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1株鸡源坦布苏病毒的分离鉴定及致病性研究

黑龙江畜牧兽医 2024年第16期 62-67,77,117,118页

作者：刘涛何平有范京惠尤永君邹立宏河北农业大学动物医学院河北保定071001 瑞普(保定)生物药业有限公司河北保定071000

为了查明湖北省某种鸡场发病鸡的病原并了解其遗传进化特征及致病性,试验首先提取发病鸡的卵泡和脾脏组织样本核酸,分别对坦布苏病毒、鸡传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、减蛋综合征病毒和滑液囊支原体6种病原体进行检测,... 详细信息

为了查明湖北省某种鸡场发病鸡的病原并了解其遗传进化特征及致病性,试验首先提取发病鸡的卵泡和脾脏组织样本核酸,分别对坦布苏病毒、鸡传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、减蛋综合征病毒和滑液囊支原体6种病原体进行检测,然后对检出的病原体进行分离培养、效价测定、遗传进化分析、中和试验和致病性试验(产蛋鸡、鸭胚和产蛋鸭)。结果表明:病料中仅坦布苏病毒核酸检测结果为阳性,新城疫病毒、禽流感病毒、减蛋综合征病毒、鸡传染性支气管炎病毒和滑液囊支原体5种病原核酸检测结果均为阴性,确定病原为坦布苏病毒。经病毒的分离培养与RT-PCR扩增后确定分离到1株坦布苏病毒,将该毒株命名为坦布苏病毒HuB株,连续传代3次获得的病毒液效价为1×10^(7.0)TCID_(50)/mL。坦布苏病毒HuB株E基因与近年来流行的坦布苏病毒参考株E基因的序列相似性为86.5%~99.8%,其中与中国鸡源参考株(GX2021和CTLN)、中国蚊源参考株(YN2020)和泰国鸭源参考株(CU56)的亲缘关系较近。坦布苏病毒HuB株能被坦布苏病毒阳性血清完全中和。接种坦布苏病毒HuB株的产蛋鸡主要表现为采食量、产蛋量明显下降,卵泡变性、液化和出血,部分鸡只表现为卵泡萎缩、腹腔中有少量干酪样物;接种坦布苏病毒HuB株的鸭胚于攻毒后96小时内全部死亡(10/10),死亡鸭胚主要表现为体表发红、出血,羽毛发育迟缓,肝脏出血、呈斑驳样;接种坦布苏病毒HuB株的产蛋鸭主要表现为停止产蛋,卵泡出血、变性、萎缩。说明成功从该种鸡场发病鸡病料中分离到1株坦布苏病毒,该毒株可能由泰国鸭源毒株变异而来,且该毒株对鸭胚有致死性,对产蛋鸭的致病性较产蛋鸡更高。

关键词：鸡源坦布苏病毒坦布苏病毒病毒分离病毒鉴定遗传进化分析致病性试验

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白胞内域与胞外域的原核表达及其抗原性分析

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中国畜牧兽医 2024年第4期51卷 1660-1670页

作者：李艳蕊任静崔锦蔷袁晨王云霄马亚娟刘志昌李永社宋勤叶河北农业大学动物医学院河北省兽医生物技术创新中心保定071000 保定市动物疫病预防控制中心保定071051 邯郸市永年区兽医院邯郸057150

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白胞外域(N-端,CD2v-N)与胞内域(C-端,CD2v-C)并分析两者的抗原性,为ASFV检测方法的研发提供试验依据和指导。【方法】构建CD2v-N和CD2v-C的重组... 详细信息

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白胞外域(N-端,CD2v-N)与胞内域(C-端,CD2v-C)并分析两者的抗原性,为ASFV检测方法的研发提供试验依据和指导。【方法】构建CD2v-N和CD2v-C的重组原核表达质粒,在体外表达并纯化CD2v-N和CD2v-C蛋白,通过Western blotting对表达蛋白进行鉴定;用表达的CD2v-N和CD2v-C蛋白分别肌内接种免疫新西兰大白兔,共免疫3次,每次间隔2周;每次免疫后14 d,应用ELISA方法测定CD2v-N或CD2v-C的特异性抗体水平;用纯化后的CD2V-N和CD2v-C蛋白作为包被抗原,通过ELISA方法检测95份ASFV感染猪的血清CD2v-N或CD2v-C特异性抗体,比较CD2v-N和CD2v-C在猪体内诱导的免疫反应水平。【结果】重组蛋白CD2v-N和CD2v-C分别以包涵体和可溶性形式表达,分子质量分别为22.9和34.0 ku,均能与猪抗ASFV血清特异性结合;用CD2v-N蛋白首免家兔后14 d,血清中未检测到特异性抗体,而在CD2v-C首免的家兔血清中检测到了高滴度的特异性抗体;三免后14 d,CD2v-N和CD2v-C蛋白免疫家兔的血清特异性抗体效价分别为1∶125000和1∶107;ELISA检测结果显示,ASFV感染猪的血清中CD2v-C特异性抗体水平显著高于CD2v-N(P学检测技术研究与开发的靶标更具优势。该研究结果对ASFV检测方法的研究与开发具有重要指导意义。

关键词：非洲猪瘟病毒(ASFV) CD2v蛋白胞外域胞内域蛋白表达抗原性

河北省廊坊市牛主要病毒性腹泻病原感染状况检测及牛冠状病毒演化分析

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畜牧兽医学报 2024年第2期55卷 649-659页

作者：李思远付新成袁雪松毛立蔡旭航孙心如黄金谢玲玲王府周华张琪李基棕李彬西北农林科技大学动物医学院杨凌712100 江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室南京210014 南京农业大学动物医学院南京210095 江苏大学生命科学学院食品与生物工程学院镇江212013 河北省廊坊市农业农村局廊坊065000 贵州省种畜禽种质测定中心贵阳550018 黔西市动物疫病预防控制中心黔西551500

牛病毒性腹泻病原严重危害畜牧业生产,BVDV、BoAstV、BCoV、MRV、BKoV、BoNeV、BNoV、BRV、BToV被认为是引起牛群腹泻的病原,不仅如此,BVDV、BCoV和BToV除了能引起消化道症状外还能引起呼吸道症状,BVDV不仅能引起消化道和呼吸道症状,还... 详细信息

牛病毒性腹泻病原严重危害畜牧业生产,BVDV、BoAstV、BCoV、MRV、BKoV、BoNeV、BNoV、BRV、BToV被认为是引起牛群腹泻的病原,不仅如此,BVDV、BCoV和BToV除了能引起消化道症状外还能引起呼吸道症状,BVDV不仅能引起消化道和呼吸道症状,还会导致母牛生殖功能异常,这些疾病对畜牧业造成巨大的经济损失。为了解牛主要病毒性腹泻病原流行情况,本次试验通过PCR检测方法对我国河北地区323份腹泻牛粪样品进行常见9种病毒性牛腹泻病原进行检测。结果显示,BVDV阳性检出率1.85%(6/323)、BCoV阳性检出率14.24%(46/323)、BRV阳性检出率57.89%(187/323)、BoAstV阳性检出率0.31%(1/323)、BoNeV阳性检出率10.84%(35/323)、BNoV阳性检出率4.33%(14/323)、MRV阳性检出率2.48%(8/323)、BToV阳性检出率4.64%(15/323)、BKoV阳性检出率11.76%(38/323)。混合感染共有76份,占比23.53%(76/323)。HBLF2302株的全基因序列、S、HE、N、M和E基因进行同源性和遗传进化分析发现,HBLF2302与BCoV/NMG1/2022基因同源性最高,为GIIb亚型。基于氨基酸序列比对和HBLF2302的S蛋白三级结构预测发现,在S蛋白中157号位突变为157T,854号位点突变为854I。318V为独特突变,改变了与侧链残基的作用力,与631C形成氢键连接。并发现中国株区别于其它地区的GⅡb亚型,位于ORF1a区域有三个独特位点。本研究丰富了牛腹泻病原的流行病学数据,为牛腹泻病的防控奠定基础。

关键词：病毒性腹泻牛冠状病毒流行病学调查腹泻病原

猪圆环病毒2型感染对猪瘟弱毒疫苗接种猪免疫应答的影响

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畜牧兽医学报 2012年第4期43卷 580-587页

作者：赵丹萍陶彬陈立功李艳琴宋勤叶李潭清杨芳李红园袁洪兴河北农业大学农业部动物疫病病原生物学华北区观测实验站保定071000

为探索猪圆环病毒2型(PCV2)感染对猪瘟(CSF)弱毒疫苗接种猪免疫应答的影响,将20头28d断奶仔猪随机分为V-I、I-V、V和C 4组,5头.组-1。V-I组在接种CSF弱毒疫苗后2d感染PCV2;I-V组在感染PCV2后2d接种CSF弱毒疫苗;V组只接种CSF弱毒疫苗;C... 详细信息

为探索猪圆环病毒2型(PCV2)感染对猪瘟(CSF)弱毒疫苗接种猪免疫应答的影响,将20头28d断奶仔猪随机分为V-I、I-V、V和C 4组,5头.组-1。V-I组在接种CSF弱毒疫苗后2d感染PCV2;I-V组在感染PCV2后2d接种CSF弱毒疫苗;V组只接种CSF弱毒疫苗;C组为空白对照组。共免疫2次,间隔21d。免疫后定期检测血清CSFV特异性抗体水平、外周血淋巴细胞(PBLC)增殖活性和PBLC中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10mRNA的表达水平。结果显示:在CSF弱毒疫苗免疫前或免疫后感染PCV2,均会导致CSFV抗体水平低下,血清抗体阳转率下降,PBLC增殖活性降低。初次免疫后,V-I与I-V组的PBLC内IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10mRNA的表达量严重不足,其中V-I组的表达量最低。加强免疫后V-I与I-V组的PBLC内IFN-γ与IL-10的表达失衡,IL-2和IL-4的表达缺乏,其中I-V组的细胞因子表达失衡和缺乏更严重。上述研究表明,CSF弱毒疫苗免疫前或免疫后感染PCV2均会影响机体的体液和细胞免疫应答水平,导致PBLC内细胞因子的表达严重抑制和紊乱。

关键词： PCV2 猪瘟弱毒疫苗抗体淋巴细胞增殖活性细胞因子

猪圆环病毒2型SD/2008株对仔猪的致病性

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中国兽医学报 2013年第4期33卷 538-544,565页

作者：杨芳陈立功李艳琴宋勤叶赵丹萍李潭清河北农业大学农业部动物疫病病原生物学华北区观测实验站河北保定071000

为了明确PCV2-SD/2008株对猪的致病性,将12头5周龄健康断奶仔猪随机分为PCV2组和对照组,每组6头。PCV2组经口鼻途径接种PCV2SD/2008株第3代细胞毒(105.61 TCID50/0.1mL),3mL/头,对照组经相同途径接种3mL细胞维持液。PCV2组中的1头猪从... 详细信息

为了明确PCV2-SD/2008株对猪的致病性,将12头5周龄健康断奶仔猪随机分为PCV2组和对照组,每组6头。PCV2组经口鼻途径接种PCV2SD/2008株第3代细胞毒(105.61 TCID50/0.1mL),3mL/头,对照组经相同途径接种3mL细胞维持液。PCV2组中的1头猪从感染后14d开始出现间断腹泻,一直到持续到试验结束。感染后第4、5周,感染组的周平均增重显著低于对照组(P学检查可见PCV2感染猪的淋巴结和脾脏内淋巴细胞缺失、单核/巨噬细胞和嗜酸性粒细胞浸润;间质性肺炎、坏死性肝炎和肾炎、小血管炎症等变化,并且感染后35d比感染后14d的病理变化更加严重。应用免疫组化方法在感染猪的肺、肝、脾、肾、淋巴结、小肠等多种组织中检测到了PCV2抗原,其中颌下淋巴结、肺、小肠中的阳性信号数与检出率最高。结果表明,PCV2SD/2008株对仔猪具有明显的致病性。

关键词：猪圆环病毒2型SD 2008株仔猪致病性抗原分布

PrP106-126诱导小胶质细胞BV-2抗氧化性能的变化

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中国兽医学报 2013年第12期33卷 1802-1807页

作者：李玉荣霍书英武现军陈立功刘静高玉红河北农业大学动物医学院农业部动物疫病病原生物学华北科学观测实验站河北保定071001

小胶质细胞活化是朊病的病理学特征之一。朊蛋白多肽PrP106-126具神经毒性,是研究异常腕蛋白(PrPSc)的理想工具。为探讨PrP106-126对小胶质细胞氧化压力的影响。本研究以小胶质细胞BV-2为细胞模型,PrP106-126作用48h,应用MTT和流式细胞... 详细信息

小胶质细胞活化是朊病的病理学特征之一。朊蛋白多肽PrP106-126具神经毒性,是研究异常腕蛋白(PrPSc)的理想工具。为探讨PrP106-126对小胶质细胞氧化压力的影响。本研究以小胶质细胞BV-2为细胞模型,PrP106-126作用48h,应用MTT和流式细胞仪检测细胞的活化情况,应用分子探针技术对细胞的氧化压力(reactive oxygen species,ROS)进行检测,并通过荧光定量RT-PCR对与ROS相关的酶的mRNA表达进行了测定。结果表明PrP106-126显著促进小胶质细胞BV-2的活化,并提高胞内的ROS水平;定量RT-PCR显示,PrP106-126显著降低细胞SOD-1(P0.05),对SOD-2、GPx、GR无显著性影响(P>0.05)。从分子水平初步阐明小胶质细胞ROS升高的机理。

关键词：朊病毒 PrP106—126 小胶质细胞BV-2 氧化压力抗氧化酶

基因缺失猪繁殖与呼吸综合征病毒河北株HB-Xt1的分离鉴定及其生长特性

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中国兽医杂志 2013年第10期49卷 41-43,I0001页

作者：赵驻军宋勤叶李曼河北农业大学动物医学院农业部动物疫病病原生物学华北区观测实验站河北保定071000

近年来河北省高致病性PRRS病例屡屡发生,为了弄清本地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）毒株的分子特征和生物学特性,本实验室从河北省某猪场疑似PRRS死亡仔猪的脾脏和淋巴结混合物内分离到的1株高致病性PRRSV,明确了其体外培养... 详细信息

近年来河北省高致病性PRRS病例屡屡发生,为了弄清本地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）毒株的分子特征和生物学特性,本实验室从河北省某猪场疑似PRRS死亡仔猪的脾脏和淋巴结混合物内分离到的1株高致病性PRRSV,明确了其体外培养特性,以便为进一步研究该毒株的致病性及相应的弱毒疫苗奠定基础.

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定河北省生长特性基因缺失 PRRSV 高致病性生物学特性

犬白细胞介素-7基因对犬细小病毒DNA疫苗的免疫增强作用

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中国农业科学 2012年第10期45卷 2058-2066页

作者：孙岩仲飞李秀锦王幸兴王璐贾启恒韩冬梅李振张峰潘红丽河北农业大学动物医学院基础兽医部/农业部动物疫病病原生物学华北区观测实验站燕山大学环境与化学工程学院生物工程系

【目的】白介素-7是动物体一种重要的多功能细胞因子,在促进B细胞、T细胞的形成和发育,在协同其它细胞因子提高机体免疫能力等方面发挥重要作用。本试验利用犬细小病毒VP2 DNA疫苗,在小鼠体内分析了犬白介素-7(cIL-7)基因的免疫增强作... 详细信息

【目的】白介素-7是动物体一种重要的多功能细胞因子,在促进B细胞、T细胞的形成和发育,在协同其它细胞因子提高机体免疫能力等方面发挥重要作用。本试验利用犬细小病毒VP2 DNA疫苗,在小鼠体内分析了犬白介素-7(cIL-7)基因的免疫增强作用。【方法】采用RT-PCR方法从犬脾淋巴细胞中扩增cIL-7基因,然后将cIL-7基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,分别构建成与Myc/His标签融合和非融合的cIL-7真核分泌型表达载体pcDNA-cIL7/MH和pcDNA-cIL7。由磷酸钙介导将pcDNA-cIL7/MH质粒转染HEK 293T细胞使其进行瞬时表达,以Western-blot检测构建的表达载体能否介导cIL-7基因在真核细胞中进行分泌表达。用已构建的VP2表达载体pcDNA-CD5-VP2与pcDNA-cIL7载体共免疫小鼠,并设pcDNA-CD5-VP2单免疫小鼠和pcDNA-cIL7单免疫小鼠作为对照。免疫后通过ELISA方法检测抗体水平,并通过淋巴细胞增殖实验和ELISA方法分别检测免疫后35 d小鼠脾脏淋巴细胞刺激指数和γ-干扰素的表达水平。【结果】本试验扩增的cIL-7基因序列与GenBank中犬的序列完全一致。构建的表达载体能够介导cIL-7基因在HEK293T细胞中进行分泌表达。动物免疫试验结果显示,cIL-7与VP2共免疫组小鼠血清的抗体滴度和中和抗体效价分别极显著和显著高于VP2单免疫组(P<0.01和P<0.05);共免疫组小鼠淋巴细胞刺激指数和γ-干扰素表达水平也显著高于VP2单免疫组(P<0.05)。【结论】cIL-7基因可增强小鼠对VP2 DNA疫苗的免疫应答反应。

关键词：犬IL-7 细小病毒 VP2基因 DNA疫苗

硫酸小檗碱对猪轮状病毒感染的IPEC-J2中TGF-β_1、EGFR、EGF、IGF_1 mRNA表达的影响

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畜牧兽医学报 2018年第10期49卷 2283-2291页

作者：徐环叶李妹玲陈立功王丽叶孟利佳崔欢张诚白晓王迎春董世山河北农业大学动物医学院保定071001 农业部动物疫病病原生物学华北科学观测实验站保定071001 邯郸市涉县农牧局邯郸056400

利用猪轮状病毒(PoRV)感染仔猪肠黏膜上皮细胞(IPEC-J2)建立损伤模型,研究硫酸小檗碱(BS)对PoRV感染的IPEC-J2中TGF-β_1、EGFR、EGF、IGF_1基因mRNA表达的影响。通过构建目的基因和内参基因的重组质粒,绘制荧光标准曲线,采用实时荧光定... 详细信息

利用猪轮状病毒(PoRV)感染仔猪肠黏膜上皮细胞(IPEC-J2)建立损伤模型,研究硫酸小檗碱(BS)对PoRV感染的IPEC-J2中TGF-β_1、EGFR、EGF、IGF_1基因mRNA表达的影响。通过构建目的基因和内参基因的重组质粒,绘制荧光标准曲线,采用实时荧光定量PCR法测定BS对PoRV感染的IPEC-J2中TGF-β_1、EGFR、EGF、IGF_1mRNA表达的影响。结果显示:PoRV能够显著引起IPEC-J2变性和坏死脱落,用BS药物组的IPEC-J2则生长基本良好;同时计算试验组相对于对照组各因子mRNA表达的差异倍数,显示BS有促进病毒损伤IPEC-J2中TGF-β_1和EGFR mRNA表达,抑制EGF和IGF_1mRNA表达的作用。可见在肠黏膜细胞损伤修复过程中,BS能够显著促进TGF-β_1和EGFR基因表达,但是抑制EGF和IGF_1基因表达,表明BS对各细胞因子在修复过程中发挥的作用和时间存在明显差异。BS可能通过调节损伤的肠黏膜上皮细胞修复因子的基因表达,进而调控肠上皮细胞的增殖、转化,对受损肠黏膜起到保护和修复作用。

关键词：硫酸小檗碱仔猪肠黏膜上皮细胞猪轮状病毒实时荧光定量PCR TGF-β1 EGFR EGF IGF1