反应类型;多肽联合DNA免疫组IgG1和IgG2aA值别为0.897±0.042和0.629±0.035,差异有统计学意义(F=72.306,P免疫反应类型。多肽联合DNA免疫组在效靶比为10︰1时,小鼠脾细胞CTL杀伤效应(杀伤率)为27.70%,DNA免疫组为21.50%,差异有统计学意义(F=51.559,P免疫可产生有效的CTL杀伤效应,更能发挥有效的体液免疫作用,其免疫策略可为EBV相关肿瘤的免疫治疗提供参考。

关键词： EB病毒潜伏膜蛋白2 多表位联合免疫

HPV16 E5蛋白免疫优势肽段分析及其多克隆抗体的制备

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中国生物制品学杂志 2021年第6期34卷 725-729,739页

作者：唐婉林王路得顾美萍 Kamara SAIDU 汪琪李明洋陈韶张丽芳温州医科大学微生物学与免疫学教研室浙江温州325035

目的预测人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus 16,HPV16)E5蛋白的免疫优势肽段,并制备其多克隆抗体。方法以人HPV16 E5蛋白全长氨基酸序列为基础,采用Hopp&Woods的亲水性方案、Zimmerman极性参数、Jameson-Wolf抗原指数方案和Emini... 详细信息

目的预测人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus 16,HPV16)E5蛋白的免疫优势肽段,并制备其多克隆抗体。方法以人HPV16 E5蛋白全长氨基酸序列为基础,采用Hopp&Woods的亲水性方案、Zimmerman极性参数、Jameson-Wolf抗原指数方案和Emini表面可及性方案及抗原性指数(antigenic index,AI)等生物信息学方法,综合分析E5蛋白免疫优势肽段。通过免疫日本大耳白兔进行E5蛋白免疫优势肽段的免疫原性验证并制备多克隆抗体;进一步采用ELISA法和间接免疫荧光试验分别检测多克隆抗体的效价及特异性。结果HPV16 E5蛋白N-端1~17氨基酸序列(MTNLDTASTTLLACFLL)为免疫优势肽段,可诱导兔产生高水平的E5蛋白特异性IgG抗体,抗体滴度随免疫次数增加而升高;间接细胞免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体可特异性识别TC-1-E5细胞胞浆内表达的E5蛋白。结论HPV16 E5蛋白氨基酸肽段(MTNLDTASTTLLACFLL)具有良好的免疫原性;成功制备了HPV16 E5蛋白多克隆抗体,为进一步研究HPV16 E5蛋白的生物学特性奠定了基础。

关键词：人乳头瘤病毒 E5蛋白免疫优势肽段多克隆抗体

人乳头瘤病毒16/18型E7双特异亲和体融合颗粒酶B的免疫亲和毒素制备和鉴定

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病毒学报 2023年第5期39卷 1326-1335页

作者：余丽君李妍姮黄智羡杨佳妮谢自新张丽芳李文姝温州医科大学微生物学与免疫学教研室温州325000

制备人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)16/18型双特异性亲和体(Affibody,Z_(HPV16-18E7))融合颗粒酶B(GrB)的免疫亲和毒素,并鉴定其诱导靶细胞凋亡效应。于实验室前期已构建的Z_(HPV16-18E7)的N-端、中间、及C-端,偶联GrB构建不... 详细信息

制备人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)16/18型双特异性亲和体(Affibody,Z_(HPV16-18E7))融合颗粒酶B(GrB)的免疫亲和毒素,并鉴定其诱导靶细胞凋亡效应。于实验室前期已构建的Z_(HPV16-18E7)的N-端、中间、及C-端,偶联GrB构建不同融合形式的免疫亲和毒素,并在原核表达体系中制备与纯化;在线网站分析免疫亲和毒素基本理化性质和空间结构预测;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测免疫亲和毒素分别对靶蛋白HPV16E7、HPV18E7的特异性结合力;流式细胞分析术检测免疫亲和毒素分别诱导人宫颈癌细胞SiHa(HPV16阳性)、HeLa(HPV18阳性)的细胞凋亡效应。成功构建三种不同组合形式的免疫亲和毒素,各免疫亲和毒素空间结构符合理论预测,且理化特性趋于一致;融合于Z_(HPV16-18E7)中间和C-端的两种免疫亲和毒素组合形式可在原核表达体系中表达出预期目的蛋白;制备的免疫亲和毒素可特异性结合相应的靶蛋白,结合效价均可达到1∶5625与1∶78125之间,且可分别诱导靶细胞产生显著的细胞凋亡效应。本研究成功构建与制备了基于亲和体的免疫亲和毒素,为HPV感染宫颈癌靶向治疗研究提供了新思路。

关键词：人乳头瘤病毒 HPV16/18型 Affibody 颗粒酶B 双靶向细胞凋亡

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1复合抗原优势表位免疫原性研究

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中华传染病杂志 2016年第1期34卷 32-38页

作者：吕金辉汪文寰熊一融杜王琪叶璐璐张丽芳李文姝温州医科大学微生物学与免疫学教研室 325032

目的分析弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）和膜表面蛋白1（SAGl）复合抗原免疫优势表位的免疫原性。方法利用生物信息学技术预测和筛选出弓形虫复合抗原ROP2-SAG1免疫优势T、B淋巴细胞表位组合，将优势表位相应基因片段克隆至pET32a（＋）载... 详细信息

目的分析弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）和膜表面蛋白1（SAGl）复合抗原免疫优势表位的免疫原性。方法利用生物信息学技术预测和筛选出弓形虫复合抗原ROP2-SAG1免疫优势T、B淋巴细胞表位组合，将优势表位相应基因片段克隆至pET32a（＋）载体并转化至表达感受态（大肠埃希菌Rosetta菌株）中诱导表达，通过离子螯合亲和层析柱（Ni—NTA）纯化表达产物，经SDS—PAGE鉴定表达产物纯化效果。以纯化的优势表位蛋白作为免疫原，皮下多点注射日本大耳兔，设pET32a（＋）载体蛋白和PBS为对照，以纯化的优势表位蛋白作包被抗原，ELISA法检测第0、2和4周免疫兔血清中表位特异性抗体IgG的产生时间及效价，免疫斑点实验验证免疫兔血清多克隆抗体的特异性。以纯化的优势表位免疫BALB／c小鼠，酶联免疫斑点分析技术检测免疫鼠脾细胞7干扰素产生能力。结果在原核表达体系中获得了相对分子质量为30000的优势表位融合表达产物。纯化的表位蛋白免疫大耳白兔血清中可检测到相应的表位特异性抗体IgG，其抗体水平随着免疫次数的增加而呈现逐渐升高的趋势，优势表位免疫组第2、4周兔血清抗体显著高于载体pET32a（＋）蛋白对照组（1．454±0．098比0．616±0．084，F=0．000，P〈0．05；2．299±0．224比1．580±0．192，F=0．112，P〈O．05），第4周的免疫血清多克隆抗体效价可达1：40960。免疫斑点实验证实多克隆抗体针对优势表位具有良好的特异性。原核体系制备的优势表位蛋白免疫鼠脾细胞受3种不同的CTL表位肽刺激产生的7干扰素水平，分别为表位肽1[（19．333±1．528）／10万细胞]、表位肽2[（40．333±1．528）／10万细胞]、表位肽3E（70．667±1．890）／10万细胞]，与PBS免疫对照组[表位肽1（1．033±0．150）／10万细胞、表位肽2（1．045±0．110）／10万细胞、表位肽3（1．041±0．120）／10万细胞]比较差异均有统计学意义（F值分别为0．284、0．000、0．284，均P〈0．05）。免疫鼠脾细胞受到优势表位中特异性CTL表位肽刺激后，γ干扰素产生水平显著升高，而且CTL表位联合Th表位的组合肽刺激（表位肽3），7干扰素产生水平分别显著高于单独的CTL表位肽刺激组（表位肽1和2，F值分别为5．796、0．000，均P〈0．05）。结论筛选的弓形虫复合抗原ROP2一SAGl免疫优势表位通过原核表达体系制备的重组表位蛋白，具有显著的免疫原性。

关键词：弓形虫 ROP2-SAG1 表位免疫原性

新型冠状病毒PLpro蛋白酶结构与功能的生物信息学分析

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病毒学报 2021年第1期37卷 43-51页

作者：杜倩倩张智慧廉政张庆媛薛向阳张丽芳蒋朋飞温州医科大学基础医学院微生物学与免疫学教研室分子病毒与免疫研究所温州325035 温州医科大学病毒研究院温州325035

2019年12月,由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)在中国武汉暴发。SARS-CoV-2的基因组编码2种病毒蛋白酶,即木瓜样蛋白酶(Papain-like protease,PLpro)和3C样蛋白酶(3C-like protease)。其中PLpro是SARS-CoV-2复制酶复合体(RC)形成的重要调节蛋白分子,对于病毒基因组转录和复制至关重要。因此,将SARS-CoV-2 PLpro作为药物的靶点对COVID-19的治疗具有积极意义。本研究应用生物信息学工具分析新型冠状病毒的木瓜样蛋白酶的结构和功能,首先利用BLAST和BioEdit获取SARS-CoV-2 PLpro蛋白酶(SC2-PLpro)及其同源蛋白的氨基酸序列,并利用BLAST和MEGA 6.0进行同源性分析。之后,利用ProParam和Proscale分别对SC2-PLpro蛋白酶的理化性质、亲水性和疏水性进行分析。然后,通过SOMPA、ScanProsite和InterPro分别预测SC2-PLpro蛋白酶的二级结构和功能区域,进一步利用SignalP 4.0和TMHMM对SC2-PLpro蛋白酶的信号肽和跨膜区进行分析。最后,通过SWISS-MODEL对SARS-CoV-2 PLpro蛋白酶进行三级结构同源建模。结果显示,对SARS-CoV-2 PLpro蛋白酶与已报道的PLpro蛋白酶进行多序列比对后,发现SARS-CoV-2 nsp3的746~1063段氨基酸与多种冠状病毒PLpro蛋白酶氨基酸序列高度相似。同时,同源性分析发现SARS-CoV-2与蝙蝠冠状病毒的PLpro蛋白酶具有同源性,其中与QHR63299、AVP78030相似性最高。对SC2-PLpro进行理化性质预测结果显示,其由318个氨基酸所组成,为稳定亲水性蛋白。二级结构预测结果显示SC2-PLpro主要含有α-螺旋、延伸链、β-转角、无规卷曲,四种结构贯穿整条氨基酸链。进一步进行功能分析,发现其具有完整的催化三联体、锌结合域、泛素样N末端结构域,故推测该蛋白具有去泛素化的功能。然后,信号肽假说和跨膜结构域分析结果表明,SC2-PLpro既不是分泌蛋白,也不属于跨膜蛋白。本研究提示,生物信息学分析SC2-PLpro为稳定性亲水蛋白,属于非跨膜蛋白,比较保守,具有去泛素化的功能,利用此功能可以进一步规避宿主的固有免疫反应。通过制备PLpro蛋白酶小分子抑制剂,可能有助于治疗新型冠状病毒肺炎。

关键词：新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 木瓜样蛋白酶(PLpro蛋白酶) 结构功能生物信息学新型冠状病毒肺炎(COVID-19)

HPV16 L1在整合型重组毕赤酵母中的表达及病毒样颗粒的纯化

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中国人兽共患病学报 2014年第5期30卷 479-483页

作者：田晓娟冯娟张丽芳李文姝薛向阳温州医科大学分子病毒与免疫研究所/微生物学与免疫学教研室温州325035 湖北省黄石市爱康医院黄石435001

目的构建可稳定表达HPV16L1的整合型重组毕赤酵母,并纯化自主组装成的HPV16L1病毒样颗粒(VLPs)。方法根据酵母密码子偏爱性优化HPV16L1基因并克隆到pPIC3.5K表达载体,构建pPIC3.5K/HPV16L1重组质粒;重组质粒经Bgl II酶切线性化后,电转化... 详细信息

目的构建可稳定表达HPV16L1的整合型重组毕赤酵母,并纯化自主组装成的HPV16L1病毒样颗粒(VLPs)。方法根据酵母密码子偏爱性优化HPV16L1基因并克隆到pPIC3.5K表达载体,构建pPIC3.5K/HPV16L1重组质粒;重组质粒经Bgl II酶切线性化后,电转化至GS115菌株中,筛选HPV16L1重组毕赤酵母。阳性整合菌株甲醇诱导后,以HPV16L1单克隆抗体检测目的蛋白表达;采用肝素亲和层析法纯化HPV16L1VLPs并进行透射电镜观察。结果PCR、酶切和测序分析表明成功构建了pPIC3.5K/HPV16L1重组质粒。成功构建的HPV16L1重组毕赤酵母甲醇诱导后,Western blot证实重组酵母菌裂解产物存在HPV16L1目的蛋白。肝素亲和纯化后,透射电镜观察到了直径大约55nm的VLPs,其形态与HPV16天然病毒颗粒相似。结论利用整合型重组毕赤酵母表达系统成功表达了HPV16L1蛋白,并用肝素亲和纯化可快速获得结构完整的HPV16L1VLPs,为HPV16预防性疫苗的研制奠定基础。

关键词：人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1 毕赤酵母表达系统病毒样颗粒

EB病毒潜伏膜蛋白2B表位特异性兔血清抗体的制备和鉴定

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中国病原生物学杂志 2016年第10期11卷 871-875,880页

作者：张婵琼宋易玲岑丹维蔡一奇叶晓鲜毛珊珊蒋朋飞李文姝张丽芳温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室浙江温州325035 温州医科大学附属第一医院胃肠外科浙江温州325015

目的制备EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)串联B表位特异的兔血清多克隆抗体。方法利用分子克隆技术,将已鉴定的EBV LMP2蛋白的3个B细胞表位,即RIEDPPFNSLL,TLNLT和KSLSSTEFIPN,以柔性肽(GS)加以串联连接,经原核密码子优化后全基因合成,并... 详细信息

目的制备EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)串联B表位特异的兔血清多克隆抗体。方法利用分子克隆技术,将已鉴定的EBV LMP2蛋白的3个B细胞表位,即RIEDPPFNSLL,TLNLT和KSLSSTEFIPN,以柔性肽(GS)加以串联连接,经原核密码子优化后全基因合成,并经BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆至pET32a(+)载体,测序鉴定正确的重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),用异丙基硫代-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,对表达蛋白进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。用镍螯合亲和层析柱(Ni-NTA Agarose)纯化表达产物,与佐剂乳化后皮下多点注射日本大耳白兔,隔周免疫1次,共3次。分别于免疫的0、2、4、6、8周取血,采用ELISA方法检测IgG抗体水平,采用Western blot和细胞免疫荧光法检测兔血清抗体的免疫反应性和结合特异性。结果 EBV LMP2B表位重组蛋白可通过原核表达系统进行表达,纯化的表达蛋白免疫兔可产生特异性IgG抗体,效价达1∶30 000。经Western blot法和细胞免疫荧光法鉴定,制备的兔血清抗体可识别LMP2重组蛋白和LMP2天然蛋白。结论成功获得了EBV LMP2串联B表位重组蛋白,制备的兔多克隆血清抗体效价高,特异性强,为LMP2的生物学和免疫学研究奠定了基础。

关键词： EB病毒潜伏膜蛋白2 原核表达抗体制备