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牡蛎疱疹病毒结构蛋白真核表达系统构建及多聚化特性

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水产学报 2024年第5期48卷 65-74页

作者：曹书华魏茂乐李永仁黄博闻辛鲁生白昌明王崇明天津农学院水产学院天津市水产生态及养殖重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室

牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在全球范围内导致牡蛎、扇贝与蚶类的大规模死亡，成为双壳贝类养殖产业的重要威胁。为了解OsHV-1的结构与致病机制。本研究利用人胚胎肾细胞(HEK293t)，构建OsHV-1主要核衣壳蛋白(ORF104和ORF33)的真核表达系统，... 详细信息

牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在全球范围内导致牡蛎、扇贝与蚶类的大规模死亡，成为双壳贝类养殖产业的重要威胁。为了解OsHV-1的结构与致病机制。本研究利用人胚胎肾细胞(HEK293t)，构建OsHV-1主要核衣壳蛋白(ORF104和ORF33)的真核表达系统，并对ORF104和ORF33潜在相互作用进行分析。实验首先通过特异性PCR扩增技术得到orf 104和orf 33的基因序列，根据其编码蛋白的理化性质、跨膜区与三维结构等生物信息学分析结果，选择pCDNA3.1(+)构建两种基因的重组表达质粒。重组质粒经大肠杆菌扩增、提取后，利用转染试剂Lipo8000?将pCDNA3.1(+)-orf 104与pCDNA3.1(+)-orf 33分别单独或共转染至HEK293t。然后，将转染后的细胞培养18 h后裂解收集蛋白。最后利用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)与负染电镜检测两种目的蛋白的表达情况。结果显示，实验成功构建了OsHV-1衣壳蛋白ORF104和ORF33的重组表达质粒载体，通过真核细胞表达得到大小约为135与35 ku的目的蛋白。研究表明，表达质粒可在真核表达系统中实现蛋白单独转染与共转染，共转染蛋白间可能存在相互作用的趋势并形成多聚体，其中，ORF33自身即可形成分子质量不同的多聚体。本研究首次利用真核表达系统开展OsHV-1关键结构蛋白的表达，为进一步开展该病毒结构蛋白功能与互作，以及病毒入侵机制研究奠定基础。

关键词：牡蛎疱疹病毒核衣壳蛋白真核表达系统蛋白多聚化

凡纳滨对虾白便综合征发生与环境因子、机体免疫酶活性和微生物的相关性

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水产学报 2024年第1期48卷 145-157页

作者：王印庚于永翔蔡欣欣张正王春元廖梅杰李彬荣小军朱洪洋戴岩中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室连云港海洋源水产开发有限公司

为系统解析凡纳滨对虾白便综合征(white feces syndrome,WFS)的发生与环境因子、微生物因子、宿主免疫力和水体微生物群落组成的关系。实验利用水体理化因子、可培养细菌、对虾机体免疫酶活性以及高通量测序等检测技术对健康与患WFS的... 详细信息

为系统解析凡纳滨对虾白便综合征(white feces syndrome,WFS)的发生与环境因子、微生物因子、宿主免疫力和水体微生物群落组成的关系。实验利用水体理化因子、可培养细菌、对虾机体免疫酶活性以及高通量测序等检测技术对健康与患WFS的池塘养殖凡纳滨对虾进行比较分析。结果显示，与健康组相比，患病池塘的水温、溶解氧(DO)、pH、盐度等水质理化因子波动趋势相似，波动范围分别为26.1～29.0℃、4.26～6.08 mg/L、8.39～8.73和40～49，患病组DO和盐度比健康组高；健康组对虾肝胰腺内可培养细菌和弧菌含量为1.19×105～7.70×105和8.8×103～1.96×104CFU/g，弧菌占比为2%～16%，患病组对虾肝胰腺内可培养细菌和弧菌含量在3.80×105～2.51×106和2.02×105～1.49×106CFU/g范围内，比健康组高15～113倍，弧菌占比在55%～70%。碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)和酚氧化酶(PO)活性在健康组内为1.21～5.64、9.17～15.25、 3.56～7.43、 4.83～6.70及3.10～4.55U/mg，在患病组内为2.12～5.39、 19.22～26.96、19.73～26.85、3.00～4.14及7.76～9.21 U/mg。比较分析表明，WFS的发生与可培养细菌含量、弧菌占比、ACP、LZM、PO的相关性较强。高通量测序分析表明，患病组水体菌群结构的Ace和Chao指数呈一定程度下降趋势，PCoA指数偏离度较高，放线菌门、变形菌门相对丰度降低，拟杆菌门、蓝藻门相对丰度显著升高；RDA关联分析表明，盐度、溶解氧、虾体细菌、虾体弧菌、水体细菌是影响患病对虾水体菌群结构组成的重要因子。相关研究结果为解析养殖生产中对虾WFS发生机制提供数据支撑，并为WFS的临床防控奠定理论基础。

关键词：凡纳滨对虾白便综合征水质理化因子可培养细菌机体免疫力菌群结构

星康吉鳗(Conger myriaster) LH基因的克隆、序列特征分析及原核表达

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渔业科学进展 2024年

作者：陈彦史宝王成刚薄万军晏科文陶美君赵新宇马晓东中国水产科学研究院黄海水产研究所海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室农业农村部海洋渔业与可持续发展重点实验室青岛海洋科技中心海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室大连海洋大学水产与生命学院海阳市黄海水产有限公司

促黄体生成素(luteinizing hormone， LH)在鱼类配子成熟、排卵和类固醇激素合成方面发挥重要作用。通过同源克隆获得星康吉鳗(Conger myriaster) LH基因CDS区序列，利用生物信息学软件分析该基因编码蛋白的结构与特征，并成功构建原核... 详细信息

促黄体生成素(luteinizing hormone， LH)在鱼类配子成熟、排卵和类固醇激素合成方面发挥重要作用。通过同源克隆获得星康吉鳗(Conger myriaster) LH基因CDS区序列，利用生物信息学软件分析该基因编码蛋白的结构与特征，并成功构建原核表达重组质粒对LH蛋白进行表达。克隆获得LH基因CDS区为423 bp，编码140个氨基酸。分析LH蛋白理化性质可知，其相对分子质量为15.56 kDa，理论等电点为5.85；经亲疏水性分析发现，LH蛋白为亲水性蛋白；对信号肽和跨膜区分析结果显示，其前1～22个氨基酸为信号肽，无跨膜区；经结构域分析，其存在保守性较强的GHB结构域(由27～132位的105个氨基酸组成)；亚细胞定位分析表明，LH蛋白主要定位于细胞核；对糖基化位点及磷酸化位点分析发现，其存在1个N-糖基化位点和25个O-糖基化位点，共含有17个潜在的磷酸化位点；LH蛋白二级结构主要含有α-螺旋(13.6%)、β-折叠(25%)和无规则卷曲(61.4%)；通过三级结构分析发现，其与日本鳗鲡(Anguilla japonica) LH蛋白三级结构较为相似，与人(Homo sapiens) LH蛋白的三级结构存在一定差异。多序列比对及系统发育树分析结果显示，LH与欧洲鳗鲡(A. anguilla)、花鳗鲡(A. marmorata)、日本鳗鲡进化关系较近，同源性分别为92.14%、91.43%、90.71%。构建的重组质粒pET-28a-LH在Rosetta (DE3)感受态细胞中成功表达，其表达的可溶性LH重组融合蛋白条带在SDS-PAGE电泳检测及Western Blot结果中约为26.5 kDa，与预期表达的分子量相符。该研究为揭示星康吉鳗LH基因的分子特征及蛋白功能奠定了基础，为后续星康吉鳗人工繁育技术的优化提供了理论参考。

关键词：星康吉鳗促黄体生成素基因基因克隆序列特征分析原核表达

半滑舌鳎生物钟相关基因克隆及在卵巢发育成熟过程中表达特征分析

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渔业科学进展 2024年第3期45卷 101-116页

作者：晏科文马晓东史宝程汉良王重女赵新宇江苏海洋大学海洋科学与水产学院江苏连云港222005 中国水产科学研究院黄海水产研究所、海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室、青岛海洋科技中心海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室山东青岛266071

为阐明生物钟相关基因在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵巢成熟过程中的作用及机制,采集性成熟半滑舌鳎不同发育期的卵巢组织提取总RNA,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对5个核心生物钟基因Clock1a、Bmal1a、Cry1a、Cry2和Per... 详细信息

为阐明生物钟相关基因在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵巢成熟过程中的作用及机制,采集性成熟半滑舌鳎不同发育期的卵巢组织提取总RNA,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对5个核心生物钟基因Clock1a、Bmal1a、Cry1a、Cry2和Per2的编码区(CDS)序列进行克隆和序列分析。结果显示,Clock1a的CDS序列编码712个氨基酸,序列中有功能性结构域PASD1和PAS11。Bmal1a的CDS序列编码626个氨基酸,序列中有功能性结构域PASD3和PAS11。Cry1a和Cry2的CDS序列分别编码631个、669个氨基酸,序列中均有功能性结构域FAD7。Per2的CDS序列编码1415个氨基酸,序列中有功能性结构域PeriodC和PAS11。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析5个生物钟基因mRNA在性成熟半滑舌鳎卵巢不同发育期的表达特性,发现5个生物钟基因存在性腺发育周年表达规律,且在卵巢Ⅱ期和Ⅲ期相对高表达(P生物钟基因对半滑舌鳎的卵巢发育成熟起到重要的调节作用。研究结果为进一步探究生物钟基因调控半滑舌鳎卵巢发育成熟的机制提供了重要参考,为提高半滑舌鳎的繁育效率提供了理论基础。

关键词：生物钟基因半滑舌鳎卵巢周年表达规律

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鱼类神经激肽B生理功能及其分子机制

渔业科学进展 2024年第5期45卷 1-12页

作者：王滨田振方郭慧英徐永江崔爱君姜燕海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室、中国水产科学研究院黄海水产研究所山东青岛266071 青岛海洋科技中心海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室山东青岛266237 中国海洋大学水产学院山东青岛266003

神经激肽B(Neurokinin B,NKB)是由tac3基因编码的一种下丘脑神经肽,属于Tachykinin家族重要成员之一,主要在脑中高表达,但也表达于外周组织中,通过其受体NK3R介导参与了哺乳动物多种生理功能。目前,已在斑马鱼(Danio rerio)、草鱼(Cteno... 详细信息

神经激肽B(Neurokinin B,NKB)是由tac3基因编码的一种下丘脑神经肽,属于Tachykinin家族重要成员之一,主要在脑中高表达,但也表达于外周组织中,通过其受体NK3R介导参与了哺乳动物多种生理功能。目前,已在斑马鱼(Danio rerio)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)等硬骨鱼中鉴定出NKB系统,并且NKB能够参与调节鱼类生殖和摄食等重要生理活动。本文对既有硬骨鱼NKB系统研究进行简要总结,从NKB及其受体基因鉴定、组织分布、生理功能、信号转导机制等方面进行全面概括讨论,以增加对鱼类NKB系统的认识和了解,以期为后续研究提供参考。

关键词：鱼类神经激肽B 组织分布生殖信号转导

基于55K液相芯片的凡纳对虾生长和抗WSSV性状遗传参数估计

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渔业科学进展 2024年

作者：和怡婧刘绵宇栾生孔杰李旭鹏曹宝祥罗坤谭建曹家旺代平强光峰王照欣隋娟孟宪红海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心青岛海洋科技中心海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室邦普种业科技有限公司

本研究基于55K SNP液相芯片“黄海芯1号”分型信息估计了凡纳对虾(Penaeus vannamei)生长和白斑综合征病毒(WSSV)抗性的遗传参数，以期为育种芯片在凡纳对虾多性状复合新品种选育中的应用提供数据。对凡纳对虾59个家系，共计1 770尾个... 详细信息

本研究基于55K SNP液相芯片“黄海芯1号”分型信息估计了凡纳对虾(Penaeus vannamei)生长和白斑综合征病毒(WSSV)抗性的遗传参数，以期为育种芯片在凡纳对虾多性状复合新品种选育中的应用提供数据。对凡纳对虾59个家系，共计1 770尾个体进行WSSV感染测试；根据家系内个体抗WSSV存活时间均匀选取590尾个体，利用55K SNP液相芯片进行分型，复合系谱和基因型信息构建H矩阵及个体动物模型和父母本模型，基于H矩阵估计凡纳对虾感染WSSV后体长、个体抗WSSV存活时间和家系WSSV半致死存活率的遗传力和遗传相关。结果显示，凡纳对虾体长、个体抗WSSV存活时间遗传力分别为0.21±0.06、0.22±0.16，为中等遗传力水平，家系WSSV半致死存活率和0.16±0.06，为低等遗传力水平；经五折交叉验证，基于H矩阵的体长遗传力预测准确性较A矩阵提高18.12%，预测偏差无明显差别；抗WSSV存活时间遗传力预测准确性较A矩阵无明显差别，预测偏差较大；家系半致死存活率遗传力预测准确性较A矩阵降低29.07%，预测偏差较大。基于两性状动物模型，估计凡纳对虾体长与个体抗WSSV存活时间、家系WSSV半致死存活率遗传相关分别为0.13±0.20和0.30±0.22，与0无显著差异(P>0.05)；个体抗WSSV存活时间与家系WSSV半致死存活率的遗传相关为0.95±0.03，与1无显著差异(P>0.05)。研究显示，利用芯片开展凡纳对虾生长的遗传评估可有效提高评估的准确性；WSSV抗性性状的评估可能受分型个体选择等因素影响，预测准确性无明显提升；个体抗WSSV存活时间在准确性和预测偏差等方面均优于家系抗WSSV半致死存活率的评估结果。在抗WSSV存活时间和家系半致死存活率高度相关的情况下，可考虑将抗WSSV存活时间作为基因组选择的目标性状。

关键词：凡纳对虾遗传评估 ssGBLUP WSSV抗性生长

半滑舌鳎vstm2a基因的响应细菌感染的表达模式和功能的研究

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上海海洋大学学报 2024年

作者：林梦娇陈亚东刘洋王磊张天时史萌陈松林上海海洋大学水产与生命学院海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室(中国水产科学研究院黄海水产研究所) 青岛海洋科技中心海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室中国海洋大学海洋生命学院

为了探究半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)vstm2a基因响应细菌感染的表达特征和其蛋白功能。本研究采用实时荧光定量(RT-qPCR)检测哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染半滑舌鳎后免疫组织(鳃、肝脏、脾脏、肠道和肾脏)中vstm2a的相对表达特征；构建vstm2a基因原核表达重组质粒，获得重组蛋白，采用牛津杯法、细菌蛋白结合实验和siRNA沉默等，探究vstm2a蛋白在细菌入侵中的功能。结果显示：vstm2a蛋白具有跨膜结构域和Ig结构域，在细胞表面行使功能；相关免疫组织中的vstm2a基因的表达量在哈维氏弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌和无乳链球菌感染半滑舌鳎后6 h、48 h和72 h显著升高；vstm2a重组蛋白与细菌孵育后，经过低速离心与细菌共同沉淀；抑菌实验显示其显著抑制细菌的生长，并且siRNA降低vstm2a基因后，抑制了细胞因子IL-6和IL-10等基因的表达。本研究证明了vstm2a蛋白响应细菌入侵，可以识别和结合细菌，通过抑制细菌生长和激活促炎症细胞因子，对病原菌的侵染起到免疫防御作用，是一种重要的免疫蛋白。本研究有助于解析细菌粘附细胞或鱼体抵抗细菌入侵的机制，为未来的采用分子手段选育抗性品种提供一定的理论基础。

关键词：半滑舌鳎免疫 vstm2a 跨膜蛋白,细菌结合

组蛋白及变体在染色质重塑中的功能:以水生动物精子发生为例

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渔业科学进展 2024年第5期45卷 13-29页

作者：徐文腾孙雪雪广东海洋大学水产学院、广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室广东湛江524088 中国水产科学研究院黄海水产研究所、海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室、青岛海洋科技中心海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室山东青岛266071

两性生殖中,精子作为携带父本信息的载体,是物种延续的关键因素。精子发生经历精原细胞、初级和次级精母细胞、圆形精子、成熟精子阶段。在圆形精子形成成熟精子过程中,染色质进行重塑,细胞形态发生剧烈变化,其中,组蛋白修饰和组蛋白变... 详细信息

两性生殖中,精子作为携带父本信息的载体,是物种延续的关键因素。精子发生经历精原细胞、初级和次级精母细胞、圆形精子、成熟精子阶段。在圆形精子形成成熟精子过程中,染色质进行重塑,细胞形态发生剧烈变化,其中,组蛋白修饰和组蛋白变体在这些过程中发挥了重要作用:如甲基化主要与基因表达的激活或抑制有关;乙酰化激活转录活性并参与组蛋白沉积和DNA修复;磷酸化促进转录后修饰或参与DNA双链断裂修复;泛素化调节不同细胞途径中各式各样的蛋白质底物。组蛋白变体在调节染色体结构中发挥重要功能:如组蛋白H1变体在分化过程中具有抑制转录的作用;组蛋白H2A和H2B变体在精子染色质包装过程中发挥特有功能;H3.3是H3最重要的变体,在细胞周期的各时期都有表达;组蛋白H4则是进化最慢的组蛋白之一,目前还没有发现其组蛋白变体。本文围绕组蛋白翻译后修饰,梳理了甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等方面的最新进展和组蛋白变体在染色质重塑过程中的功能研究进展,随后针对各类组蛋白变体及其功能进行了总结,最后以半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)为例简要介绍这些研究对水生动物精子发生的启示。

关键词：组蛋白翻译后修饰染色质重塑精子发生

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绿鳍马面鲀中轴骨骼早期发育规律

动物学杂志 2024年第4期59卷 597-606页

作者：朱金超边力李凤辉吴丹陈莹秦搏杨立国吴艳庆英娜陈四清中国水产科学研究院黄海水产研究所海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室青岛266071 青岛海洋科技中心海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室青岛266237 上海海洋大学水产与生命学院上海201306 中国水产科学研究院东海水产研究所上海201306

运用阿新利蓝-茜素红双染色技术研究绿鳍马面鲀(Thamnaconus septentrionalis)初孵仔鱼和1~60 dah(孵出后日龄)仔、稚和早期幼鱼中轴骨骼(头骨和脊柱)的发育规律。结果表明:绿鳍马面鲀初孵仔鱼头部无明显骨骼元件,3 dah脑颅软骨元件有... 详细信息

运用阿新利蓝-茜素红双染色技术研究绿鳍马面鲀(Thamnaconus septentrionalis)初孵仔鱼和1~60 dah(孵出后日龄)仔、稚和早期幼鱼中轴骨骼(头骨和脊柱)的发育规律。结果表明:绿鳍马面鲀初孵仔鱼头部无明显骨骼元件,3 dah脑颅软骨元件有前索软骨、侧索软骨、筛板和耳软骨环,咽颅软骨元件有米克尔氏软骨、腭方软骨、角鳃软骨和基鳃软骨;8 dah脑颅耳软骨环愈合成圆,咽颅上颌骨两侧末端与腭方软骨相连,角鳃软骨从前往后逐渐变短;15 dah脑颅耳软骨环凸出,咽颅齿骨和续骨出现,鳃丝密集分布,头部骨骼框架趋于稳定;18 dah脑颅嗅软骨环出现,咽颅米克尔氏软骨发生退化,下舌骨和上舌骨出现,上下颌前端出现锥形齿;20 dah脑颅出现额骨和筛骨,咽颅上下颌下移,前鳃盖骨和前颌骨出现并硬骨化;22 dah咽颅前鳃盖骨向下延伸出骨片,7对鳃条骨硬骨化;24 dah顶骨、副蝶骨、下鳃盖骨、主鳃盖骨和角舌骨出现并硬骨化;26 dah头部布满硬骨化的锥形小鳞;33 dah脑颅额骨、筛骨和缘带完全硬骨化,吻端变长,咽颅下鳃盖骨和主鳃盖骨完全硬骨化,锥形齿变门齿状;50 dah头部除鳃丝其余骨骼均完全硬骨化,可认为头部骨骼硬骨化完成。绿鳍马面鲀的脊柱14 dah前透明无色;18 dah尾端的髓弓和脉弓分化出现;25 dah椎体分节完成;28 dah椎体硬骨化完成;30 dah部分椎体的后关节突与髓弓相愈合;45 dah各椎体间间距缩短,脊柱完全硬骨化。研究理清了绿鳍马面鲀早期发育过程中轴骨骼元件的发育时序和骨化特征,初步阐释了其中轴骨骼的生长发育规律和特殊性,可为此物种苗种培育提供参考。

关键词：绿鳍马面鲀阿新利蓝-茜素红染色仔鱼稚鱼中轴骨骼

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