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单核细胞增生性李斯特氏菌tatD基因缺失对小鼠毒力和肠道菌群的影响

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浙江农林大学学报 2024年第1期41卷 161-168页

作者：牛俊辉李琦毛福超钱满贾艳艳丁轲张春杰程相朝廖成水河南科技大学动物科技学院功能微生物与畜禽健康实验室河南洛阳471023 河南科技大学洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室河南洛阳471023 河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室河南洛阳471023

【目的】探究单核细胞增生性李斯特氏菌Listeria monocytogenes tatD基因缺失对小鼠Mus musculus毒力和肠道菌群的影响,为tatD在单核细胞增生性李斯特氏菌与宿主互作中的作用及减毒疫苗研究提供参考。【方法】采用Bliss法将亲本菌株(LM1... 详细信息

【目的】探究单核细胞增生性李斯特氏菌Listeria monocytogenes tatD基因缺失对小鼠Mus musculus毒力和肠道菌群的影响,为tatD在单核细胞增生性李斯特氏菌与宿主互作中的作用及减毒疫苗研究提供参考。【方法】采用Bliss法将亲本菌株(LM10403s)、缺失菌株(LM10403sΔtatD)和互补菌株(LM10403sCΔtatD)口服感染小鼠,确定菌株对小鼠的半数致死量(LD_(50))。LM10403sΔtatD以1.00×10^(5) CFU口服免疫小鼠观察其免疫保护效果。将40只6周龄雌鼠随机平均分为对照即磷酸缓冲盐溶液组(PBS)、LM10403s组、LM10403sΔtatD组和LM10403sCΔtatD组,PBS组小鼠灌胃200μL无菌PBS,实验组分别灌胃200μL含1.00×10^(6) CFU的菌液。灌胃24 h后剖杀各组小鼠,收集肠道内容物,采用Illumina Hiseq测序技术测定各处理小鼠盲肠样品微生物16S rRNA V3-V4区序列,并比较分析其微生物群落结构、多样性和信号通路富集。【结果】LM10403sΔtatD的LD_(50)为8.11×10^(7) CFU,毒力低于LM10403s。同时LM10403sΔtatD口服免疫小鼠后对单核细胞增生性李斯特氏菌亲本菌株的攻毒能提供80%保护率。Chao1和Observed species指数显示:PBS与LM10403sΔtatD处理组差异不显著,但LM10403s组和LM10403sCΔtatD处理组相比于PBS处理组显著下降(P<0.05)。在门水平上,LM10403sΔtatD处理组的厚壁菌门Firmicutes相对丰度高于LM10403s和LM10403sCΔtatD处理组,而在属水平上,乳杆菌属Lactobacillus相对丰度高于LM10403s和LM10403sCΔtatD处理组。功能预测分析显示:LM10403s处理组在细胞过程、环境信息处理和新陈代谢等信号通路的富集程度高于LM10403sΔtatD处理组。【结论】tatD基因缺失后单核细胞增生性李斯特氏菌的毒力降低,并具有一定的免疫保护效果。tatD基因缺失菌株感染小鼠对肠道菌群失调影响减小,且有益菌增多。

关键词： tatD基因单核细胞增生性李斯特氏菌毒力 16S rRNA 肠道菌群

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鸡FGL2基因的克隆分析及原核表达

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2024年第3期52卷 11-18,39页

作者：郭亚格刘佳隆齐志颖何雷贾艳艳陈建陈松彪廖成水丁轲余祖华洛阳市活载体生物材料与动物疫病重点实验室河南洛阳471003 河南科技大学动物科技学院功能微生物与畜禽健康实验室河南洛阳471003

【目的】克隆鸡纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein 2,FGL2)基因,并进行生物信息学分析和原核表达,为鸡FGL2蛋白的功能研究奠定基础。【方法】采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术扩增鸡FGL2基因,克隆至pMD19-... 详细信息

【目的】克隆鸡纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein 2,FGL2)基因,并进行生物信息学分析和原核表达,为鸡FGL2蛋白的功能研究奠定基础。【方法】采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术扩增鸡FGL2基因,克隆至pMD19-T载体,测序后对鸡FGL2基因及其编码的蛋白进行生物信息学分析。构建原核表达质粒pET-32a-FGL2,将其转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。【结果】成功克隆了鸡FGL2基因的CDS区,序列全长为1320 bp,编码439个氨基酸。生物信息学分析显示,鸡FGL2氨基酸与火鸡、雉鸡、珍珠鸡、鹌鹑等禽类的同源性高,达96%以上;与哺乳类动物的同源性较低,其中与犬的同源性仅有64.8%。FGL2蛋白由439个氨基酸组成,理论分子质量为50.24 ku,分子式为C_(2221)H_(3451)N_(615)O_(673)S_(22),理论等电点(pI)为8.63,为不稳定的亲水性分泌型蛋白,无跨膜区。成功构建了原核表达质粒pET-32a-FGL2,其在大肠杆菌BL21(DE3)可表达以包涵体形式为主的FGL2融合蛋白,分子质量约为70 ku。【结论】成功克隆出了1320 bp的鸡FGL2基因,明确了其编码蛋白的生物学信息,经诱导表达后获得FGL2重组蛋白。

关键词：鸡 FGL2基因生物信息学分析原核表达

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副猪格拉瑟菌的荚膜分型方法及原理研究进展

畜牧兽医学报 2024年

作者：朱亚新关丽君张俊峰薛云赵战勤河南科技大学动物科技学院/洛阳市动物细菌性传染病防控技术重点实验室河南科技大学动物科技学院/河南省高等学校环境与畜产品安全重点学科开放实验室

副猪格拉瑟菌（GPS）是猪的重要病原菌之一，自1910年被确认为猪格拉瑟病的病原以来，血清型鉴定是GPS研究领域长期以来的“卡脖子”环节。1992年，基于GPS热稳定抗原的GID分型方法首次将GPS分为1–15型，但有约25%的菌株不可分型，当... 详细信息

副猪格拉瑟菌（GPS）是猪的重要病原菌之一，自1910年被确认为猪格拉瑟病的病原以来，血清型鉴定是GPS研究领域长期以来的“卡脖子”环节。1992年，基于GPS热稳定抗原的GID分型方法首次将GPS分为1–15型，但有约25%的菌株不可分型，当时对于其分型抗原的成分也不明确。2003年，基于GPS的“盐水提取物”抗原建立了GPS的IHA分型方法，其敏感性和分型率均高于GID，但仍有约15%的菌株不可分型。IHA和GID方法的分型结果基本一致，因此能够确定两者的分型抗原是基于相同的GPS表面多糖成分，但仍不能确定是荚膜多糖，或是LPS，甚或是其他多糖物质。2013年，1–15型GPS荚膜多糖的合成基因簇得到成功解析，证实其血清型抗原形成的本质是荚膜多糖。2015年，Howell等基于GPS荚膜的特异性靶基因设计引物，建立了GPS的PCR分型方法（H-PCR），但不能对血清5型和12型进行鉴别；2017年，Jia等基于GPS荚膜的特异性靶基因也建立了一套PCR分型方法（J-PCR），能对血清5型和12型进行了鉴别。两种PCR分型方法配合使用可对几乎所有GPS菌株分型，并从分子生物学基础上验证了其与GID和IHA方法的一致性，最终确认三种分型方法的抗原基础均为GPS荚膜。PCR分型方法具有操作简单、速度快、成本低等优点，成功解决了GID和IHA血清分型方法中的诸多问题，得到了广泛应用。本文系统回顾了GPSGID、IHA和PCR 分型方法的建立与应用历史，及其相同抗原基础的发现历程，以期为GPS三种分型方法的免疫学物质基础及原理提供系统的理论知识，为副猪格拉瑟菌病防控技术的研发提供新思路。

关键词：副猪格拉瑟菌荚膜血清型 GID IHA PCR

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多杀性巴氏杆菌的摄铁机制研究进展

畜牧兽医学报 2024年

作者：沈香香关丽君张俊峰薛云司丽芳赵战勤河南科技大学动物科技学院/洛阳市动物细菌性传染病防控技术重点实验室河南科技大学动物科技学院/河南省高等学校环境与畜产品安全重点学科开放实验室

多杀性巴氏杆菌可广泛感染多种动物，引起出血性败血症或传染性肺炎。铁是多杀性巴氏杆菌感染宿主过程中生长、定植和增殖的必不可少的营养物质，竞争宿主铁离子是该病原体感染致病的关键环节。近年来，多杀性巴氏杆菌的摄铁系统及其发... 详细信息

多杀性巴氏杆菌可广泛感染多种动物，引起出血性败血症或传染性肺炎。铁是多杀性巴氏杆菌感染宿主过程中生长、定植和增殖的必不可少的营养物质，竞争宿主铁离子是该病原体感染致病的关键环节。近年来，多杀性巴氏杆菌的摄铁系统及其发生与调控机制方面的研究取得了一系列重要进展。本文系统阐述了多杀性巴氏杆菌的转铁蛋白受体摄铁机制、血红素受体摄铁机制、铁载体摄铁机制及其摄铁系统的表达与调控机制，以期为多杀性巴氏杆菌摄铁系统的分子致病机理研究提供系统的理论知识，为多杀性巴氏杆菌分子靶标药物及亚单位疫苗的研发提供新思路。

关键词：多杀性巴氏杆菌摄铁机制铁载体 ExbB-ExbD-TonB Fur

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细菌外膜囊泡结构、分泌特性及致病机制

畜牧兽医学报 2024年第3期55卷 971-983页

作者：高远集刘畅陈淼陈松彪张俊峰李静贾艳艳廖成水郭荣显丁轲余祖华尚珂河南科技大学动物科技学院/功能微生物与畜禽健康实验室洛阳471003 洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室洛阳471003 河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室洛阳471003 河南科技大学医学技术与工程学院洛阳471003

外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)是革兰阴性菌在生长过程中释放到胞外的囊泡状结构,被认为是细菌的“远程武器”,其功能主要是攻击宿主组织并帮助细菌定植、损害宿主细胞功能、调节宿主的防御,因此OMVs在细菌致病过程中发挥着... 详细信息

外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)是革兰阴性菌在生长过程中释放到胞外的囊泡状结构,被认为是细菌的“远程武器”,其功能主要是攻击宿主组织并帮助细菌定植、损害宿主细胞功能、调节宿主的防御,因此OMVs在细菌致病过程中发挥着重要作用。囊泡中的物质通过与细菌释放出的自诱导物化学信号分子结合,可以驱使细菌或者囊泡在内环境中发挥特殊功能,如群体感应、生物膜形成、获取营养、抗生素抗性、应激反应、对抗其它微生物的竞争或防御、微生物群落状态、核酸转移、水平基因转移、毒素和毒力因子的递送等,且在细菌生长周期发挥着不可或缺的作用。本文主要综述OMVs结构、分泌特性及其致病机制的最新研究进展,为深入研究细菌的致病机制以及开发新的抗菌策略提供理论指导。

关键词：细菌外膜囊泡结构分泌特性致病机制

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牛细小病毒2型SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2024年

作者：杨澳飞刘飞飞陈慧敏余祖华韩新雨贾东鹭贾钰航陈建魏颖何雷马雪连陈松彪丁轲河南科技大学动物科技学院功能微生物与畜禽健康实验室洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室新疆农业大学

本试验旨在建立一种牛细小病毒2型（bovine parvovirus，BPV-2）的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。首先参考数据库中不同BPV-2序列，设计VP2基因保守区域特异性引物，优化反应体系，初步建立一种BPV-2特异性SYBR GreenⅠ荧光定量PCR... 详细信息

本试验旨在建立一种牛细小病毒2型（bovine parvovirus，BPV-2）的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。首先参考数据库中不同BPV-2序列，设计VP2基因保守区域特异性引物，优化反应体系，初步建立一种BPV-2特异性SYBR GreenⅠ荧光定量PCR（qPCR）方法。结果显示，扩增VP2基因片段长度约156 bp，符合目的基因大小，经鉴定所构建的重组质粒正确。用该质粒测得SYBR GreenⅠ荧光定量PCR的最低检测限为3.32×101copies/μL，而常规PCR方法检测限为3.32×103copies/μL，表明本研究方法敏感性较高。用该方法检测牛细小病毒Ⅰ型、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛疱疹病毒I型时结果为阴性，表明本方法特异性强。重复性试验结果表明，组内和组间重复变异率均小于1%，表明该方法具有良好的重复性。分别采用本研究所建立的方法和文献中发表的方法对80份腹泻牛粪便进行检测比较。结果显示，两种方法的阳性检出率均为11%（9/80），总符合率达100%。以上结果表明本研究建立基于BPV-2 VP2基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有良好特异性、灵敏性、重复性，为BPV-2的临床流行病学调查及快速检测提供了新的技术支撑。

关键词：牛细小病毒2型 VP2基因 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 建立应用

抗菌肽PMAP-24KK水凝胶的制备及抗菌活性研究

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中国药学杂志 2024年第13期59卷 1219-1225页

作者：毛付康范文琦路思阳王君辉王恩典崔靖靖王晓利牛明福廖成水河南科技大学功能微生物与畜禽健康实验室河南洛阳471023 洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室河南洛阳471023 河南科技大学基础医学与法医学院河南洛阳471023 河南科技大学食品与生物工程学院河南洛阳471023

目的制备含猪源抗菌肽-24KK(porcine myeloid antimicrobial peptide-24KK,PMAP-24KK)的水凝胶,评价其理化性能和抗菌活性。方法将PMAP-24KK与海藻酸钠、碳酸钙和葡萄糖酸内酯结合得到PMAP-24KK水凝胶,首先分析PMAP-24KK水凝胶的形成... 详细信息

目的制备含猪源抗菌肽-24KK(porcine myeloid antimicrobial peptide-24KK,PMAP-24KK)的水凝胶,评价其理化性能和抗菌活性。方法将PMAP-24KK与海藻酸钠、碳酸钙和葡萄糖酸内酯结合得到PMAP-24KK水凝胶,首先分析PMAP-24KK水凝胶的形成时间、溶胀率、含水率、保水率和释放率等理化性质,然后进行药敏试验测定其对细菌的体外抗菌活性、缓释和抗菌屏障以及对小鼠皮肤创伤愈合的效果。结果 PMAP-24KK水凝胶在2 min左右可以形成具有网状结构的凝胶态,溶胀率和含水率均在10 h达到平衡状态,分别为(158.83±3.26)%和(61.01±2.41)%,24 h的保水率和释放率约为55%和81%。PMAP-24KK水凝胶对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、猪霍乱沙门菌和鼠伤寒沙门菌表现出抑菌效果。PMAP-24KK水凝胶18 h内的缓释作用没有明显区别,18 h后开始逐渐下降至36 h无抗菌活性。PMAP-24KK水凝胶能有效地起到抗菌屏障作用,且有助于小鼠创伤模型皮肤伤口的愈合。结论本研究成功制备获得具有良好理化特性和抗菌活性的PMAP-24KK水凝胶,且具有较好的缓释和抗菌屏障以及促进伤口愈合的作用,为抗菌肽水凝胶应用的进一步研究奠定基础。

关键词：抗菌肽猪源抗菌肽-24KK 海藻酸钠水凝胶抗菌活性

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白藜芦醇对牛精子体外获能效果及早期胚胎发育的影响

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农业生物技术学报 2024年第8期32卷 1836-1843页

作者：李晓霞曹平华汪豆豆曲培栋徐志谦禹学礼栗颖华河南科技大学动物科技学院河南省草食动物工程重点实验室

精子体外获能过程中产生的过量活性氧(reactive oxygen species, ROS)会降低精子质量，进而影响早期胚胎发育。白藜芦醇是一种有效保护精子的抗氧化剂。为探讨白藜芦醇对牛(Bos taurus)精子体外获能效果及早期胚胎发育的影响，本研究将... 详细信息

精子体外获能过程中产生的过量活性氧(reactive oxygen species, ROS)会降低精子质量，进而影响早期胚胎发育。白藜芦醇是一种有效保护精子的抗氧化剂。为探讨白藜芦醇对牛(Bos taurus)精子体外获能效果及早期胚胎发育的影响，本研究将解冻后的荷斯坦牛冻精加入到分别含0、10、50、100和500μmol/L白藜芦醇的获能液中，经上游法处理1 h后，评估不同浓度白藜芦醇对牛精子活力、顶体完整性、线粒体活性、质膜完整性、获能状态及体外受精后早期胚胎发育能力的影响。结果表明，与对照组(0μmol/L)相比，在精子获能液中添加50和100μmol/L白藜芦醇的牛精子活力、顶体完整率、线粒体高膜电位百分率和质膜完整率均显著升高(P0.05)。体外受精结果表明，与对照组(0μmol/L)相比，获能液添加100μmol/L白藜芦醇能显著提高体外受精后的卵裂率和囊胚率(P<0.05)。综上表明，在获能液中添加100μmol/L白藜芦醇能显著改善牛精子功能，提高其获能率，使体外受精后的卵裂率和囊胚率显著提升。本研究有助于优化体外受精体系，加速体外胚胎生产效率。

关键词：白藜芦醇牛精子体外获能胚胎发育

mdv1-miR-M4-5p对MDCC-MSB1细胞增殖和凋亡的影响

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畜牧兽医学报 2024年第8期55卷 3678-3687页

作者：余祖华高梦茹何雷魏颖陈建陈松彪丁轲河南科技大学动物科技学院/功能微生物与畜禽健康实验室/动物疫病与公共卫生重点实验室洛阳471023 洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室洛阳471023 河南科技学院动物科技学院新乡453003

旨在研究马立克病病毒(Marek′s disease virus,MDV)编码的mdv1-miR-M4-5p对MDCC-MSB1细胞增殖和凋亡的影响,将mdv1-miR-M4-5p模拟物、抑制物及其阴性对照转染MDCC-MSB1细胞后48 h,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中mdv1-miR-M4-5p、TGF-β1、Smad2以及caspase-9、caspase-3、cyt-c、cyclinD1、Bcl-2等增殖和凋亡相关分子的转录;CCK-8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和凋亡。结果显示:与对照组相比,mdv1-miR-M4-5p模拟物转染显著上调MDCC-MSB1细胞中mdv1-miR-M4-5p、cyclinD1、Bcl-2的转录水平,下调TGF-β1、Smad2、cyt-c、caspase-9和caspase-3的表达转录,促进细胞的增殖,减少G1期细胞,增加S和G2细胞,降低细胞凋亡率。与对照组相比,mdv1-miR-M4-5p抑制物转染后MDCC-MSB1细胞的增殖、凋亡及其相关分子转录的结果与mdv1-miR-M4-5p模拟物转染后的结果相反。综上,Mdv1-miR-M4-5p可促进MDCC-MSB1细胞增殖,抑制其凋亡,这可能是通过抑制TGF-β1/Smad2信号通路来实现的。

关键词： mdv1-miR-M4-5p MDV 增殖凋亡 TGF-β1/Smad2

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