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N-乙酰半胱氨酸对双酚A诱导的猪肾细胞凋亡和炎症反应的抑制作用

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中国农业科学 2023年第3期56卷 549-558页

作者：陶文静张子婷刘媛宋丹李向臣浙江农林大学动物科技学院/动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室

【背景】双酚A(BPA)广泛应用于塑料材料工业制造，其从塑料制品中渗出，暴露在食物、水、土壤和空气等多种环境介质中，导致动物长期接触，并经过胎盘和母乳传递给后代，干扰动物生长和发育，对动物生长性能和生产效率产生不利影响。N-... 详细信息

【背景】双酚A(BPA)广泛应用于塑料材料工业制造，其从塑料制品中渗出，暴露在食物、水、土壤和空气等多种环境介质中，导致动物长期接触，并经过胎盘和母乳传递给后代，干扰动物生长和发育，对动物生长性能和生产效率产生不利影响。N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为公认的强效抗氧化剂，能够调节氧化应激、细胞凋亡、炎症等多种病理生理过程。然而，NAC对BPA诱导的猪肾细胞损伤的调节作用尚不清楚。【目的】探究抗氧化剂NAC在BPA诱导的PK15细胞凋亡和炎症反应中的潜在作用，为NAC在对抗BPA诱导的猪肾细胞损伤中的应用研究提供科学依据。【方法】选取PK15细胞为试验材料，采用相应的抗氧化检测试剂盒分别测定细胞内过氧化氢酶（CAT）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性变化；设置不同浓度NAC(0、2、5和10 mmol·L-1)预处理，并与BPA共处理PK15细胞，CCK-8检测细胞活力以筛选最佳的NAC作用浓度；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测凋亡相关基因（BAX、BCL-2和Caspase3）表达和炎症相关基因（IL-8、IL-6、IL-1β和TNF-α）mRNA相对表达量，蛋白免疫印迹检测凋亡相关蛋白（BAX、BCL-2、cleaved-Caspase3）水平；免疫荧光染色检测凋亡细胞数量和核因子κB(NF-κB)核易位。【结果】与对照组相比，BPA处理显著降低了细胞内CAT、T-SOD和GSH-Px活性（P<0.05）。CCK-8结果显示，与对照组相比，BPA显著降低PK15细胞活力，而不同浓度的NAC均能显著促进PK15细胞活力（P<0.05），且与BPA单独处理相比，5和10 mmol·L-1 NAC预处理均能显著促进PK15细胞活力（P<0.05）;qRT-PCR和蛋白免疫印迹结果显示，BPA处理显著增加了BAX、Caspase3 mRNA相对表达量以及蛋白表达水平，减少了BCL-2mRNA相对表达量和蛋白表达（P<0.05），而NAC预处理能够减少BPA诱导增加的BAX、Caspase3基因和蛋白表达，增加BCL-2基因和蛋白表达；Hoechst 33258荧光染色显示，BPA处理的细胞呈现强蓝色荧光染色且有明显的核皱缩，而NAC预处理后呈现较弱的蓝色荧光；BPA处理显著增加炎症相关因子（IL-8和IL-6）mRNA相对表达量（P<0.05），而NAC预处理抑制BPA诱导增加的炎症相关因子（IL-8、IL-6和IL-1β）mRNA相对表达量，免疫荧光检测NF-κB核易位显示，对照组的NF-κB主要分布在细胞质中，而BPA处理后的NF-κB主要分布在细胞核，NAC预处理明显减少核NF-κB的表达。【结论】NAC显著提高BPA诱导降低的PK15细胞活力，抑制BPA诱导的PK15细胞凋亡和炎症反应。

关键词：双酚A N-乙酰半胱氨酸细胞凋亡炎症反应 PK15细胞氧化应激

牛病毒性腹泻病毒Erns蛋白激活NLRP3炎症小体诱发细胞焦亡的研究

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微生物学报 2023年

作者：李园韩言言钟林翰宋京格周佳莹王美徐义刚浙江农林大学动物科技学院.动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室

【目的】牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是引起牛病毒性腹泻-黏膜病的关键病毒。BVDV的结构蛋白Erns可在病毒感染的初期削弱宿主的免疫防御，引发牛群炎症反应。核苷酸寡聚化结构域样受体（NOD）热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体是NO... 详细信息

【目的】牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是引起牛病毒性腹泻-黏膜病的关键病毒。BVDV的结构蛋白Erns可在病毒感染的初期削弱宿主的免疫防御，引发牛群炎症反应。核苷酸寡聚化结构域样受体（NOD）热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体是NOD样受体(NLRs)家族重要成员，调控炎症性疾病的发生发展，同时激活的NLRP3炎症小体能够引起宿主细胞焦亡，进而诱发级联放大的炎症反应。但BVDV Erns蛋白在BVDV感染诱发炎症反应的分子机制尚不清楚。【方法】为进一步探索Erns蛋白对BVDV感染激活NLRP3炎症小体诱发细胞焦亡的影响，构建了BVDV Erns蛋白的真核表达质粒pCMV-HA-Erns，过表达BVDV Erns蛋白，检测BVDV感染细胞中NLRP3炎症小体组分（半胱氨酸蛋白酶（Caspase-1）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和NLRP3）、IL-1β的mRNA转录水平和蛋白表达水平，以及细胞死亡调节蛋白（GSDMD）的基因表达和蛋白剪切情况，并通过扫描电镜观察BT细胞膜成孔及BT细胞内容物释放情况，以分析Erns蛋白诱导BT细胞产生细胞焦亡。【结果】Erns蛋白能够显著引起NLRP3炎症小体活化进而激活Caspase-1，活化的Caspase-1一方面切割GSDMD，形成有活性的GSDMD-N端并在BT细胞膜形成孔洞，释放内容物，诱导BT细胞发生细胞焦亡，另一方面活化的Caspase-1切割pro-IL-1β，形成有活性的IL-1β，并释放到BT细胞外，引起BT细胞上清中IL-1β水平上升。【结论】系统解析了BVDV Erns蛋白激活NLRP3炎症小体介导细胞焦亡的产生，对疫苗及治疗药物的研制具有重要指导意义。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 Erns蛋白 NLRP3炎症体细胞焦亡

浙东白鹅催乳素选择性剪接体基因克隆和活性初步鉴定

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中国畜牧杂志 2024年第5期60卷 195-205页

作者：周晓龙徐中宝樊金云赵阿勇杨松柏浙江农林大学动物科技学院动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室浙江杭州311300

催乳素(Prolactin,PRL)在家禽卵泡发育和就巢行为中扮演着至关重要的调控角色。本研究深入剖析了浙东白鹅的PRL基因选择性剪接体及其蛋白结构,进而发现了一种新的剪接体PRL-S。利用生物信息学软件,对2种剪接体的mRNA和蛋白序列进行了详... 详细信息

催乳素(Prolactin,PRL)在家禽卵泡发育和就巢行为中扮演着至关重要的调控角色。本研究深入剖析了浙东白鹅的PRL基因选择性剪接体及其蛋白结构,进而发现了一种新的剪接体PRL-S。利用生物信息学软件,对2种剪接体的mRNA和蛋白序列进行了详尽的对比分析,成功获取了PRL-L和PRL-S的全长CDS序列。在对比中,发现PRL-S缺乏信号肽,且其N端缺失了57个氨基酸,其N端的前19个氨基酸序列与PRL-L存在显著差异。进一步对PRL-S蛋白的二级结构分析,发现其N端的第一个α-螺旋已完全消失。为了深入研究PRL-S的生物学功能,利用原核表达系统成功制备了高纯度的PRL蛋白,并通过pET28a原核表达系统对重组PRL蛋白进行了表达。随后,通过CO-IP和双荧光素酶报告系统等试验,证实了PRL-S重组蛋白确实具有一定的生理活性。本研究不仅为深入理解浙东白鹅的PRL基因选择性剪接体在就巢行为调控中的作用提供了重要线索,同时也为通过调控这些剪接体来提高浙东白鹅的产蛋量奠定了坚实的理论基础。

关键词：催乳素 PRLR基因剪接体原核表达浙东白鹅

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干酪乳杆菌YG-01株的益生特性及抑菌活性研究

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中国畜牧兽医 2024年第2期51卷 829-836页

作者：刘伊湄周佳莹韩言言李园宋厚辉徐义刚王美浙江农林大学动物科技学院·动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室杭州311300

[目的]评价从奶酪中分离出的干酪乳杆菌YG-01的益生性及抑菌活性,为该菌株在食品动物生产中的应用提供理论参考。[方法]本研究分别检测干酪乳杆菌YG-01株的药物敏感性、肠道定植能力、消化道环境耐受特性、肠道菌群调节作用、抑制肠道... 详细信息

[目的]评价从奶酪中分离出的干酪乳杆菌YG-01的益生性及抑菌活性,为该菌株在食品动物生产中的应用提供理论参考。[方法]本研究分别检测干酪乳杆菌YG-01株的药物敏感性、肠道定植能力、消化道环境耐受特性、肠道菌群调节作用、抑制肠道致病菌活性及促生长作用。[结果]药敏试验结果显示,干酪乳杆菌YG-01对米诺环素、红霉素、克拉霉素、克林霉素、青霉素等常见抗生素极敏感;利用探针(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester, cFDA-SE)标记的干酪乳杆菌YG-01灌喂试验兔,口服后第1天,干酪乳杆菌YG-01在兔空肠、回肠和结肠的检出率分别为70.9%、59.3%和66.0%,口服后第11天时仍保持较高定植水平(>35%);干酪乳杆菌YG-01的活菌数在模拟胃液(pH为2.5、3.5、4.5)、模拟肠液、胆酸盐浓度动物生长性能,为开发基于干酪乳杆菌YG-01株的微生态制剂奠定了基础。

关键词：干酪乳杆菌YG-01株益生特性抑菌活性微生态制剂

白术、酸枣仁提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果研究

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饲料工业 2023年

作者：吴科惠吕曼婷刘锋龚海洲张亚南王攀林李向臣宋丹浙江农林大学动物科技学院动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室

试验旨在研究菊科植物白术干燥根茎切片提取物(白术提取物)、鼠李科植物酸枣的种子提取物(酸枣仁提取物)单独和联合作用对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。通过微量肉汤法测定亚抑菌浓度和抑制率；用酶标仪测定相应OD值以检测核酸和蛋白质含... 详细信息

试验旨在研究菊科植物白术干燥根茎切片提取物(白术提取物)、鼠李科植物酸枣的种子提取物(酸枣仁提取物)单独和联合作用对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。通过微量肉汤法测定亚抑菌浓度和抑制率；用酶标仪测定相应OD值以检测核酸和蛋白质含量、乳酸脱氢酶(LDH)活性及碱性磷酸酶(AKP)活力，以确定对细菌细胞膜和细胞壁的影响；用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳检测金黄色葡萄球菌菌体总蛋白含量变化；用结晶紫染色法检测对细菌生物膜的抑制作用。结果表明：0.4 mg/mL白术、酸枣仁提取物单独及0.1 mg/mL二者联合作用对金黄色葡萄球菌均具有显著抑菌效果；与对照组相比，白术、酸枣仁提取物单独和联合作用均使菌液上清液中OD260、OD280数值和AKP活力显著增加，菌体LDH活性和总蛋白含量降低，抑制了生物膜的形成。说明白术、酸枣仁提取物单独和联合作用均可显著抑制金黄色葡萄球菌，且联合作用抑菌效果显著强于各药物单独作用。

关键词：金黄色葡萄球菌白术提取物酸枣仁提取物联合作用抑菌

牛病毒性腹泻病毒Erns蛋白激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体诱发细胞焦亡的研究

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微生物学报 2023年第11期63卷 4271-4282页

作者：李园韩言言钟林翰宋京格周佳莹王美徐义刚浙江农林大学动物科技学院·动物医学院\浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室浙江杭州311300

【目的】牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是引起牛病毒性腹泻-黏膜病的关键病毒。BVDV的结构蛋白Erns可在病毒感染的初期削弱宿主的免疫防御,引发牛群炎症反应。核苷酸寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligo... 详细信息

【目的】牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是引起牛病毒性腹泻-黏膜病的关键病毒。BVDV的结构蛋白Erns可在病毒感染的初期削弱宿主的免疫防御,引发牛群炎症反应。核苷酸寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体是NOD样受体(NOD-like receptor,NLRs)家族重要成员,调控炎症性疾病的发生发展,同时激活的NLRP3炎症小体能够引起宿主细胞焦亡,进而诱发级联放大的炎症反应。但BVDV Erns蛋白在BVDV感染诱发炎症反应的分子机制尚不清楚。【方法】为进一步探索Erns蛋白对BVDV感染激活NLRP3炎症小体诱发细胞焦亡的影响,构建了BVDV Erns蛋白的真核表达质粒pCMV-HA-Erns,过表达BVDV Erns蛋白,检测BVDV感染细胞中NLRP3炎症小体组分[半胱氨酸蛋白酶(caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)和NLRP3]、IL-1β的mRNA转录水平和蛋白表达水平,以及细胞死亡调节蛋白(gasdermin D,GSDMD)的基因表达和蛋白剪切情况,并通过扫描电镜观察牛睾丸(bovine testis,BT)细胞膜成孔及BT细胞内容物释放情况,以分析Erns蛋白诱导BT细胞产生细胞焦亡。【结果】Erns蛋白能够显著引起NLRP3炎症小体活化进而激活caspase-1,活化的caspase-1一方面切割GSDMD,形成有活性的GSDMD-N端并在BT细胞膜形成孔洞,释放内容物,诱导BT细胞发生细胞焦亡;另一方面活化的caspase-1切割pro-IL-1β,形成有活性的IL-1β,并释放到BT细胞外,引起BT细胞上清中IL-1β水平上升。【结论】系统解析了BVDV Erns蛋白激活NLRP3炎症小体介导细胞焦亡的产生,对疫苗及治疗药物的研制具有重要指导意义。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 Erns蛋白 NLRP3炎症体细胞焦亡

白斑综合征病毒(WSSV)灭活制剂对克氏原螯虾抗WSSV的研究

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浙江农林大学学报 2023年第3期40卷 680-684页

作者：裘杰珂赖勇勇许英蕾朱斐浙江农林大学动物科技学院/动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室浙江杭州311300

【目的】研究经双乙烯亚胺(BEI)灭活的白斑综合征病毒(WSSV)灭活制剂保护克氏原螯虾Procambarus clarkii抗WSSV感染的效果,以期为白斑综合征的防治提供有效的免疫方法。【方法】应用BEI对WSSV和WSSV超声破碎液进行灭活,通过口服和注射... 详细信息

【目的】研究经双乙烯亚胺(BEI)灭活的白斑综合征病毒(WSSV)灭活制剂保护克氏原螯虾Procambarus clarkii抗WSSV感染的效果,以期为白斑综合征的防治提供有效的免疫方法。【方法】应用BEI对WSSV和WSSV超声破碎液进行灭活,通过口服和注射分别对克氏原螯虾进行免疫,再对其进行抗WSSV感染的效果研究。【结果】WSSV在BEI处理24 h可以被完全灭活,通过口服途径用灭活制剂免疫克氏原螯虾7 d后攻毒,克氏原螯虾死亡率显著下降,且口服免疫的效果要好于注射免疫。【结论】经BEI灭活24 h的WSSV灭活制剂对克氏原螯虾是安全的,口服免疫后可以显著降低克氏原螯虾感染白斑综合征病毒的死亡率。图2表3参19。

关键词：白斑综合征病毒双乙烯亚胺(BEI) 灭活克氏原螯虾

N-乙酰半胱氨酸预处理对热应激IPEC-J2细胞氧化损伤和内质网应激的影响

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中国畜牧杂志 2023年第4期59卷 217-221页

作者：汤志宁周旭杨梦婷莫凡陈乐怡杨治江魏筱诗茅慧玲王翀崔艳军浙江农林大学动物科技学院·动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室浙江临安311300

本试验旨在研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)对热应激诱导的猪小肠上皮细胞IPEC-J2抗氧化能力、内质网应激通路蛋白表达和细胞凋亡的影响。采用单因子试验设计,试验分3组,分别为对照组(CON,37℃)、热应激组(HS,43℃)和NAC加热应激组(NAC+HS,43℃... 详细信息

本试验旨在研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)对热应激诱导的猪小肠上皮细胞IPEC-J2抗氧化能力、内质网应激通路蛋白表达和细胞凋亡的影响。采用单因子试验设计,试验分3组,分别为对照组(CON,37℃)、热应激组(HS,43℃)和NAC加热应激组(NAC+HS,43℃)。其中NAC+HS组细胞在NAC(0.5 mmol/L)预处理12 h后,进行热应激处理4 h,测定细胞氧化损伤情况、活性氧自由基(ROS)含量、抗氧化酶的活性、线粒体膜电位变化、细胞内质网应激和凋亡相关蛋白的表达。结果表明:与CON组相比,热应激导致细胞中ROS和丙二醛(MDA)含量显著增加,铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)、锰超氧化物歧化酶(SOD2)和过氧化氢酶(CAT)的表达量提高(P<0.05);与HS组相比,添加NAC降低了氧化损伤和抗氧化酶(SOD2、CAT)的表达(P<0.05)。与CON组相比,热应激增加热休克蛋白A5(HSPA5)、磷酸化真核细胞翻译启始因子2α(p-eif2α)、转录激活因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白表达量(P<0.01);添加NAC降低HSPA5、p-eif2α、ATF4、CHOP蛋白表达量(P<0.01)。NAC预处理降低了热应激诱导的凋亡标志蛋白细胞色素C(Cytc)和活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Active-caspase3)的表达(P<0.05)。综上,添加NAC可以缓解热应激诱导的IPEC-J2细胞的氧化应激和内质网应激,减少细胞凋亡。

关键词： IPEC-J2 热应激内质网应激活性氧 N-乙酰半胱氨酸

猪miR-22前体上游序列突变的PK15细胞系构建

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浙江农业学报 2022年第9期34卷 1849-1855页

作者：丁兆雪王佳洁沈中浩周晓龙杨松柏金航峰赵阿勇汪涵浙江农林大学动物科技学院·动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室浙江杭州311300

猪miR-22前体上游序列片段突变可能对miR-22的表达起到重要调控作用,为进一步探究其功能,基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过针对猪miR-22前体上游序列片段设计2个靶标sgRNAs(short guide RNAs),构建重组表达载体pX459-sgRNA1和pX459-sgR... 详细信息

猪miR-22前体上游序列片段突变可能对miR-22的表达起到重要调控作用,为进一步探究其功能,基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过针对猪miR-22前体上游序列片段设计2个靶标sgRNAs(short guide RNAs),构建重组表达载体pX459-sgRNA1和pX459-sgRNA2;随后将重组质粒转染猪肾上皮细胞系(PK15),经嘌呤霉素初步筛选后,提取基因组DNA,通过PCR及测序鉴定编辑效果;最后,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测编辑前后miR-22相对表达量的变化。结果显示,81个阳性克隆中,共产生6种突变类型,突变率达60.49%;qRT-PCR检测显示,编辑后miR-22的表达量显著下调约50%。本研究成功获得了miR-22前体上游序列突变的猪PK15细胞模型,为今后猪miR-22的功能研究提供了新的可应用研究对象。

关键词：猪微小RNA 突变 CRISPR/Cas9技术 PK15细胞系