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大口黑鲈弹状病毒qPCR检测方法的建立与临床应用

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病毒学报 2024年第5期 1033-1046页

作者：陈雪兰蔺凌云杨娜王亿文姚嘉赟沈锦玉潘晓艺浙江省淡水水产研究所农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室浙江省鱼类健康与营养重点实验室上海海洋大学水产与生命学院

大口黑鲈弹状病毒病是引起大口黑鲈幼苗暴发性死亡最严重的疾病，为满足大口黑鲈幼苗弹状病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus, MSRV）的快速检测，建立大口黑鲈弹状病毒SYBR Green qPCR检测方法。根据大口黑鲈弹状病毒核蛋白基因... 详细信息

大口黑鲈弹状病毒病是引起大口黑鲈幼苗暴发性死亡最严重的疾病，为满足大口黑鲈幼苗弹状病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus, MSRV）的快速检测，建立大口黑鲈弹状病毒SYBR Green qPCR检测方法。根据大口黑鲈弹状病毒核蛋白基因的保守序列设计qPCR引物，对反应体系进行优化，制作标准曲线，并进行灵敏度、重复性和特异性测试，建立染料法qPCR检测方法，并在临床标本和人工感染鱼组织样品中进行应用。结果表明，构建的标准曲线，模板量与Ct值之间具有良好的线性关系，相关系数R2为0.9994，检测灵敏度达到4.5拷贝/μL，除MSRV、鳜弹状病毒（Sinipercachuatsirhabdovirus,SCRV）、杂交鳢弹状病毒（Hybridsnakeheadrhabdovirus,HSHRV）和斑鳢弹状病毒（Channamaculatarhabdovirus,CMRV）外，对其他7种病毒大口黑鲈蛙虹彩病毒（Largemouth bass ranavirus, LMBV）、传染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV）、神经坏死病毒（Nervous necrosis virus, NNV），传染性造血器官坏死病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV）、鲤春病毒血症病毒（Spring viraemia of carp virus, SVCV）、草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus, GCRV）和黄颡鱼小RNA病毒（Yellow catfish picornavirus, YCPrV）都无扩增荧光信号；在对45份临床样品的检测中，建立的qPCR检出阳性率比套式PCR高11.11%；对人工感染MSRV的不同规格（1 g/ind、3 g/ind、8 g/ind）大口黑鲈各组织检测结果显示，脾脏中病毒载量最高，并且大规格鱼苗（8 g/ind）组织中病毒载量要低于小规格鱼苗（1 g/ind、3 g/ind），表明小规格鱼苗更易感。以上结果表明，建立的大口黑鲈弹状病毒SYBR Green qPCR检测方法是一种适合临床样品检测的特异性强、灵敏度高、稳定性好的MSRV定量方法。该方法的建立为MSRV疾病检疫提供了可靠的技术手段。

关键词：大口黑鲈弹状病毒 qPCR 病毒检测

大口黑鲈鰤鱼诺卡氏菌传代弱毒株特性及免疫效果评价

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水生生物学报 2024年第7期48卷 1120-1129页

作者：杨娜黄雷蔺凌云姚嘉赟陈静刘忆瀚陈雪兰王亿文沈锦玉潘晓艺浙江海洋大学水产学院舟山316022 浙江省淡水水产研究所农业部淡水渔业健康养殖重点实验室浙江省鱼类健康与营养重点实验室湖州市渔业环境与水产品质量安全重点实验室湖州313001

为探究鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)强毒株LY20810 F1与其传代弱毒株LY20810 F110的特性差异,比较了两个菌株的生物学特征、毒力基因序列、致病力及引起大口黑鲈免疫反应的差异,并评价了弱毒株LY20810 F110对大口黑鲈的免疫保护效... 详细信息

为探究鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)强毒株LY20810 F1与其传代弱毒株LY20810 F110的特性差异,比较了两个菌株的生物学特征、毒力基因序列、致病力及引起大口黑鲈免疫反应的差异,并评价了弱毒株LY20810 F110对大口黑鲈的免疫保护效果。结果表明,通过BHI培养基连续传代培养110代次后,菌株LY20810 F110的菌落、菌体形态发生显著变化,其生长速度较原始毒株LY20810 F1快1倍以上。通过比较两株菌的10个毒力基因序列,发现菌株LY20810 F110的SodC和ESAT6基因发生了单位点突变。致病力测试结果显示,强毒株LY20810 F1以0.1 mL 1×10^(7) cfu/mL攻毒剂量感染大口黑鲈,30d内鱼累积死亡率为100%,而传代弱毒株LY20810 F110在相同剂量下未造成鱼死亡。强毒株LY20810 F1攻毒3d后引起脾脏、头肾中IL-1β、IL-10、TNF-α、IFN-γ等炎症细胞因子显著上调,表明细菌感染引起炎症风暴。传代弱毒株LY20810 F110在感染中后期(14d和28d)诱导包括IgM、CD4-α、CD8-α、MHCI-α等8种免疫因子的上调。免疫效果评价结果显示,弱毒株LY20810 F110的注射、浸泡免疫(1×10^(8) cfu/mL)对大口黑鲈的相对保护率分别为75.0%和66.7%,有效降低了鰤鱼诺卡氏菌入侵造成大口黑鲈脾脏和头肾的病理损伤。以上结果表明,鰤鱼诺卡氏菌传代弱毒株LY20810 F110是安全有效的弱毒疫苗候选株,将为诺卡氏菌减毒疫苗的研制提供科学依据。

关键词：鰤鱼诺卡氏菌传代培养减毒疫苗免疫保护大口黑鲈

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蛙源米尔伊丽莎白菌的生物膜形成能力及β内酰胺类和喹诺酮类耐药性分析

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水生生物学报 2024年

作者：蔺凌云赵颖姚嘉赟沈锦玉袁雪梅黄雷陈静彭先启刘忆瀚潘晓艺浙江省淡水水产研究所浙江省鱼类健康与营养重点实验室湖州市南浔区农业技术推广服务中心

研究旨在探讨蛙源米尔伊丽莎白菌(Elizabethingia miricola)的药敏特性,生物膜形成能力及对β-内酰胺类和喹诺酮类药物的耐药机制。通过16S rRNA和rpoB基因序列系统发育分析对分离菌株进行分子鉴定。采用肉汤稀释法、结晶紫微孔板法和... 详细信息

研究旨在探讨蛙源米尔伊丽莎白菌(Elizabethingia miricola)的药敏特性,生物膜形成能力及对β-内酰胺类和喹诺酮类药物的耐药机制。通过16S rRNA和rpoB基因序列系统发育分析对分离菌株进行分子鉴定。采用肉汤稀释法、结晶紫微孔板法和卡尔加里生物膜装置分别测定其最小抑菌浓度(MIC)、生物膜形成能力及最低生物膜清除浓度(MBEC)。利用PCR方法分析β-内酰胺耐药基因及喹诺酮类耐药决定区(QRDR)突变,并通过双纸片法检测其超广谱β-内酰胺酶(ESBL)和金属β-内酰胺酶(MBL)的产生。结果显示,从患病蛙类样本中分离到的9株优势菌株均为E. miricola;各菌株对β-内酰胺类、氨基糖苷类及喹诺酮类药物耐药,但对多西环素和氟苯尼考敏感;所有菌株均可形成生物膜,生物膜形成菌的MBEC比对应浮游菌的MIC提高8—>256倍;所有菌株均携带β-内酰胺类耐药相关基因(blaCME、blaGOB和blaB),并产生ESBL及MBL; QRDR的gyrA基因均检测到了可介导喹诺酮类耐药的非同义突变S83R, gyrB、parC和parE未发现突变。结果表明,蛙源E. miricola呈现多重耐药性,普遍具有生物膜形成能力, β-内酰胺酶的产生及喹酮类药物作用靶点突变与其β-内酰胺及喹诺酮类耐药表型相符。多西环素和氟苯尼考的体外敏感性较高,具有治疗该菌感染的潜力。研究可为***感染的治疗及耐药机制的深入研究提供参考。

关键词：多重耐药性 β-内酰胺酶喹诺酮类耐药决定区生物膜米尔伊丽莎白菌

工厂化循环水养殖模式对大口黑鲈肌肉营养成分和挥发性风味物质的影响

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动物营养学报 2024年第5期36卷 3192-3208页

作者：孙丽慧包成荣李倩姜建湖陈建明高令梅郭建林浙江省淡水水产研究所农业农村部淡水渔业健康养殖实验室浙江省鱼类健康与营养重点实验室湖州市水产品品质提升与加工技术重点实验室湖州313001 杭州市萧山区瓜沥镇农业农村办公室杭州311241

为探究工厂化循环水养殖模式对池塘养殖的大口黑鲈肌肉营养成分和挥发性风味物质的影响,将池塘养殖的大口黑鲈成鱼移入到工厂化循环水养殖系统中进行暂养,分别于暂养第1天、第10天、第20天和第30天进行取样,测定分析大口黑鲈的肌肉营养... 详细信息

为探究工厂化循环水养殖模式对池塘养殖的大口黑鲈肌肉营养成分和挥发性风味物质的影响,将池塘养殖的大口黑鲈成鱼移入到工厂化循环水养殖系统中进行暂养,分别于暂养第1天、第10天、第20天和第30天进行取样,测定分析大口黑鲈的肌肉营养成分和挥发性风味物质。结果显示:在工厂化循环水系统中暂养不同时间对大口黑鲈肌肉中粗蛋白质和粗脂肪含量无显著影响(P>0.05),但对肌肉中氨基酸总量以及二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的含量有显著影响(P营养评价,AAS模式下不同暂养时间的大口黑鲈第一限制性氨基酸均为缬氨酸,CS模式下第一限制性氨基酸均为甲硫氨酸+胱氨酸。通过构建工厂化循环水系统暂养不同时间的大口黑鲈肌肉中挥发性风味物质的指纹图谱,发现肌肉中2-庚酮、2-戊酮、2-丁酮、环戊酮、1-辛烯-3-醇、1-己醇等愉悦气味物质含量随着工厂化循环水暂养时间的延长而增加。综上可知,将池塘养殖的大口黑鲈成鱼移入到工厂化循环水系统中暂养可提高大口黑鲈肌肉营养品质及风味,是一种有效提高大口黑鲈成鱼品质的技术措施,建议在池塘养殖大口黑鲈成鱼的品质提升上推广应用。

关键词：工厂化循环水大口黑鲈肌肉营养成分挥发性风味物质

快速检测十足目虹彩病毒1 RPA-LFD方法的建立及初步应用

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中国预防兽医学报 2024年第5期46卷 505-510页

作者：袁雪梅陈静黄雷蔺凌云潘晓艺彭先启焦锦彪姚嘉赟浙江省淡水水产研究所农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室/浙江省鱼类健康与营养重点实验室/湖州市渔业环境与水产品质量安全重点实验室浙江湖州313001

为建立一种高效、快速、简便的十足目虹彩病毒1(DIV1)检测方法,本研究以DIV1 ATPase基因为检测靶标,设计特异性引物和探针,采用方阵法优化反应温度和时间,结果显示,重组酶聚合酶扩增技术(RPA)最优反应温度为37℃,时间为15 min,结果观察... 详细信息

为建立一种高效、快速、简便的十足目虹彩病毒1(DIV1)检测方法,本研究以DIV1 ATPase基因为检测靶标,设计特异性引物和探针,采用方阵法优化反应温度和时间,结果显示,重组酶聚合酶扩增技术(RPA)最优反应温度为37℃,时间为15 min,结果观察时间为5 min,检测过程总时长为20 min,初步建立了DIV1的重组酶聚合酶扩增技术结合侧向流试纸条方法(RPA-LFD)。提取其他7种常见虾类病原基因组与DIV1基因组,采用该方法检测,分析其特异性;构建重组质粒标准品p UC57-DIV1,10倍倍比稀释后采用该方法检测,分析其灵敏性;以3种不同浓度的重组质粒标准品为模板进行批间、批内重复性试验。结果显示,该方法能特异性检测DIV1,与虾类其他常见易感病原均无交叉反应;其对重组质粒标准品的检测限为1×10^(1)拷贝/μL;批内和批间重复性试验的检测结果均一致,重复性好。利用该方法与已发表的荧光定量PCR(qPCR)同时检测15份感染DIV1的罗氏沼虾样品及40份临床样品,结果显示,该方法的阳性检测率为69.09%(38/55),阴性率为30.91%(17/55),与q PCR检测结果一致,二者的阳性符合率、阴性符合率、总符合率均为100%。综上所述,本研究建立的RPA-LFD方法检测DIV1具有快速、简便、灵敏度高且特异性强的特点,且不需要精密昂贵的仪器设备,为基层实验室及现场检测提供了可行技术手段。

关键词：重组酶聚合酶扩增侧向流试纸条技术十足目虹彩病毒I

千峡湖水库温室气体排放时空特征及其环境驱动因素

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环境科学学报 2024年第7期44卷 388-401页

作者：张政刘梅周聃郭爱环练青平罗凯许巧情陈光美原居林浙江省淡水水产研究所农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室浙江省淡水水产遗传育种重点实验室湖州313001 长江大学动物科学技术学院荆州434020 浙江丰和渔业有限责任公司丽水323000

以峡谷型水库千峡湖水库为研究对象,采用顶空平衡法对千峡湖水库表层水样中溶存的CO_(2)、CH_(4)和N_(2)O浓度进行每月一次周年测定,同时使用静态浮箱法对水-气界面温室气体交换通量进行监测.结果显示,千峡湖水库表层水体CH_(4)、N_(2)O... 详细信息

以峡谷型水库千峡湖水库为研究对象,采用顶空平衡法对千峡湖水库表层水样中溶存的CO_(2)、CH_(4)和N_(2)O浓度进行每月一次周年测定,同时使用静态浮箱法对水-气界面温室气体交换通量进行监测.结果显示,千峡湖水库表层水体CH_(4)、N_(2)O和CO_(2)浓度最高都出现在春季,分别为(0.25±0.099)、(0.0078±0.0032)、(7.62±2.73)μmol·L^(-1);CH_(4)、N_(2)O最低浓度出现在冬季,分别为(0.11±0.074)、(0.00039±0.0018)μmol·L^(-1),CO_(2)的最低浓度出现在夏季((3.05±1.51)μmol·L^(-1));水库表层扩散通量CH_(4)、N_(2)O的最高扩散通量分别出现在夏冬两季,分别为(6.92±3.61)、(0.49±0.38)μmol·m^(-2)·h^(-1);水库表层CO_(2)扩散通量全年平均值为负值,最高吸收通量发生在夏季((-1973.53±1226.43)μmol·m^(-2)·h^(-1)).从全球增温潜势上看,千峡湖水库是大气的“碳汇”,水-气界面温室气体通量存在较为明显的时空变化特征.时间上,夏季水体中CH_(4)浓度与通量均显著高于冬季(p室气体扩散通量在各个季节也存在不同的空间变异性.统计分析表明,温度是影响千峡湖水库水-气界面3种温室气体排放的共同驱动因素(p营养化程度调控,与水体中无机氮的浓度呈显著正相关(p<0.05).

关键词：温室气体溶存浓度扩散通量碳汇驱动因素千峡湖水库

池塘混养和专养条件下罗氏沼虾营养品质的比较

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上海海洋大学学报 2024年第3期33卷 581-589页

作者：周聃刘梅房伟平倪蒙邹松保原居林浙江省淡水水产研究所农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室湖州市水产品品质提升与加工技术重点实验室浙江湖州313001 浙江长兴县水产与农机中心浙江长兴313100

以罗氏沼虾为研究对象,比较分析河蟹-罗氏沼虾混养模式与传统罗氏沼虾专养模式产出的罗氏沼虾营养价值和品质变化。通过测定体质量、体长、出肉率比较两种养殖模式下虾体规格差异;通过测定水分、蛋白质、灰分、脂肪、矿物质、脂肪酸和... 详细信息

以罗氏沼虾为研究对象,比较分析河蟹-罗氏沼虾混养模式与传统罗氏沼虾专养模式产出的罗氏沼虾营养价值和品质变化。通过测定体质量、体长、出肉率比较两种养殖模式下虾体规格差异;通过测定水分、蛋白质、灰分、脂肪、矿物质、脂肪酸和氨基酸,比较虾肉营养价值变化;通过测定质构特性和呈味核苷酸比较虾肉品质变化。与专养的罗氏沼虾相比,混养模式下罗氏沼虾规格显著提高,但出肉率有所下降。混养的虾肉脂肪含量从(0.91±0.07)%下降为(0.59±0.05)%,差异显著;虾肉的钙、镁、磷、铜含量上升;脂肪酸中EPA含量从(15.59±0.66)%下降至(13.64±0.71)%;氨基酸EAAI评分略有提高,罗氏沼虾虾肉营养价值变化较小。混养的虾肉硬度显著提高;呈味核苷酸AMP和IMP含量从(78.15±1.23)g/100 g和(162.90±2.67)g/100 g提高至(86.96±1.87)g/100g和(175.12±3.01)g/100 g,混养的虾肉品质显著提高。河蟹-罗氏沼虾混养池塘内产出的罗氏沼虾规格显著增加,营养成分变化不大,虾肉品质显著提高,符合消费者品位,具有优秀的市场前景。

关键词：河蟹-罗氏沼虾池塘混养模式罗氏沼虾池塘专养模式罗氏沼虾营养品质呈味核苷酸

钱塘江唐家洲产卵场仔稚鱼的资源现状及其与环境因子的关系

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浙江农业学报 2024年

作者：鲁一平练青平郭爱环罗凯许巧情原居林长江大学动物科学技术学院浙江省淡水水产研究所农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室浙江省淡水水产遗传育种重点实验室

为了解钱塘江下游唐家洲产卵场仔稚鱼的资源现状，2022年4—6月对唐家洲产卵场的仔稚鱼资源进行监测，分析仔稚鱼种类组成、生态类型、丰度时间变化和群落特征，解析仔稚鱼群落特征与主要环境因子的关系，以期为钱塘江鱼类资源的保护与... 详细信息

为了解钱塘江下游唐家洲产卵场仔稚鱼的资源现状，2022年4—6月对唐家洲产卵场的仔稚鱼资源进行监测，分析仔稚鱼种类组成、生态类型、丰度时间变化和群落特征，解析仔稚鱼群落特征与主要环境因子的关系，以期为钱塘江鱼类资源的保护与利用提供数据支撑。本次调查共采集到仔稚鱼1 191尾，经鉴定，隶属于2目2科17种，其中，优势种5种，常见种1种。调查期间，仔稚鱼的日丰度为0～0.255 3 m-3，日平均丰度为0.041 4 m-3，5月份仔稚鱼的平均丰度日最大。仔稚鱼物种大多为杂食性（占总物种数的82.4%），产黏性卵的居多（占总物种数的47.1%），多数营底层生活（占总物种数的52.9%）。冗余分析结果显示，仔稚鱼的数量与水温呈显著相关性（P<0.05），与流量和透明度无显著相关性。

关键词：钱塘江仔稚鱼产卵场环境因子

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高低化池塘对罗氏沼虾生长性能和水质的影响

水产养殖 2024年第5期45卷 23-30,62页

作者：邹松保倪蒙刘梅周聃原居林农业农村部淡水渔业健康育苗重点实验室浙江省鱼类健康与营养重点实验室浙江省淡水水产研究所浙江湖州313001

开展了高低化池塘对罗氏沼虾生长性能和水质的影响试验,并从环境参数、虾的生长性能、抗氧化酶活、产量收益和浮游细菌群落等方面,跟传统池塘进行了对比。结果表明,高低化池塘高位区水体溶解氧、罗氏沼虾表型特征(体长、体质量和头胸甲... 详细信息

开展了高低化池塘对罗氏沼虾生长性能和水质的影响试验,并从环境参数、虾的生长性能、抗氧化酶活、产量收益和浮游细菌群落等方面,跟传统池塘进行了对比。结果表明,高低化池塘高位区水体溶解氧、罗氏沼虾表型特征(体长、体质量和头胸甲长)、存活率、产量、肥满度和日增质量,均显著高于传统池塘(P<0.001),饵料系数较低。抗氧化酶活结果显示,高低化池塘罗氏沼虾肝胰脏的过氧化氢酶、谷胱甘肽S-转移酶和丙二醛的含量较低,但超氧化物歧化酶却较高。浮游细菌群落的对比显示,高低化池塘中放线菌(Actinobacteria)和酸微菌(Acidimicrobiia)的丰度较高,但γ-、α-、δ-变形菌(Proteobacteria)、伊格氏菌(Ignavibacteria)和芽单胞菌(Gemmatimonadetes)和绿弯菌(Chloroflexia)的丰度较低。高低化池塘低位区的细菌α-多样性较低。指出,高低化池塘能显著提高养殖池塘的溶解氧含量和养殖效益。

关键词：罗氏沼虾传统池塘高低化池塘表型特征酶活浮游细菌群落