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ABO基因c.398T>C新变异导致Bweak表型的分子特性研究

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中华医学遗传学杂志 2023年第1期40卷 110-113页

作者：应燕玲洪小珍张晶晶马开荣刘瑛许先国何吉朱发明浙江省血液中心浙江省血液安全研究重点实验室杭州310052

目的探讨1例Bweak亚型个体的分子机制。方法选取2016年12月5日于浙江省血液中心献血的1例受试者为研究对象。利用血清学方法鉴定受试者的ABO表型,用体外酶活性试验测定其血清中B糖基转移酶(GTB)的活性。用PCR扩增ABO基因第5~7外显子及... 详细信息

目的探讨1例Bweak亚型个体的分子机制。方法选取2016年12月5日于浙江省血液中心献血的1例受试者为研究对象。利用血清学方法鉴定受试者的ABO表型,用体外酶活性试验测定其血清中B糖基转移酶(GTB)的活性。用PCR扩增ABO基因第5~7外显子及侧翼序列并确定其基因型,采用T-A克隆技术分离单倍体并进行测序验证。用ProtParam和PSIPRED软件分析蛋白的一级理化性质和二级结构。用PolyPhen-2、SIFT、PROVEAN三种软件分析错义变异对蛋白的作用效应。结果受试者血清学检测为Bweak亚型,血清中存在抗B抗体。体外酶活性试验显示其GTB活性显著降低。单倍体克隆测序分析发现B等位基因上存在c.398T>C错义变异,为一个新的B等位基因,可导致GTB第133位的苯丙氨酸替换为丝氨酸(p.Phe133Ser)。生物信息学分析提示上述替换对蛋白的一级和二级结构影响不明显,但变异蛋白的热力学能量增加6.07 kcal/mol,严重降低了热稳定性,生物信息学预测该变异对蛋白功能有害。结论新等位基因ABO*B.01-398C是引起Bweak亚型抗原弱表达的机制,生物信息学分析有助于评估其结构和功能的变化。

关键词： Bweak变异型 B糖基转移酶氨基酸置换生物信息学

用体外表达的血小板膜蛋白GPⅢa偶联Luminex微球检测HPA-1a抗体

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中华医学遗传学杂志 2017年第1期34卷 40-44页

作者：陶苏丹刘瑛和艳敏应燕玲何吉朱发明浙江省血液中心卫生部血液安全研究重点实验室浙江省血液安全研究重点实验室杭州310006

目的拟利用体外克隆表达的GPⅢa蛋白作为HPA—1a抗原与LuminexxMAP微球相连，建立和评估用Luminex微球技术检测血清中抗HPA—1a的效果。方法扩增并克隆GPⅢa蛋白的编码基因ITGB3至真核表达载体，转染中国仓鼠卵巢癌细胞株。利用G418筛... 详细信息

目的拟利用体外克隆表达的GPⅢa蛋白作为HPA—1a抗原与LuminexxMAP微球相连，建立和评估用Luminex微球技术检测血清中抗HPA—1a的效果。方法扩增并克隆GPⅢa蛋白的编码基因ITGB3至真核表达载体，转染中国仓鼠卵巢癌细胞株。利用G418筛选稳定表达细胞株，体外获取并鉴定相应的特异性膜糖蛋白GPⅢa。将重组蛋白通过表面游离氨基和Luminex xMAP微球表面激活的羧基相偶联，再利用偶联后的微球与待测血清反应。利用PE-抗人IgG进行显色，在Luminex-100仪上读取数据并判断结果。结果ITGB3基因测序为HPA-1aa，将克隆后的GPⅢa重组蛋白偶联Luminex xMAP微球，Luminex微球法检测HPA-1a抗体的灵敏度为滴度1／32（抗体浓度3．125U／mL）。微球技术能特异性鉴别出待测样本的HPA—1a抗体，与MAIPA结果一致，而且与HLA抗体、ABO抗体以及其他HPA血小板系统抗体（HPA-3a、HPA_5b）均不发生交叉反应，说明建用立的Luminex微球技术来检测血小板抗体是可行的。结论成功获取了重组表达的血小板膜蛋白GPⅢ3，并初步建立了Luminex微球检测HPA-1a抗体方法。

关键词： Luminex微球技术 GPⅢa体外重组表达抗HPA—1a

人血小板膜糖蛋白ITGB3基因终止突变C．1476G〉A的体外表达研究

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中华医学遗传学杂志 2016年第1期33卷 17-21页

作者：刘瑛许先国陈舒洪小珍陶苏丹何吉朱发明吕杭军浙江省血液中心输血研究所、卫生部血液安全研究重点实验室浙江省血液安全研究重点实验室杭州310006

目的对ITGB3基因新的终止突变c．1476G〉A进行体外表达研究，以阐明其功能。方法应用体外定点诱变技术构建突变型ITGB3e．1476G〉AcDNA的真核表达载体，转化感受态细胞，提取质粒后测序验证。采用非脂质体介导重组质粒转染中国仓鼠卵巢... 详细信息

目的对ITGB3基因新的终止突变c．1476G〉A进行体外表达研究，以阐明其功能。方法应用体外定点诱变技术构建突变型ITGB3e．1476G〉AcDNA的真核表达载体，转化感受态细胞，提取质粒后测序验证。采用非脂质体介导重组质粒转染中国仓鼠卵巢癌细胞株（Chinesehamsterovariancancer，CHO）细胞，经G418筛选获取稳定表达细胞株。采用实时荧光定量PCR、Western印迹和流式细胞术分别检测CHO稳定表达株ITGB3基因的mRNA表达和血小板膜糖蛋白llIa（glycoproteinIIIa，GPⅢa）糖蛋白水平。结果成功构建野生型和突变型ITGB3cDNA的真核表达载体，转染筛选后分别获得了稳定表达的CHO细胞株。突变型细胞株中CD61抗原表达量仅为野生型的37％，而ITGB3mRNA转录水平为野生型的6％。Western印迹结果显示，野生型细胞株稳定表达完整的GPⅢa蛋白，而突变型CHO细胞株无完整的GPⅢa蛋白表达。结论ITGB3c．1476G〉A终止突变可导致ITGB3基因的转录水平降低，影响GPⅢa蛋白合成及CD61抗原的表达水平。

关键词： ITGB3基因血小板膜糖蛋白HIa 终止突变体外表达

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PIPk血型系统中一例罕见P表型的分子遗传机制研究

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中华医学遗传学杂志 2015年第2期32卷 250-253页

作者：马开荣蓝小飞许先国洪小珍陈舒刘瑛应燕玲何吉朱发明吕杭军浙江省血液中心卫生部血液安全研究重点实验室杭州310006

目的分析P1Pk血型系统中1例罕见P表型的分子遗传机制。方法采用血清学方法鉴定先证者及其5个容系成员红细胞血型抗原和血清中的抗体。PCR扩增编码P1Pk的a1，4半乳糖基转移酶基因（a1，4-galactosyltransferase，A4GALD编码区及侧翼非翻... 详细信息

目的分析P1Pk血型系统中1例罕见P表型的分子遗传机制。方法采用血清学方法鉴定先证者及其5个容系成员红细胞血型抗原和血清中的抗体。PCR扩增编码P1Pk的a1，4半乳糖基转移酶基因（a1，4-galactosyltransferase，A4GALD编码区及侧翼非翻译区后进行测序分析，并通过克隆测序法鉴定先证者父母A4GALT基因单体型。结果血清学实验证实先证者为罕见的P表型，其血清中含有抗-Tja抗体，而家系成员为常见的P2表型。DNA测序显示，先证者的A4GALT基因编码区存在1026-1029insC纯合突变，该处C碱基的插入可引起多肽链的移码突变，导致变异型a1，4半乳糖基转移酶比野生型多92个氨基酸残基；而其他家系成员在A4GALT基因该位点均为杂合性插入或野生型。结论在中国人群中发现因A4GALT基因1026-1029insC导致的P表型，该表型携带有抗-Tja抗体。

关键词： P1Pk血型系统 p表型 al 4半乳糖基转移酶 A4GALT基因

HLA-DPB1基因第2和第3外显子测序方法的建立及其多态性分析

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中华医学遗传学杂志 2015年第1期32卷 40-43页

作者：和艳敏陶苏丹章伟王炜何吉朱发明吕杭军浙江省血液中心卫生部血液安全研究重点实验室杭州310006

目的建立HLA-DPB1基因第2～3外显子测序方法，并分析其多态性。方法根据HLA-DPB1基因序列，设计位点特异性引物扩增242名浙江汉族人群HLA-DPB1第2～3外显子序列，PCR扩增产物经双酶切后对第2和3外显子进行双向测序分析，采用Assign3．5... 详细信息

目的建立HLA-DPB1基因第2～3外显子测序方法，并分析其多态性。方法根据HLA-DPB1基因序列，设计位点特异性引物扩增242名浙江汉族人群HLA-DPB1第2～3外显子序列，PCR扩增产物经双酶切后对第2和3外显子进行双向测序分析，采用Assign3．5＋SBT分析软件判读HLA-DPB1等位基因型。结果PCR扩增获得特异性的单一目的片段，其产物经直接测序后得到清晰的序列图。242名浙江汉族人群中共检测到18个HLADPB1等位基因，频率超过0．05的等位基因为DPB1＊05：01：01／135：0l（0．4112）、DPB1＊02：01：02（0．1901）、DPB1＊04：01：01（0．1136）以及DPB1＊02：02（0．0620），并确认1个新等位基因DPB1＊168：01。在第3外显子中发现9个多态性位点，其中517A〉T为本实验新检出的1个多态性位点。结论本实验建立的HLA～DPB1第2～3外显子测序方法是可行的，HLA-DPB1第3外显子存在一定多态性。

关键词： HLA-DPB1基因第3外显子多态性造血干细胞移植

β-1,3-N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因433C＞T突变导致罕见Pk表型

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中华医学遗传学杂志 2015年第3期32卷 381-384页

作者：蓝小飞洪小珍许先国陈舒马开荣刘瑛何吉朱发明吕杭军浙江省血液中心卫生部血液安全研究重点实验室杭州310006

目的探讨P1Pk血型系统中1例罕见Pk表型的血清学特征和分子机制.方法应用血清学技术鉴定先证者血型,应用聚合酶链反应测序技术对Pk表型相关的β-1,3-N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因（B3GALANT1）编码区及侧翼内含子区进行序列分析.结果 ... 详细信息

目的探讨P1Pk血型系统中1例罕见Pk表型的血清学特征和分子机制.方法应用血清学技术鉴定先证者血型,应用聚合酶链反应测序技术对Pk表型相关的β-1,3-N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因（B3GALANT1）编码区及侧翼内含子区进行序列分析.结果先证者确认为罕见的Pk表型,血清中含有抗-P抗体,其女儿、丈夫为P2表型.测序结果显示：其丈夫、2个随机样本的B3GALANT1基因序列与对照参考序列（GenBank AB050855）完全一致,而先证者的B3GALANT1基因第433位存在C＞T纯合突变,这导致在第145位氨基酸处提前形成终止密码而表达不成熟蛋白,从而可能降低或抑制1,3-N-乙酰氨基半乳糖转移酶的活性.其女儿B3GALANT1基因第433位为C/T杂合.结论由B3GALANT1基因433位核苷酸C＞T突变导致的Pk表型在中国人群中尚未见报道.

关键词： P1Pk血型系统 Pk表型 β-1,3-N-乙酰氨基半乳糖转移酶分子机制

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一例白血病患者HLA位点杂合性丢失的分析

中华医学遗传学杂志 2022年第3期39卷 338-342页

作者：王炜王芳董丽娜陈男英何亿镇章伟何吉朱发明浙江省血液中心杭州310052 浙江省血液安全研究重点实验室杭州310052

目的分析1例白血病患者人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)杂合性丢失情况。方法采用聚合酶链反应序列特异性寡核苷酸探针法和聚合酶链反应测序方法对患者移植后外周血、头发毛囊、口腔黏膜拭子及其父母外周血进行HLA分型。采... 详细信息

目的分析1例白血病患者人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)杂合性丢失情况。方法采用聚合酶链反应序列特异性寡核苷酸探针法和聚合酶链反应测序方法对患者移植后外周血、头发毛囊、口腔黏膜拭子及其父母外周血进行HLA分型。采用23位点短串联重复序列(short tandem repeat,STR)测定试剂盒和本实验室建立的HLA区域内的6个STR位点方法对患者移植后的外周血、口腔黏膜拭子及其父母外周血进行STR位点检测。结果患者经父亲源单倍型造血干细胞移植后,外周血标本HLA基因型与父亲完全一致。患者头发毛囊标本HLA结果为HLA-A*02:01,24:02,C*03:03,03:04,B*13:01,15:01,DRB1*08:03,12:02,DQB1*03:01,06:01。口腔黏膜拭子为HLA纯合子,只存在父亲单倍型HLA-A*24:02-C*03:03-B*15:01-DRB1*08:03-DQB1*06:01,丢失了母亲单倍型HLA-A*02:01-C*03:04-B*13:01-DRB1*12:02-DQB1*03:01。患者移植后外周血23个STR位点与父亲完全一致。口腔黏膜拭子23位点短串联重复位点无丢失,但6号染色体上HLA区域的6个STR位点至少有4个发生了丢失。结论发现1例单倍型造血干细胞移植白血病患者的口腔黏膜拭子发生HLA杂合性丢失。

关键词： HLA杂合性丢失白血病患者 HLA基因分型造血干细胞移植

外周血非动员干细胞体外培养分析红系特异性表达血型基因

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中华医学遗传学杂志 2014年第4期31卷 487-490页

作者：许先国刘瑛应燕玲洪小珍马开荣蓝小飞陈舒何吉朱发明吕杭军浙江省血液中心、卫生部血液安全研究重点实验室杭州310006

目的通过外周血非动员干细胞液培养获得红系有核细胞，以分析红系特异性表达的血型基因。方法外周血经离心分离和免疫磁珠分选获得CD34^＋造血干细胞，体外液体定向培养生成红系有核细胞。分别取不同培养期的细胞进行免疫荧光和染色分... 详细信息

目的通过外周血非动员干细胞液培养获得红系有核细胞，以分析红系特异性表达的血型基因。方法外周血经离心分离和免疫磁珠分选获得CD34^＋造血干细胞，体外液体定向培养生成红系有核细胞。分别取不同培养期的细胞进行免疫荧光和染色分析，并取培养＋12d的细胞进行Rh和ABO血型基因RNA转录分析。结果从约50mL外周血中分离到CD34^＋细胞（3．19±0．13）×10^4个（总回收率为67．3％±2．7％）。经红系定向培养，大约＋9d时细胞数爆增至平台期（7．57±0．78）×10^6个，扩增约237．1±15．5倍。在培养过程中，标志细胞干性的CD34抗原逐渐下降，红系特异性标志CD235a和CD240D逐渐上升。培养＋12d细胞提取的RNA，均能扩增出RHD／CE和ABO基因，DNA序列分析表明其基因型符合血清学表型。结论建立了一种源于外周血非动员干细胞体外培养分析红系血型基因表达情况的方法，该技术可用于各种红系特异性表达基因的研究。

关键词：血型基因表达细胞培养红细胞

用生物素标记探针和链亲和素磁珠分离HLA-A、-B、-C位点单体型

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中华医学遗传学杂志 2014年第3期31卷 383-387页

作者：陶苏丹和艳敏章伟王炜何吉朱发明吕杭军浙江省血液中心卫生部血液安全研究重点实验室杭州310006

目的建立生物素标记探针和链亲和素磁珠分离人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen，HLA）-A、-B、-C单体型的技术，以解决HLA分型过程中部分模棱两可的结果。方法根据IMGT／HLA数据库中HLA等位基因的序列信息，设计5’端生物素标记探... 详细信息

目的建立生物素标记探针和链亲和素磁珠分离人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen，HLA）-A、-B、-C单体型的技术，以解决HLA分型过程中部分模棱两可的结果。方法根据IMGT／HLA数据库中HLA等位基因的序列信息，设计5’端生物素标记探针。将探针与104份标本基因组DNA混合杂交，然后加入链亲和素磁珠孵育，形成链亲和素磁珠一生物素探针一单链DNA复合物，通过洗涤和解析从而实施有效的分离。对分离出的单体型基因组DNA进行HLA-A、-B或-C位点扩增和测序分析。结果设计的12个HLA-A、19个HLA-B、13个HLA-C位点探针中，经测序证实分别有9个、9个、5个探针成功分离了单链DNA标本。结论建立的探针和磁珠分离HLAA、-B、-C单体型技术具有可行性，可以解决HLA测序分型中部分模棱两可结果，提高分型的准确性。

关键词：人类白细胞抗原生物素探针链亲和素磁珠单体型分离