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转录因子NbMYB1R1通过促进活性氧积累抑制病毒侵染

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中国农业科学 2024年第8期57卷 1490-1505页

作者：姜兴林于连伟付涵艾妞崔荧钧李好海夏子豪袁虹霞李洪连杨雪施艳河南农业大学植物保护学院河南省植物保护新技术推广协会河南省植物保护检疫站沈阳农业大学植物保护学院河南省粮食作物协同创新中心小麦玉米作物学国家重点实验室河南农业大学作物学博士后流动站

【背景】黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）是我国重要的检疫性植物病毒，严重降低了世界范围内蔬菜以及瓜类的产量。MYB蛋白家族庞大，功能多样，存在于所有真核生物中。大多数MYB作为转录因子控制植物... 详细信息

【背景】黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）是我国重要的检疫性植物病毒，严重降低了世界范围内蔬菜以及瓜类的产量。MYB蛋白家族庞大，功能多样，存在于所有真核生物中。大多数MYB作为转录因子控制植物的发育和代谢，并对植物应对生物和非生物胁迫反应起重要的调控作用。前期研究显示CGMMV侵染后可以显著上调寄主转录因子基因NbMYB1R1的表达。【目的】明确NbMYB1R1参与CGMMV侵染的机制，为CGMMV病害防控提供理论依据。【方法】运用MEGA 7.0构建系统进化树，对NbMYB1R1的氨基酸序列进行系统进化分析；通过构建NbMYB1R1的荧光表达载体，转化GV3101农杆菌后浸润本氏烟叶片，激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位；利用qRT-PCR技术分析NbMYB1R1在CGMMV侵染不同时期的转录水平及NbMYB1R1沉默烟草植株中活性氧（reactive oxygen species,ROS）相关基因的转录变化；通过沉默NbMYB1R1及下游调控基因NbAOX1a和NbAOX1b，分析NbMYB1R1及下游调控基因NbAOX1a和NbAOX1b在CGMMV侵染过程中的作用；瞬时过表达NbMYB1R1和NbMYB1R1关键氨基酸突变体，分析NbMYB1R1对CGMMV侵染的影响；使用台盼蓝染色以及DAB染色观察瞬时过表达NbMYB1R1造成的细胞死亡是否与程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）以及ROS的积累有关；运用酵母双杂交技术验证NbMYB1R1是否与CGMMV相关蛋白互作。【结果】系统进化树分析表明，NbMYB1R1属于1R MYB大类并与多种烟草的MYB转录因子同源性极高；亚细胞定位结果显示NbMYB1R1定位于细胞核；在CGMMV侵染的烟草植株中，NbMYB1R1的转录水平对比健康植株有明显变化，在CGMMV侵染8、12 d时NbMYB1R1的转录水平显著上调；在沉默内源基因NbMYB1R1的植株上接种CGMMV,3 d后NbMYB1R1沉默植株系统叶出现斑驳、卷曲症状，而对照植株在3.5 d时才出现症状；同时CGMMV CP mRNA水平和蛋白水平检测结果也表明沉默NbMYB1R1可以有效促进CGMMV的积累；在本氏烟叶片瞬时过表达NbMYB1R1及其突变体3 d时检测CGMMV蛋白水平表达量，结果显示过表达NbMYB1R1可以有效抑制CGMMV的侵染，DNA结合结构域缺失后会减轻NbMYB1R1对CGMMV的抑制；台盼蓝和DAB染色结果表明，在瞬时过表达NbMYB1R1蛋白后导致ROS积累并引起细胞死亡；在沉默内源基因NbMYB1R1的植株叶片上检测ROS相关基因的转录水平，发现交替氧化酶基因AOX1a、AOX1b转录水平显著上调；在沉默内源基因NbAOX1a和NbAOX1b的植株上接种CGMMV,4 d后NbAOX1a和NbAOX1b沉默植株系统叶出现斑驳、卷曲症状，而对照植株在3.5 d时就出现症状；同时CGMMV CP mRNA水平和蛋白水平检测结果也表明沉默NbAOX1a和NbAOX1b可以有效抑制CGMMV的积累；酵母双杂交结果显示NbMYB1R1不与CGMMV编码蛋白直接相互作用。【结论】随着CGMMV侵染，防御相关基因NbMYB1R1表达上调，从而抑制下游基因AOX1a、AOX1b的表达并激活细胞内产生ROS抑制病毒侵染，但NbMYB1R1不是通过与CGMMV病毒蛋白直接互作而产生此作用。由此可见，NbMYB1R1在CGMMV侵染过程中发挥了重要作用。

关键词：黄瓜绿斑驳花叶病毒 Nb MYB1R1 转录因子致病机制活性氧

大豆症青相关病毒CP蛋白的抗血清的制备及检测应用

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植物病理学报 2024年第3期54卷 555-560页

作者：张玉阳李庆伦于连伟谢莉娜姜兴林王贺李洪连施艳杨雪袁虹霞河南农业大学植物保护学院植物病理学系郑州450002 河南农业大学作物学博士后流动站郑州450002

大豆症青相关病毒(soybean stay-green associated virus,SoSGV)是新发现的一种可以引起大豆症青的植物病毒。大豆症青在中国大豆产区广泛发生流行,严重威胁大豆产业的健康发展,因此建立快速有效的SoSGV检测方法对于大豆症青的监测和防... 详细信息

大豆症青相关病毒(soybean stay-green associated virus,SoSGV)是新发现的一种可以引起大豆症青的植物病毒。大豆症青在中国大豆产区广泛发生流行,严重威胁大豆产业的健康发展,因此建立快速有效的SoSGV检测方法对于大豆症青的监测和防控具有重要意义。本研究依据SoSGV外壳蛋白(coat protein,CP)基因的核苷酸序列设计引物,从发病大豆中扩增得到786 bp的目的基因,将其克隆到原核表达载体pET-28a上,获得重组载体pET-28a-CP。在大肠杆菌Rosseta菌株中经过IPTG诱导表达,获得30 kDa的蛋白,与预期SoSGV CP大小一致。以纯化后SoSGV CP蛋白为抗原,免疫小鼠,制备了特异性SoSGV CP抗血清。In-ELISA检测结果表明,血清效价≥3.2×10~4。Western blot分析表明所制备的SoSGV CP抗体可以在SoSGV侵染的烟草叶片和大豆症青发病的大豆叶片中检测到30 kDa的特异性条带。本研究为SoSGV引起的大豆症青的快速检测提供了重要的技术支撑。

关键词：大豆症青相关病毒大豆症青外壳蛋白原核表达抗血清

热驯化对禾谷缢管蚜杀虫剂敏感性及解毒酶的影响

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应用昆虫学报 2024年第4期 845-853页

作者：李兴烨李玉婷沈阳农业大学植物保护学院

【目的】明确热驯化（27℃）对禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi杀虫剂敏感性及其体内解毒酶的影响。【方法】采用带虫浸叶法、酶活力测定和实时荧光定量PCR分别测定杀虫剂的敏感性、解毒酶活力和基因表达量。【结果】热驯化后禾谷缢管蚜对... 详细信息

【目的】明确热驯化（27℃）对禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi杀虫剂敏感性及其体内解毒酶的影响。【方法】采用带虫浸叶法、酶活力测定和实时荧光定量PCR分别测定杀虫剂的敏感性、解毒酶活力和基因表达量。【结果】热驯化后禾谷缢管蚜对6种杀虫剂的敏感性改变，其中啶虫脒的相对毒力指数最高（4.59）。增效剂试验结果显示，在常温（CK）和热驯化（HA）品系中顺丁烯二酸二乙酯（Diethyl maleate,DEM）对啶虫脒无明显增效作用，而胡椒基丁醚（Piperomylbutoxide,PBO）对啶虫脒增效作用显著，增效比分别为3.95和22.41，但磷酸三苯酯（Triphenyl phosphate,TPP）仅在热驯化品系中对啶虫脒增效作用显著，增效比为4.82。解毒酶活力测定表明，禾谷缢管蚜热驯化品系中细胞色素P450(P450)酶活性显著高于常温品系。定量分析显示，解毒酶基因CarE(2.1,P=0.037)、GSTO(1.7,P=0.035)、CYP6CY7(7.0,P=0.003)和CYP6CZ1(1.9,P=0.013)表达量在热驯化品系中显著上调，而CYP6CJ1(0.40,P=0.026)在热驯化品系中显著下调。【结论】热驯化显著提高禾谷缢管蚜对啶虫脒的敏感性以及PBO和TPP对啶虫脒的增效作用；热驯化显著提高禾谷缢管蚜体内解毒酶P450活性，且显著诱导5个解毒酶基因的差异表达。

关键词：禾谷缢管蚜热驯化毒力测定增效剂解毒酶

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他汀类抑制剂对大豆疫霉的生物活性及与靶标互作分析

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中国油料作物学报 2024年

作者：徐继涛李秀黄启凤高祯李欣航王瑞龙杨新宇沈阳农业大学植物保护学院

大豆疫霉Phytophthora sojae引起的大豆根腐病是生产中的严重土传病害之一。本文通过菌丝生长速率法测定氟伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀三种抑制剂对大豆疫霉的生物活性；评价了三种抑制剂对大豆疫霉孢子囊、游动孢子、卵孢子和致病能... 详细信息

大豆疫霉Phytophthora sojae引起的大豆根腐病是生产中的严重土传病害之一。本文通过菌丝生长速率法测定氟伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀三种抑制剂对大豆疫霉的生物活性；评价了三种抑制剂对大豆疫霉孢子囊、游动孢子、卵孢子和致病能力的影响；通过分子对接预测三种抑制剂与大豆疫霉靶标PsHMGR的结合模式。结果表明：在40～200μg/mL浓度处理下，三种抑制剂均抑制大豆疫霉菌丝生长；在40μg/mL浓度处理下，抑制大豆疫霉孢子囊和卵孢子产量、休止孢萌发、促进游动孢子休止，其中阿托伐他汀抑制大豆疫霉产孢活性较氟伐他汀和辛伐他汀强；氟伐他汀和辛伐他汀抑制大豆疫霉菌丝生长活性较阿托伐他汀强；在40μg/mL浓度下，三种物质使致病能力平均降低23.9%、39.6%和69.7%。三种抑制剂与靶标PsHMGR通过疏水作用、氢键、卤键、π-π堆积和π-阳离子等形成互作。

关键词：大豆疫霉大豆根腐病他汀类抑制剂生物活性分子对接

泛素化修饰关键酶在植物抗逆反应中的功能研究进展

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生物技术通报 2024年第4期40卷 1-11页

作者：郭慧妍董雪安梦楠夏子豪吴元华沈阳农业大学植物保护学院沈阳110866

泛素化修饰是植物蛋白质翻译后修饰的重要组成部分,通过对蛋白质的选择性降解,参与调控植物生长发育和多种逆境胁迫反应。泛素化修饰反应由3种关键酶协同作用完成。泛素分子通过与泛素激活酶的巯基酯键连接从而被激活,被激活的泛素分子... 详细信息

泛素化修饰是植物蛋白质翻译后修饰的重要组成部分,通过对蛋白质的选择性降解,参与调控植物生长发育和多种逆境胁迫反应。泛素化修饰反应由3种关键酶协同作用完成。泛素分子通过与泛素激活酶的巯基酯键连接从而被激活,被激活的泛素分子再与泛素结合酶形成复合体,最后在泛素连接酶的作用下完成与靶蛋白的结合。随着蛋白质组学测序技术的不断发展,人们对泛素化修饰的研究更加普遍和深入。大量被泛素化修饰的蛋白及其修饰位点被鉴定出来,有助于深入了解蛋白质的调控机制,进一步解析蛋白质的功能。本文介绍了泛素-蛋白酶体系统的反应过程,泛素化修饰关键酶的结构、数量及分类,并重点围绕泛素激活酶、泛素结合酶和泛素连接酶在植物应对非生物及生物胁迫中的功能研究开展论述,同时也对植物泛素化修饰关键酶的功能研究所面临的问题进行总结,并对泛素化修饰与其他修饰之间的串扰进行了讨论与展望,对于泛素化修饰在植物逆境胁迫领域的深入研究具有重要意义。

关键词：泛素化修饰泛素激活酶泛素结合酶泛素连接酶非生物胁迫生物胁迫

诱导子对黄曲霉生物合成乌头碱的诱导作用研究

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中国生物防治学报 2024年第2期40卷 469-476页

作者：王凯袁希元张明月田硕何璐沈阳农业大学植物保护学院沈阳110866

为探索不同诱导子对生物合成乌头碱产量的影响,本研究在黄曲霉Aspergillus flavus的液体发酵过程中分别加入金属诱导子(Co^(2+)、Ag^(+)和Cu^(2+))和化学诱导子(茉莉酸甲酯、水杨酸和硝普钠),以及酵母提取物、种子提取物和共生细菌发酵... 详细信息

为探索不同诱导子对生物合成乌头碱产量的影响,本研究在黄曲霉Aspergillus flavus的液体发酵过程中分别加入金属诱导子(Co^(2+)、Ag^(+)和Cu^(2+))和化学诱导子(茉莉酸甲酯、水杨酸和硝普钠),以及酵母提取物、种子提取物和共生细菌发酵液等生物诱导子进行诱导试验。试验结果表明,Ag^(+)、Cu^(2+)和Co^(2+)都对乌头碱的生物合成有促进作用,其中Ag^(+)浓度为50μmol/L时,乌头碱产量与对照组相比提高了10倍。化学诱导子MJ和SA诱导效果显著,其中100μmol/L MJ的加入能显著提高乌头碱的产量,产量为20.74 mg/L,为对照组的11倍。而酵母提取物、种子提取物和共生细菌发酵液对乌头碱的产量诱导效果均不显著。本论文探究了不同诱导子对黄曲霉生物合成乌头碱的诱导作用,进而明确不同诱导子及不同诱导浓度对乌头碱生物合成产量的影响。

关键词：诱导子黄曲霉菌乌头碱生物合成

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丁子香酚对人参黑斑病菌的抑制活性及其作用机制研究

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农药学学报 2024年第3期26卷 619-624页

作者：郭鸶怡马榕李思奇李自博朴静子周如军沈阳农业大学植物保护学院沈阳110866

黑斑病是人参上最重要的真菌病害之一,严重影响人参的产量与品质。本文采用菌丝生长速率法和孢子萌发法,研究了丁子香酚对人参黑斑病菌的抑制活性,并评价了对病菌相对电导率、丙二醛含量及抗氧化酶活性的影响。结果表明:丁子香酚对人参... 详细信息

黑斑病是人参上最重要的真菌病害之一,严重影响人参的产量与品质。本文采用菌丝生长速率法和孢子萌发法,研究了丁子香酚对人参黑斑病菌的抑制活性,并评价了对病菌相对电导率、丙二醛含量及抗氧化酶活性的影响。结果表明:丁子香酚对人参黑斑病菌的抑制作用显著,0.30 mg/mL时,对菌丝生长和孢子萌发的抑制率分别高达90.14%和94.40%;丁子香酚处理病原菌菌丝12 h后,其相对电导率和丙二醛(MDA)含量明显升高,分别为66.18%和1.83nmol/g;抗氧化酶过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性峰值出现在24 h,分别为379.80、38.80和305.10 U/g。丁子香酚能够破坏细胞膜完整性、增强膜脂质过氧化反应、促使活性氧大量积累,从而诱导细胞死亡,发挥抑菌功能。本研究可为丁子香酚在人参黑斑病绿色防控中的合理应用提供参考,同时为人参黑斑病防控增加了用药选择。

关键词：丁子香酚人参黑斑病菌抑菌活性生理生化机理

淡紫拟青霉·哈茨木霉微胶囊剂的制备及对苹果轮纹病菌的抑制作用

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中国生物防治学报 2024年第2期40卷 388-398页

作者：王凯张开娇李洋洋杨大杰殷志鹏何璐沈阳农业大学/植物保护学院沈阳110161

为延长微生物菌剂货架期,提高其在环境中存活率,保证其药效,本研究采用复凝聚法分别制备淡紫拟青霉和哈茨木霉微胶囊剂。微胶囊剂以哈茨木霉菌和淡紫拟青霉菌为芯材,明胶和阿拉伯胶为壁材,通过响应面法确定了微胶囊的最佳包埋条件。淡... 详细信息

为延长微生物菌剂货架期,提高其在环境中存活率,保证其药效,本研究采用复凝聚法分别制备淡紫拟青霉和哈茨木霉微胶囊剂。微胶囊剂以哈茨木霉菌和淡紫拟青霉菌为芯材,明胶和阿拉伯胶为壁材,通过响应面法确定了微胶囊的最佳包埋条件。淡紫拟青霉微胶囊成囊条件为:明胶和阿拉伯胶各2.5%(40 mL)为壁材溶液、孢子浓度1×10^(9)cfu/m L、固化pH和温度分别为:4℃和40℃、搅拌速度500 r/min,最终包埋率达(85.44±0.22)%,中位粒径为23.62μm。4℃下贮存720 d,孢子存活率为95.23%;哈茨木霉成囊条件为:明胶和阿拉伯胶各1.6%(40 mL)为壁材溶液、孢子浓度1×10^(9)cfu/mL、固化pH和温度分别为:4.2℃和40℃、搅拌速度500 r/min,包埋率达92.17%,中位粒径为27.19μm。25℃下的存活率为92.11%。4℃下贮存720 d后,孢子存活率为96.25%。将制备的复合微胶囊剂用于苹果轮纹病的室内离体测试,当哈茨木霉微胶囊与淡紫拟青霉微胶囊以浓度6:4的比例进行混合后,抑制效果可达60.0%。

关键词：微胶囊淡紫拟青霉哈茨木霉苹果轮纹病

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草地贪夜蛾钙粘蛋白重复区片段的克隆表达及时空分析

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环境昆虫学报 2024年第5期46卷 1171-1180页

作者：王靖怡李颖顾俊文张珀瑞祖尔东·加拉力丁张琪沈阳农业大学植物保护学院沈阳110866

为探明钙粘蛋白在草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda中不同发育阶段、不同组织中的表达水平,进一步探索草地贪夜蛾钙粘蛋白作为Cry毒蛋白受体的功能性作用,本研究克隆并原核表达了草地贪夜蛾钙粘蛋白(Cadherin)SfCR10-12片段,以及SfCR10,... 详细信息

为探明钙粘蛋白在草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda中不同发育阶段、不同组织中的表达水平,进一步探索草地贪夜蛾钙粘蛋白作为Cry毒蛋白受体的功能性作用,本研究克隆并原核表达了草地贪夜蛾钙粘蛋白(Cadherin)SfCR10-12片段,以及SfCR10,SfCR11,SfCR123个分段重复区片段,并对其时空表达模式进行了分析。结果表明:(1)草地贪夜蛾与甜菜夜蛾Spodoptera exigua钙粘蛋白序列高度相似达80.46%。(2)获得的SfCR10-12序列(GenBank登录号:OP547784)长度为933 bp,开放阅读框810 bp,编码268个氨基酸。(3)SfCR10-12基因在不同发育阶段均有表达,在5龄和6龄幼虫中表达量最高,此外在草地贪夜蛾中肠部位有一定的表达,但是在头部和体壁表达量较低。(4)经原核表达和纯化后获得了分子大小约为34 kDa、9.57 kDa、14.11 kDa和11.06 kDa的SfCR10-12、SfCR10、SfCR11和SfCR12蛋白片段。本研究结果为深入研究草地贪夜蛾钙粘蛋白不同重复区介导Bt Cry毒素对草地贪夜蛾的作用机制提供了基础。

关键词：草地贪夜蛾钙粘蛋白克隆蛋白表达时空表达