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非洲猪瘟病毒CD2v胞外区蛋白多克隆抗体的制备及其应用

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中国兽医学报 2022年第11期42卷 2125-2132页

作者：姜文廷王嘉宾石雪建万博杜永坤蒋大伟姬鹏超张改平河南农业大学国家动物免疫学国际联合研究中心河南郑州450002

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白是病毒粒子外层囊膜上的糖蛋白,是介导病毒血细胞吸附和鉴定病毒血清型的关键蛋白,对于ASFV疫苗研发和疫病净化具有重要作用。为制备ASFV CD2v胞外区蛋白多克隆抗体,本研究以NCBI... 详细信息

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白是病毒粒子外层囊膜上的糖蛋白,是介导病毒血细胞吸附和鉴定病毒血清型的关键蛋白,对于ASFV疫苗研发和疫病净化具有重要作用。为制备ASFV CD2v胞外区蛋白多克隆抗体,本研究以NCBI公布的China/2018/AnhuiXCGQ毒株的EP402R基因为研究对象,利用生物信息学软件进行分析,确定蛋白胞外区序列并进行同源性比对,将其进行密码子优化后克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建CD2v胞外区蛋白重组表达质粒His-CD2v-ex-pcDNA3.1(+),转染293 F细胞进行表达。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,重组蛋白在293 F细胞中以分泌形式表达,相对分子质量为63~89 kDa,能够与ASFV阳性血清特异性结合。利用Ni-NTA进行亲和层析纯化,将纯化后的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,通过Western blot、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定其生物活性,结果显示兔抗ASFV CD2v胞外区蛋白多克隆抗体能够特异性识别PK-15细胞表达的CD2v蛋白,可用于ASFV CD2v蛋白的Western blot、IPMA和IFA检测。本研究为进一步研究ASFV CD2v蛋白的功能和ASFV诊断方法的建立提供了材料。

关键词： ASFV CD2v胞外区蛋白多克隆抗体

整合NDV-F基因的重组MDV载体疫苗的构建

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中国兽医学报 2024年第1期44卷 52-58页

作者：龚乐乐刘盼王乐乐王芮高美洁赵旭阳王新卫杜永坤庄国庆孙爱军河南农业大学动物医学院国家动物免疫学国际联合研究中心河南郑州450046

为了预防马立克氏病毒(Marek’s disease virus,MDV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)混合感染给养禽业造成的危害,本研究以细菌人工染色体(BAC)为基因编辑平台,利用Red同源重组技术,将NDV的F基因整合到MDV双基因缺失毒株Md5 ... 详细信息

为了预防马立克氏病毒(Marek’s disease virus,MDV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)混合感染给养禽业造成的危害,本研究以细菌人工染色体(BAC)为基因编辑平台,利用Red同源重组技术,将NDV的F基因整合到MDV双基因缺失毒株Md5 BACΔmeqΔLorf9基因组中,诱导Ⅰ-SceⅠ酶表达,将筛选标记卡那霉素抗性基因敲除,构建重组活载体疫苗候选毒株Md5 BACΔmeqΔLorf9-F。PCR以及限制性片段多态性(RFLP)分析结果显示F基因成功整合到MDV基因组且重组质粒基因组完整;将鉴定正确的重组质粒转染鸡胚成纤维细胞,1周后出现明显的细胞病变,且噬斑大小与亲本毒无明显差异;体外生长曲线结果显示,F基因的插入不影响病毒的体外复制能力。结果表明,本研究正确构建了表达NDV保护性抗原F基因的重组MDV,为研制ND重组MDV活载体疫苗奠定了基础,对NDV和MDV混合感染的防控具有重要意义。

关键词：细菌人工染色体马立克氏病病毒新城疫病毒活载体疫苗

核不均一核糖核蛋白K对塞内卡病毒IRES依赖性翻译及病毒复制影响的研究

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中国兽医科学 2023年第11期53卷 1415-1423页

作者：张璐李露李名洋樊帅何文瑞张雨杭万博韩世充河南农业大学动物医学院动物免疫学国家国际联合研究中心河南郑州450046

基于前期塞内卡病毒(SVA)内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)的互作组学数据,本研究首先利用生物素标记RNA亲和捕捉技术和RNA免疫共沉淀试验,证实核不均一核糖核蛋白K(hnRNP K)与SVA基因组互作,且利用MTS试验证实... 详细信息

基于前期塞内卡病毒(SVA)内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)的互作组学数据,本研究首先利用生物素标记RNA亲和捕捉技术和RNA免疫共沉淀试验,证实核不均一核糖核蛋白K(hnRNP K)与SVA基因组互作,且利用MTS试验证实敲降或过表达hnRNP K对细胞活性影响不显著。为深入探究hnRNP K在SVA复制过程中的功能,本研究利用Western-blot和TCID50试验检测hnRNP K蛋白对SVA病毒蛋白表达和病毒滴度的影响,结果显示,敲降hnRNP K显著降低病毒蛋白VP2的表达量及病毒滴度,而过表达hnRNP K则显著增加VP2表达量及病毒滴度。利用间接免疫荧光和核质分离试验观察病毒感染对hnRNP K亚细胞定位的影响,发现SVA感染可诱导hnRNP K由细胞核向细胞质移位。通过双荧光素酶报告基因试验检测hnRNP K对帽依赖性翻译和SVA IRES依赖性翻译活性的影响,结果表明,敲降和过表达hnRNP K蛋白均对帽依赖性翻译活性无显著影响,敲降hnRNP K显著降低SVA IRES依赖性翻译活性,而过表达hnRNP K则显著增强IRES翻译活性。综上所述,本研究证实hnRNP K是SVA的关键反式作用因子,正调控病毒IRES依赖性翻译及病毒复制,为深入了解小RNA病毒蛋白翻译和复制的分子机制提供了新的见解。

关键词：核不均一核糖核蛋白K 塞内卡病毒内部核糖体进入位点核质移位

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猪CCL2的原核表达及其多克隆抗体的制备

中国兽医学报 2023年第1期43卷 29-34页

作者：东梦珂郑南南吴宏举侯浩宇陈寅龙李潮张改平杜永坤河南农业大学、动物医学学院、国家动物免疫学国际联合研究中心河南郑州450046

CCL2作为一种典型的促炎因子,在病毒感染、各类肿瘤、自身免疫疾病等许多病症的发生、发展中都有着举足轻重的意义,然而猪的CCL2研究鲜有报道。本研究使用PCR方式扩增CCL2基因,将其克隆于大肠杆菌原核表达系统的pET-28a(+)表达载体中,... 详细信息

CCL2作为一种典型的促炎因子,在病毒感染、各类肿瘤、自身免疫疾病等许多病症的发生、发展中都有着举足轻重的意义,然而猪的CCL2研究鲜有报道。本研究使用PCR方式扩增CCL2基因,将其克隆于大肠杆菌原核表达系统的pET-28a(+)表达载体中,成功构建重组表达质粒pET-28a(+)-CCL2,转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,再经0.1mmol/L的IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果表明猪CCL2蛋白在大肠杆菌中获得可溶性表达。将CCL2蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,4次免疫后收集血清,通过ELISA方法检测其效价达到1∶128000。Western blot和IFA测定结果显示本研究获得的猪CCL2多克隆抗体具有较好的特异性。本研究获得的猪CCL2蛋白和针对CCL2的兔多克隆抗体为未来研究猪CCL2的在疾病中的相关作用及生物学功能提供了试验材料。

关键词：猪CCL2 原核表达多克隆抗体

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非洲猪瘟病毒增殖过程中主要蛋白研究进展

中国动物传染病学报 2024年第1期32卷 228-236页

作者：赵旭阳樊帅靳家鑫张帅路闻龙朱潇静王芮张改平孙爱军庄国庆河南农业大学动物医学院国家动物免疫学国际联合研究中心郑州450046

非洲猪瘟病毒(ASFV)感染猪引起的非洲猪瘟(ASF),是一种急性、烈性、高度接触性传染病,给世界养猪业带来巨大经济损失。ASFV编码超过150种蛋白,广泛参与病毒的进入、复制和形态发生等过程。ASFV主要通过网格蛋白介导的胞吞作用进入宿主细... 详细信息

非洲猪瘟病毒(ASFV)感染猪引起的非洲猪瘟(ASF),是一种急性、烈性、高度接触性传染病,给世界养猪业带来巨大经济损失。ASFV编码超过150种蛋白,广泛参与病毒的进入、复制和形态发生等过程。ASFV主要通过网格蛋白介导的胞吞作用进入宿主细胞,在细胞质中核周微管组织中心(MTOC)处的“病毒工厂”中完成复制和装配,并通过微管转运至细胞膜,以“出芽”的方式释放到细胞外。本文重点分析了参与病毒进入、复制、组装和释放过程的关键蛋白功能,初步探讨其潜在研究价值,为进一步的ASF疫苗和药物靶点研发提供支持。

关键词：非洲猪瘟非洲猪瘟病毒增殖过程病毒蛋白疫苗

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非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

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黑龙江畜牧兽医 2023年第1期 1-6,13,122页

作者：吴宏举李潮郑南南侯浩宇陈寅龙靳家鑫孙爱军杜永坤张改平河南农业大学动物医学院国家动物免疫学国际联合研究中心郑州450046

为了研发非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的免疫学诊断试剂,试验将ASFV B646L基因克隆至pET-30a(+)载体中构建表达载体pET-30a(+)-p72,利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白,采用SDS-PAGE分析诱导表达的大肠杆菌,以镍柱对... 详细信息

为了研发非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的免疫学诊断试剂,试验将ASFV B646L基因克隆至pET-30a(+)载体中构建表达载体pET-30a(+)-p72,利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白,采用SDS-PAGE分析诱导表达的大肠杆菌,以镍柱对重组蛋白进行纯化,通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定纯化的重组蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合方法制备杂交瘤细胞。采用间接ELISA方法筛选并检测单克隆抗体,以Western-blot及IFA方法鉴定单克隆抗体的特异性,并通过Mouse Monoclonal Antibody Isotyping ELISA Kit鉴定单克隆抗体的亚型。结果表明:PCR扩增得到大小约为1 941 bp的B646L基因,并成功构建了表达载体pET-30a(+)-p72。诱导表达的大肠杆菌在72 ku处出现目的条带,纯化后的重组蛋白p72在72 ku处出现目的条带。筛选出4种单克隆抗体2C7D8、2E6D12、3B10E3、4G5E6,其效价在1∶100 000~1∶500 000之间,且4种单克隆抗体均能特异性识别真核及原核表达的p72蛋白。4种单克隆抗体的重链亚型均为IgG2b,单克隆抗体2C7D8和4G5E6的轻链亚型为Lambda, 2E6D12和3B10E3的轻链亚型为Kappa。说明利用大肠杆菌表达系统原核表达ASFV重组蛋白p72及制备相应的单克隆抗体是可行的。

关键词：非洲猪瘟病毒 p72蛋白单克隆抗体原核表达细胞融合

非洲猪瘟病毒p54蛋白的截短表达及其单克隆抗体的制备

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中国兽医学报 2022年第11期42卷 2139-2144页

作者：郑南南东梦珂吴宏举侯浩宇陈寅龙李潮赵慧君张改平杜永坤河南农业大学动物医学院国家动物免疫学国际联合研究中心河南郑州450046

非洲猪瘟在我国首次暴发至今已经3年多,给我国养猪业及其相关产业带来了严重的损失。本试验主要以非洲猪瘟病毒E183L基因编码的p54蛋白为研究对象,设计扩增截短E183L基因的引物,构建p54蛋白重组表达载体pET-28a(+)-p54,转化至感受态细胞... 详细信息

非洲猪瘟在我国首次暴发至今已经3年多,给我国养猪业及其相关产业带来了严重的损失。本试验主要以非洲猪瘟病毒E183L基因编码的p54蛋白为研究对象,设计扩增截短E183L基因的引物,构建p54蛋白重组表达载体pET-28a(+)-p54,转化至感受态细胞BL21(DE3)中进行诱导表达,获得可溶性表达的重组p54蛋白,通过Ni柱得到良好纯化。之后免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾脏与骨髓瘤细胞融合制备单克隆抗体,通过ELISA方法筛选和3次亚克隆共制备出2株能稳定分泌针对ASFV p54蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。经ELISA测定抗体腹水效价在1∶100000~1∶1000000之间。Western blot检测表明单克隆抗体与p54蛋白能够特异性反应。经鉴定2株单克隆抗体亚型均为IgG2b,κ。该研究获得的单克隆抗体将为p54蛋白的生物学功能的研究和ASFV血清学检测奠定基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 p54蛋白原核表达单克隆抗体

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一种快速精确编辑疱疹病毒基因组的方法

生物工程学报 2021年第4期37卷 1376-1384页

作者：孙爱军王向茹杨帅康刘莹张改平庄国庆河南农业大学动物医学院河南郑州450046 河南农业大学国家动物免疫学国际联合研究中心河南郑州450046

为了快速且准确地对疱疹病毒基因组进行基因敲除、插入或者点突变等修饰,通过同源重组将马立克氏病病毒(MDV)超强毒株Md5基因组克隆到细菌人工染色体(BAC)。将筛选的阳性重组体DNA电转进DH10B菌株,用PCR及限制性片段多态分析(RFLP)方法... 详细信息

为了快速且准确地对疱疹病毒基因组进行基因敲除、插入或者点突变等修饰,通过同源重组将马立克氏病病毒(MDV)超强毒株Md5基因组克隆到细菌人工染色体(BAC)。将筛选的阳性重组体DNA电转进DH10B菌株,用PCR及限制性片段多态分析(RFLP)方法鉴定含Md5全基因组的BAC克隆。将阳性重组体DNA转染入鸡胚成纤维细胞(CEF),拯救出重组病毒,命名为Md5BAC。进一步利用Red酶介导的两步法基因重组技术构建MDVlorf10基因敲除毒株。为了验证被敲除基因功能的特异性,将lorf10插入原位点以构建基因复原毒株。将构建的重组毒株分别感染CEF细胞,用间接免疫荧光试验确认重组病毒均包装成功;病毒生长曲线结果表明,lorf10敲除不影响病毒的体外增殖。总之,这为其他疱疹病毒的基因组编辑提供了技术参考。

关键词：马立克氏病病毒同源重组细菌人工染色体基因组编辑

非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

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动物医学进展 2023年第3期44卷 38-42页

作者：靳家鑫路闻龙赵旭阳张帅杜永坤张改平孙爱军庄国庆河南农业大学动物医学院国家动物免疫学国际联合研究中心河南郑州450046

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)B646L基因编码的结构蛋白p72是高度保守的抗原,常用作ASFV检测方法的建立。论文将截短的B646L基因连接在pET28b载体,重组质粒命名为pET28b-B646L。将重组质粒转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3... 详细信息

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)B646L基因编码的结构蛋白p72是高度保守的抗原,常用作ASFV检测方法的建立。论文将截短的B646L基因连接在pET28b载体,重组质粒命名为pET28b-B646L。将重组质粒转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,纯化p72蛋白并免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体。Western blot和IFA验证结果表明,成功获得1株IgG1亚型的ASFV p72特异性单克隆抗体,可为建立ASFV血清学检测方法提供参考。

关键词：非洲猪瘟病毒 p72蛋白原核表达单克隆抗体