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肠道微生物培养的研究进展及应用

微生物学报 2023年第3期63卷 881-899页

作者：刘莎陈从英江西农业大学省部共建种猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室江西南昌330045

肠道中栖居着组成复杂、功能多样的微生物群,这些微生物群在宿主免疫、营养吸收、代谢调节等方面发挥着重要作用。随着测序技术的快速发展,肠道微生物研究通过16S rRNA基因测序和宏基因组测序产生了大量的数据,其中许多未组装的序列成... 详细信息

肠道中栖居着组成复杂、功能多样的微生物群,这些微生物群在宿主免疫、营养吸收、代谢调节等方面发挥着重要作用。随着测序技术的快速发展,肠道微生物研究通过16S rRNA基因测序和宏基因组测序产生了大量的数据,其中许多未组装的序列成为微生物“暗物质”。近年来,不少研究利用多种不同微生物分离培养方法,结合高通量鉴定技术,从人、小鼠、猪肠道中分离了大量的微生物,丰富了菌株资源,为解析微生物“暗物质”以及后续肠道微生物功能和应用研究提供了基础和保障。尽管微生物的可培养性受到多种因素的影响,大部分微生物尚处于“未培养”的状态,但无论是病因研究还是生理和遗传特征的解析都离不开微生物实体资源的获取。肠道微生物的分离培养对微生物研究从关联分析向菌群功能验证、因果机制解析和功能菌株开发的深入研究具有重要意义。本文旨在探讨和综述影响微生物可培养性的因素,总结回顾肠道微生物的培养方法并阐述肠道微生物培养研究的进展,以期为肠道微生物培养研究提供新的视角。

关键词：肠道微生物分离培养培养方法菌株资源开发

慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术编辑PFF细胞BMPR-IB基因及BMPs信号通路重要基因表达分析

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中国农业科学 2018年第7期51卷 1378-1389页

作者：杨强徐盼蒋凯乔传民任军黄路生幸宇云江西农业大学猪遗传改良与养殖技术省部共建国家重点实验室

【目的】利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得编辑BMPR-IB(bone morphogenetic protein receptor,type IB)基因的猪胎儿成纤维细胞(pig fetal fibroblasts,PFF),并研究该基因被编辑后对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)信号通路中重要功能基因表达的影响。【方法】针对猪的BMPR-IB基因的外显子8,利用在线软件http://***获得了21条sg RNAs(single-guide RNAs)序列;得分最高的sg RNA与互补序列(包含接头)退火成双链后连接入线性化的lenti CRISPR v2质粒以获得打靶质粒,打靶质粒与包装质粒ps PAX2和p CMV-VSV-G按5﹕4﹕1质量比混合后通过293T细胞包装慢病毒。慢病毒溶液经0.45μm滤膜回收后与PFF细胞培养液按照1﹕1混合、并加入聚凝胺(polybrene)至终浓度为6μg·m L-1,在1 000 g转速、32℃下离心感染PFF细胞1 h。感染3 d后,细胞在含3.5μg·m L-1嘌呤霉素的培养液中筛选6—7 d,最终获得编辑BMPR-IB基因的PFF细胞克隆群。针对编辑(打靶)细胞,首先通过T7E1酶切检测突变体,初步判断打靶效率,再通过PCR、PCR-TA克隆分析细胞的编辑及脱靶情况。利用RT-PCR检测编辑和对照组细胞中与BMPs信号通路相关的重要基因的表达情况;Western blotting检测编辑细胞与对照组细胞中BMPR-IB基因的蛋白表达量。利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测编辑细胞及对照组细胞的增殖能力。【结果】T7E1酶切及PCR测序均证实PFF细胞成功打靶目标DNA区域;TA克隆测序表明目标区域发生了插入与缺失突变,突变率为70%。针对20个潜在的脱靶位点的TA克隆测序结果表明,仅1个位点出现了10%(2/20)的脱靶情况。RT-PCR结果显示,打靶细胞与对照组细胞相比,BMPR-IB、Cylin D2、Cdk2和Bcl2基因的表达量均极显著下降(P0.05);打靶PFF的增殖能力不受嘌呤霉素筛选的影响。【结论】慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术可针对PFF细胞快速高效地实现基因编辑;在BMPR-IB基因编辑细胞中,BMPs通路重要功能基因的表达量显著下降,该基因对PFF细胞的增殖有重要的调节作用。

关键词：慢病毒 CRISPR/Cas9 猪胎儿成纤维细胞 BMPR-IB 脱靶细胞增殖

CRISPR/Cas9基因组编辑技术在农业动物中的应用

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遗传 2016年第3期38卷 217-226页

作者：幸宇云杨强任军江西农业大学省部共建猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室南昌330045

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR associated proteins)是在细菌和古细菌中发现的一种用来抵御病毒或质粒入侵的获得性免疫系统。目前已发现的CRISPR/Cas系统包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型,其中Ⅱ型系统的组成较简单,由其改造成的CRISPR/Cas9技术已成为一种高效的基因组编辑工具。自2013年CRISPR/Cas9技术成功用于哺乳动物基因组定点编辑以来,应用该技术进行基因组编辑的报道呈现出爆发式的增长。农业动物不仅是重要的经济动物,也是人类疾病和生物医药研究的重要模式动物。本文综述了CRISPR/Cas9技术在农业动物中的研究和应用进展,简述了该技术的脱靶效应及减少脱靶的主要方法,并展望了该技术的应用前景。

关键词： CRISPR/Cas9 基因组编辑农业动物脱靶

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高尿酸血症和痛风的遗传学研究进展

遗传 2016年第4期38卷 300-313页

作者：郑敏麻骏武江西农业大学省部共建猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室南昌330045

痛风是由高尿酸血症引发的一种常见炎性关节炎,受遗传因素和环境因素共同作用。早期研究表明,PRPS1和HPRT1等单基因稀有突变会引起嘌呤合成代谢紊乱,从而引发高尿酸血症和痛风。近年来,全基因组关联分析(Genome-wide association studie... 详细信息

痛风是由高尿酸血症引发的一种常见炎性关节炎,受遗传因素和环境因素共同作用。早期研究表明,PRPS1和HPRT1等单基因稀有突变会引起嘌呤合成代谢紊乱,从而引发高尿酸血症和痛风。近年来,全基因组关联分析(Genome-wide association studies,GWAS)已检出多个导致高尿酸血症和痛风的易感位点及相关候选基因。其中SLC2A9、SLC22A11和SLC22A12基因功能缺失性突变可引起遗传性低尿酸血症,而过表达则会加强尿酸的重吸收。ABCG2、SLC17A1和SLC17A3基因功能缺陷型变异会降低肾脏和肠道对尿酸的排泄量。因此,诱发尿酸排泄障碍(高重吸收和低排泄)的基因变异是影响高尿酸血症和痛风的主要遗传因素。另外,抑制-激活生长因子系统、转录因子、细胞骨架以及基因和环境的互作等因素也一定程度影响血液尿酸水平。在中国汉族人群中,两个新发现的易感基因RFX3和KCNQ1可能造成免疫应答受损和胰岛B细胞功能缺陷,从而直接或间接引起高尿酸酸血症和痛风。本文系统综述了高尿酸血症和痛风的遗传学研究,以促进人们对高尿酸血症和痛风发病机理的理解。

关键词：痛风高尿酸血症尿酸嘌呤遗传因素易感位点

里岔黑猪和巴里杂交猪母猪100kg体重日龄校正方法的比较

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中国农业科学 2023年第6期56卷 1177-1188页

作者：崔登帅熊三亚郑浩李龙云余乃标黄智勇肖石军郭源梅江西农业大学省部共建种猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室江西山下华系种猪养殖有限公司

【目的】比较3种达100 kg体重日龄(D100kg)的校正系数CF的校正效果，为种猪场根据自身实际情况选择合适的D100kg校正系数CF提供参考。【方法】以里岔黑猪群体及其与巴克夏杂交1代（巴里1代）和2代（巴里2代）共1 344头猪只为研究对象，... 详细信息

【目的】比较3种达100 kg体重日龄(D100kg)的校正系数CF的校正效果，为种猪场根据自身实际情况选择合适的D100kg校正系数CF提供参考。【方法】以里岔黑猪群体及其与巴克夏杂交1代（巴里1代）和2代（巴里2代）共1 344头猪只为研究对象，利用其生长肥育期体重和日龄的数据，以始测体重≥25 kg、终测体重在80—125 kg、过始测点和终测点直线的斜率在群体平均斜率±2个标准差之内等标准进行质控，然后按照下面描述的三种方法估计里岔黑猪、巴里1代、巴里2代以及它们混合群体达100 kg校正系数CF，并评估它们的校正效果。一是回归校正系数(CFreg)：利用测定期间个体i的体重和日龄数据，拟合体重对日龄的一元回归方程，把其斜率记b1i；然后利用它终测点和原点（日龄和体重均为0）作一条直线，把其斜率记为b2i;b1i/b2i的平均数就是CFreg。二是两点校正系数(CF2point)：利用个体i初测点和终测点作一条直线，得到斜率b1i，斜率b2i及CF2point计算方法与CFreg计算方法相同。三是单点校正系数(CF1point)：拟合所有个体的终测体重对终测日龄的一元回归方程，得到斜率b1；第二条直线斜率与CFreg相同；b1/b2i的平均数就是CF1point。分别将CFreg、CF2point和CF1point代入校正公式，计算出相应的***、D100kg.2point和D100kg.1point。根据前面拟合的日龄对体重的一元回归，计算个体达100kg的回归日龄(***)，并计算它与其他D100kg的相关系数和离差。根据相关系数和离差的大小，评估3种方法的优劣。为比较3种校正系数的群体适用性，用某个群体的CF去校正其他3个群体的D100kg，并根据其校正日龄与该群体***相关系数的高低来评估其群体适用性的优劣。通过分析终测体重和校正误差之间的关系，探究终测体重对D100kg的影响。考虑单点校正误差与终测体重之间存在很强的线性关系，利用终测体重对D100kg.1point进行二次校正，以提高单点校正的准确性。【结果】质控后共1 181头母猪用于后续分析。在同一群体中，CFreg和CF2point的值相近，它们极显著大于CF1point。***和D100kg.2point与***很接近，相关系数均大于0.98，说明这两种方法的校正效果很好。D100kg.1point与***的差异较大，相关系数仅为0.89，校正效果较差。CFreg和CF2point的群体适应性很好，均可用于其他群体D100kg的校正。CF1point的群体适应性较差，不宜用于其他群体D100kg的校正。4个群体中，终测体重离目标体重（100 kg）越远，***校正误差越大，D100kg.2point校正误差没有明显的变化。D100kg.1point的误差与终测体重均存在极显著的负相关，r分别为-0.9812、-0.9627、-0.9786和-0.9352。经过二次校正后，CF1point校正效果有显著提升，但与CFreg校正效果仍有较大差距，优先选择CFreg。【结论】CFreg和CF2point的校正效果和群体适应性都很好，可用于生产实践。单点校正系数(CF1point)的校正效果不理想，不宜用于生产实践。在校正D100kg时，可以根据猪只的数据量，采用合适的方法，以提高估计准确性，降低估计误差。

关键词：里岔黑猪达100 kg体重日龄校正系数CF 回归日龄

里岔黑猪和巴里杂交猪达100 kg体重日龄校正系数研究

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中国农业科学 2020年第12期53卷 2493-2501页

作者：郑浩涂金敏熊秀萍张则凯李龙云黄黎斌黄智勇肖石军郭源梅江西农业大学省部共建种猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室江西山下投资有限公司

【目的】估计里岔黑猪及其与巴克夏杂交猪(巴里猪)达100 kg体重日龄(D100)的校正系数CF和A,并比较两种校正系数的校正效果,为里岔黑猪和其他地方猪种D100的估计提供参考。【方法】以554头里岔黑猪、941头巴里1代和755头巴里2代猪为研究... 详细信息

【目的】估计里岔黑猪及其与巴克夏杂交猪(巴里猪)达100 kg体重日龄(D100)的校正系数CF和A,并比较两种校正系数的校正效果,为里岔黑猪和其他地方猪种D100的估计提供参考。【方法】以554头里岔黑猪、941头巴里1代和755头巴里2代猪为研究对象,利用润农性能测定系统,收集它们肥育期的体重和日龄数据。根据始测日龄≥60d、始测体重≥25 kg等标准对数据进行质控,质控后的数据用于CF和A的估计。CF是两条直线斜率的比值,其中分子是体重对日龄回归直线的斜率,分母是经过终测点(终测日龄和终测体重)和原点(日龄和体重均为0)直线的斜率。A是体重对日龄一元回归方程的截距,通过拟合体重对日龄的一元回归方程直接得到。校正系数估计出来后,用方差分析来检验性别和群体对校正系数的影响,并把估计的CF和A分别代入各自的校正公式,分别计算D100,即CF和A的校正日龄(D100CF和D100A)。通过t检验,比较D100CF和D100A之间是否存在显著差异,并计算它们之间的相关系数。然后利用每个个体的体重和日龄,分别建立日龄对体重的回归方程,并根据各自的回归方程计算达100 kg体重的回归日龄(D100reg)。通过计算D100CF和D100A与D100reg之间的相关系数及其与D100reg差值的平均数和标准差来比较CF和A的校正效果。最后用另外2个群体的校正系数来校正某个群体,计算D100CF和D100A与该群体D100reg的相关系数来评估校正系数的通用性。【结果】由于性别和群体显著影响校正系数,因此需要分性别和分群体估计校正系数。里岔黑猪、巴里1代和巴里2代阉公猪(母猪)的校正系数CF分别为1.426(1.346)、1.340(1.389)和1.372(1.380),A分别为60.65(54.15)、49.92(57.00)和54.25(57.53)。D100CF和D100A之间差异不显著(P=0.3071),它们之间的相关系数为0.9998(P0.05)。用另外2个群体的校正系数来校正某个群体,D100CF和D100A与该群体D100reg的相关系数均≥0.9793(P国家生猪产业体系使用的CF和A有较大差异。CF和A的校正效果没有显著差异,在适当的结测体重范围内,它们的校正效果都非常好。在研究的3个群体中,用另外2个群体的校正系数来校正某个群体的校正效果也非常好,说明里岔黑猪D100的校正系数可以为其他地方猪种D100的估计提供参考。

关键词：里岔黑猪达100kg体重日龄校正系数CF 校正系数A

编辑PFF细胞的P53基因及其信号通路中重要基因的表达分析

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畜牧兽医学报 2019年第11期50卷 2215-2225页

作者：乔传民刘为伟杨强江浩筠黄路生幸宇云江西农业大学省部共建猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室

旨在编辑PFF细胞的P53基因,并分析其信号通路中重要基因的表达。本研究首先将设计好的两条sgRNAs装载入PX459 V2.0质粒中,订购两条携带241W、242S、266H突变位点的单链寡核苷酸(SSODN)作为供体DNA(一条带有前两个突变,另一条带有266H突... 详细信息

旨在编辑PFF细胞的P53基因,并分析其信号通路中重要基因的表达。本研究首先将设计好的两条sgRNAs装载入PX459 V2.0质粒中,订购两条携带241W、242S、266H突变位点的单链寡核苷酸(SSODN)作为供体DNA(一条带有前两个突变,另一条带有266H突变),利用电转法将打靶载体和SSODNs共转染到PFF细胞中,筛选单克隆细胞后检测打靶区域的编辑情况,并检测编辑细胞中信号通路重要基因(MDM2、FAS、WIP1、BAX、P21和DD1α)的表达及检测编辑细胞的增殖能力。结果表明,在筛选到的107个单克隆细胞中,分别有4个为两个位点(R241和R242)纯合子和杂合子编辑型,1个为R266位点纯合子编辑型、63个纯合子缺失型、11个序列倒置型、11个纯合子点插入型、3个杂合子缺失型(或混合克隆)和10个野生型,未获得3个位点同时被编辑的细胞。RT-PCR和Western blotting结果显示,纯合子缺失型细胞中P53几乎不表达;RT-PCR检测显示,在纯合子缺失型细胞和双位点编辑型细胞中MDM2、FAS、BAX、P21基因的表达量极显著下降(P部分重要基因的表达,本试验所获得双位点编辑细胞,为下一步研制P53点编辑模型猪奠定了重要的基础。

关键词： CRISPR-Cas9 猪 P53 单链寡核苷酸基因编辑

整合数字基因表达谱与全基因组关联分析鉴定猪血液性状候选基因

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中国农业科学 2016年第2期49卷 348-360页

作者：徐盼张震章峰杨斌段艳宇江西农业大学省部共建猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室

【目的】整合数字基因表达谱与全基因组关联分析鉴定白色杜洛克×二花脸F资源群体的血液性状候选基因。【方法】白色杜洛克×二花脸F资源群体在(240±3)d屠宰,收集血液于抗凝管中进行血常规检测。利用Illumina 60K SNP芯片对1 020头F资... 详细信息

【目的】整合数字基因表达谱与全基因组关联分析鉴定白色杜洛克×二花脸F资源群体的血液性状候选基因。【方法】白色杜洛克×二花脸F资源群体在(240±3)d屠宰,收集血液于抗凝管中进行血常规检测。利用Illumina 60K SNP芯片对1 020头F资源群体进行基因分型。剔除基因型检出率5%的个体。检出率<95%、次等位基因频率<5%、哈代-温伯格检验(HWE)P<5×10、与性染色体连锁疑似常染色体的SNP被筛除。利用Illumina GA II测序仪测序对502头F资源群体的肝脏进行数字基因表达谱测序。测序得到的原始数据经过滤获得清洁标签后与参考标签数据库比对,将能唯一比对到参考基因序列的清洁标签数量进行标准化处理以获得标准化的基因表达量。每个转录本的表达水平进一步转化为lg2值。在少于20%的个体中表达的转录本被滤去。表型性状和基因表达性状使用R程序包中Gen ABEL内polygentic功能进行性别、批次和亲缘关系的校正。其残差使用R程序包中斯皮尔曼系数评估基因表达水平与表型数据的关联性,设定保守阈值P<5×10时调整多重检验。将检测到的表达数量性状位点(eQTL)及其对应基因根据其位置相对照的关系进行绘图。搜寻前期GWAS最高点5.0 Mb区域内eQTL结合GWAS结果进行综合分析。Gene Ontology&KEGG pathway富集分析使用在线工具DAVID。基因共表达网络使用在线工具Gene MANIA进行构建。【结果】白色杜洛克×二花脸F资源群体中502个个体的20 108个肝脏转录本通过了质检。当P<5×10时鉴别到与血红蛋白(HGB)、红细胞数目(RBC)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)和白细胞数目(WBC)关联的转录本共259个。有34个转录本与一个以上表型关联。用上述血细胞性状关联的转录本进行eQTL定位,当阈值P<10时得到304个eQTL,每个转录本映射到1—6个eQTL,其中有35个顺式eQTL,120个反式eQTL。MCH和MCV的顺式eQTL位置重叠位于8号染色体。7号染色体存有数量最多的eQTL,其中多数为反式eQTL。通过eQTL定位确定了KIT为候选基因。Gene Ontology&KEGG pathway富集分析鉴别到与红细胞性状相关的基因KIT、PSEN2和TFRC,与白细胞性状相关的基因THBS1和CYR61。通过整合前期GWAS数据及eQTL定位并建立基因共表达网络,鉴定到与白细胞性状相关的基因RPS10。【结论】利用基于白色杜洛克×二花脸F资源群体的eQTL定位并结合前期GWAS数据,鉴别到与红细胞性状相关的基因KIT、PSEN2和TFRC,与白细胞性状相关的基因THBS1、CYR61和RPS10。

关键词：猪血液性状数字基因表达谱表达数量性状位点全基因组关联分析候选基因

杜长大猪、二花脸猪和莱芜猪3个群体25种血液性状的全基因组关联分析

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中国农业科学 2016年第4期49卷 739-753页

作者：刘晨龙杨慧张慧张志燕段艳宇江西农业大学省部共建猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室

【目的】利用全基因组关联分析定位影响杜长大猪（DLY）、二花脸猪（EHL）和莱芜猪（LW）3个群体25种血液性状的染色体位点,为最后鉴定影响这些性状的因果基因提供前期基础,同时为猪抗病育种和生产提供参考。【方法】将610头杜长大三元... 详细信息

【目的】利用全基因组关联分析定位影响杜长大猪（DLY）、二花脸猪（EHL）和莱芜猪（LW）3个群体25种血液性状的染色体位点,为最后鉴定影响这些性状的因果基因提供前期基础,同时为猪抗病育种和生产提供参考。【方法】将610头杜长大三元杂猪在（180±5）日龄,336头二花脸猪和333头莱芜猪在（300±5）日龄进行统一屠宰。收集2 m L血液于抗凝管中,利用全自动生化分析仪进行25种血液性状的血常规检测。采集猪耳组织提取DNA并测浓度和质量。将质检合格的DNA样品利用Illumina 60K SNP芯片进行基因型判定。运用PLINK软件对判型结果进行质量控制,将合格的SNP标记用于后续的关联分析。使用R语言Gen ABEL软件包中的广义混合线性模型进行全基因组关联分析,定位影响3个群体25种血常规性状的显著性染色体位点。据全基因组关联分析结果,在Ensembl或NCBI网站上搜寻潜在的位置候选基因。【结果】杜长大猪、二花脸猪和莱芜猪三个群体通过质控的有效表型数据个体数分别为552头、325头和281头。60K SNPs经过质量控制过后,杜长大猪剩余56 216SNPs,莱芜猪剩余49 343 SNPs,二花脸猪剩余35 974 SNPs,用于Meta分析的SNPs共有32 967。运用全基因组关联分析和Meta分析共定位到610个显著影响3个群体25种血液性状的SNPs,其中135个SNPs达基因组显著水平,475个SNPs达建议水平;分布在所有染色体上。在杜长大猪中共鉴别到32个基因组显著水平SNPs以及85个建议水平SNPs,且8种性状有基因组显著水平的SNPs,分别是淋巴细胞数目（LYM）、淋巴细胞比率（LYMR）、嗜碱性粒细胞数目（BAS）、嗜碱性粒细胞比率（BASR）、平均红细胞体积（MCV）、红细胞分布宽度变异系数（RDW;V）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）和血小板分布宽度（PDW）。在二花脸猪中共鉴别到33个基因组显著水平SNPs以及139个建议水平SNPs,且9种性状有基因组显著水平的SNPs,分别是LYM、MCH、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、单核细胞数目（MON）、单核细胞比率（MONR）、平均血小板体积（MPV）、中性粒细胞比率（NEUR）、大血小板细胞（P;CC）以及血小板压积（PCT）。在莱芜猪中共鉴别到54个基因组显著水平SNPs以及169个建议水平SNPs,且6种性状有基因组显著水平的SNPs,分别是BASR、红细胞压积（HCT）、MCH、MCHC、MCV和红细胞数目（RBC）。在Meta分析结果中,共鉴别到16个基因组显著水平SNPs以及82个建议水平SNPs,且6种性状有基因组显著水平SNPs,分别是RBC、HCT、MCH、MCHC、MCV以及MON。通过在Ensembl或NCBI网站上搜寻最强相关SNP区域内的候选基因,初步将F13A1、SPTA1、DBNL、SLC25A28、CTSC基因分别确定为影响BASR、HCT、LYM、MCHC、NEUR的重要候选基因。【结论】通过全基因组关联分析和Meta分析共得到610个显著影响杜长大猪、二花脸猪和莱芜猪3个群体25种血液性状的SNP位点,初步确定F13A1、SPTA1、DBNL、SLC25A28和CTSC基因分别是BASR、HCT、LYM、MCHC和NEUR的重要位置候选基因,为解析商业猪和纯种地方猪的血液性状或免疫性疾病提供重要参考。

关键词：猪血液性状全基因组关联分析候选基因