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脊尾白虾Duox基因鉴定及其免疫功能的初步研究

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大连海洋大学学报 2024年

作者：刘德雪范梦昊程伟涛曹宴榕韩婉钰胡广伟江苏海洋大学江苏省海洋生物资源与环境重点实验室/江苏省海洋生物技重点实验室江苏海洋大学江苏省海洋生物产业技术协同创新中心

双氧化酶(dual oxidase， Duox)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）氧化酶(NOX)家族的成员之一，在机体活性氧(reactive oxygen species， ROS)产生、生物钟调节、免疫应答等多种生命活动中均发挥重要功能。为了探究Duox基因在脊尾白虾中... 详细信息

双氧化酶(dual oxidase， Duox)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）氧化酶(NOX)家族的成员之一，在机体活性氧(reactive oxygen species， ROS)产生、生物钟调节、免疫应答等多种生命活动中均发挥重要功能。为了探究Duox基因在脊尾白虾中的免疫功能，本研究从脊尾白虾中成功克隆获得Duox基因cDNA序列，并对其编码的氨基酸序列进行了分析。在此基础上采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)，分析该基因的组织表达特征及其在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染后表达变化情况。最后基于RNA干扰技术分析了脊尾白虾Duox基因敲降后感染副溶血弧菌的死亡率。研究结果显示，脊尾白虾Duox基因编码区序列长度为4 518 bp，编码1 505个氨基酸，具有双氧化物酶典型结构特征。Duox基因在脊尾白虾不同组织中均有表达，且在鳃组织中表达最高。副溶血弧菌感染后，Duox基因在鳃组织中的表达量显著上升(P<0.05)。注射siRNA试剂后用副溶血弧菌感染，与对照组相比，干扰组脊尾白虾的存活率显著降低(P<0.05)。以上研究表明，Duox基因在脊尾白虾抵御病原菌感染的免疫反应中发挥作用，为进一步探究Duox在脊尾白虾中的免疫功能和作用机制奠定了理论基础。

关键词：脊尾白虾 Duox基因免疫功能 RNAi

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复方蒙药广枣-肉豆蔻片的制备与质量控制

科学技术与工程 2024年第9期24卷 3632-3637页

作者：孔伟浩孙帅陆禹河徐达峰殷佳伟张锦原秦昆明高珣江苏海洋大学药学院江苏省海洋生物资源与环境重点实验室江苏省海洋生物产业技术协同创新中心连云港222005

研究了广枣-肉豆蔻片的制备过程并对其质量进行控制。基于《中国药典》(2020年版)片剂项要求,考察片剂的外观性状、硬度、崩解时限、重量差异及脆碎度;采用高效液相色谱法测定广枣-肉豆蔻片中4种抗氧化成分的含量。结果表明,片剂外表光... 详细信息

研究了广枣-肉豆蔻片的制备过程并对其质量进行控制。基于《中国药典》(2020年版)片剂项要求,考察片剂的外观性状、硬度、崩解时限、重量差异及脆碎度;采用高效液相色谱法测定广枣-肉豆蔻片中4种抗氧化成分的含量。结果表明,片剂外表光滑,色泽均匀,硬度值处于30~40 N,崩解时限控制在10 min内,脆碎度小于1%;槲皮素、原儿茶酸、甲基丁香酚、肉豆蔻醚分别在0.16~0.8μg/mL(r=0.999)、4~20μg/mL(r=0.999)、8~40μg/mL(r=0.999)、100~500μg/mL(r=0.999)内呈良好的线性关系,平均回收率分别为99.3%、101.6%、100.3%、99.3%。且方法学验证项下精密度、稳定性和重复性试验的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)数值均未超过2%。该含量测定方法操作简便、专属性强、结果准确可靠,可为复方蒙药广枣-肉豆蔻片的质量标准提供参考。

关键词：蒙药广枣-肉豆蔻片质量高效液相色谱

产右旋糖酐酶Marinimicrobium sp.G1的筛选、酶性质及产物研究

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食品科技 2021年第5期46卷 25-32页

作者：胡杰刘鑫祖航天包瑞璇吕明生王淑军江苏海洋大学海洋资源与环境重点实验室/海洋生物技术重点实验室江苏省海洋生物产业技术协同创新中心江苏连云港222005

从海洋样品中筛选产右旋糖酐酶新颖的菌株。采用透明圈法从近海海泥中筛选到一株产右旋糖酐酶的菌株G1,根据16S rDNA基因序列、形态学和生理生化指标,鉴定为Marinimicrobium sp.。该菌产酶的最适碳源和氮源分别为蔗糖和鱼粉蛋白胨,在初... 详细信息

从海洋样品中筛选产右旋糖酐酶新颖的菌株。采用透明圈法从近海海泥中筛选到一株产右旋糖酐酶的菌株G1,根据16S rDNA基因序列、形态学和生理生化指标,鉴定为Marinimicrobium sp.。该菌产酶的最适碳源和氮源分别为蔗糖和鱼粉蛋白胨,在初始pH7.5、发酵温度30℃条件下发酵48 h产酶量最高。右旋糖酐酶的相对分子质量约为70 ku,最适温度为40℃,最适pH值为5.5;在5 mmol/L浓度条件下,Co^(2+)、K^(+)、Mn^(2+)、Sr^(2+)、Ca^(2+)、Na^(+)等离子对该酶活性有显著促进作用。经高效液相色谱(HPLC)检测,15 min的酶解产物中异麦芽三糖和异麦芽六糖的含量分别为43.8%和36.5%。检测了酶解产物的抗氧化活性,清除羟自由基的IC_(50)为2 mg/mL,清除超氧阴离子IC_(50)为10 mg/mL。该酶在食品工业特别是益生元的生产中具有较好的应用潜力。

关键词： Marinimicrobium sp. 右旋糖酐酶酶学性质酶解产物抗氧化活性

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两侧对称动物左右不对称发生机制研究进展

遗传 2023年第6期45卷 488-500页

作者：邢超凡王闽涛王磊申欣江苏海洋大学江苏省海洋生物资源与环境重点实验室/江苏省海洋生物技术重点实验室连云港222005 江苏海洋大学江苏省海洋生物产业技术协同创新中心连云港222005

左右不对称是两侧对称动物的重要特征,其形成机制一直是发育生物学领域备受关注的科学问题之一。脊椎动物的左右不对称发生经过3个重要阶段:左右对称性的打破,左右不对称信号的建立和维持,以及左右不对称器官的形态发生。多数脊椎动物... 详细信息

左右不对称是两侧对称动物的重要特征,其形成机制一直是发育生物学领域备受关注的科学问题之一。脊椎动物的左右不对称发生经过3个重要阶段:左右对称性的打破,左右不对称信号的建立和维持,以及左右不对称器官的形态发生。多数脊椎动物在胚胎发育阶段依赖纤毛产生定向液流打破胚胎的左右对称性,随后建立Nodal-Pitx2左右不对称信号,最后由Pitx2等基因指导左右不对称器官的形态发生过程。无脊椎动物中存在不依赖纤毛介导的Nodal-Pitx不对称信号表达机制,甚至具有完全独立的左右不对称发育机制。本文结合最新的左右不对称器官发育机制的研究进展,综述了脊椎动物和无脊椎动物胚胎左右不对称的发生过程及相关基因和信号通路,有助于深入理解左右不对称器官发育的过程,以期为追溯左右不对称器官发育机制的起源演化提供参考。

关键词：两侧对称动物左右不对称发育起源演化

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大菱鲆肠道乳杆菌Lactobacillus sp.N5的筛选鉴定及其抑制水产病原菌的研究

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水产学杂志 2023年第3期36卷 38-45页

作者：包瑞璇周皓隆方再郗卢静吕明生王淑军江苏海洋大学海洋生物资源与环境重点实验室/海洋生物技术重点实验室江苏连云港225005 江苏省海洋生物产业技术协同创新中心江苏连云港222000

从大菱鲆(Scophthalmus maximus)肠道内分离出8株乳酸菌,经16S rDNA鉴定为Lactobacillus sp.,以对水产病原菌的抑制和对抗生素的敏感性为指标,研究乳酸菌的特性。其中,菌株N5对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(***)、副溶血弧菌... 详细信息

从大菱鲆(Scophthalmus maximus)肠道内分离出8株乳酸菌,经16S rDNA鉴定为Lactobacillus sp.,以对水产病原菌的抑制和对抗生素的敏感性为指标,研究乳酸菌的特性。其中,菌株N5对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(***)、副溶血弧菌(***)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)均具有较强的抑制作用,对氨苄青霉素、庆大霉素和罗红霉素敏感。菌株N5发酵上清液经加热、排酸和过氧化氢酶处理后,仍有抑菌作用;经蛋白酶处理后失去抑菌能力,推测菌株N5分泌的抑菌物质为耐热的乳酸菌素,其可以抑制病原菌生物膜的形成。菌株N5在凡纳对虾(Litopenaeus vannamei)肠道定植5 d后,加入鳗弧菌和哈维氏弧菌,继续养殖7 d,死亡率显著降低。本研究结果可为菌株N5制备水产养殖益生菌剂提供实验依据。

关键词：乳酸菌大菱鲆水产病原菌凡纳滨对虾鳗弧菌

利用短短芽孢杆菌进行酮还原酶CgKR2的高效表达与纯化

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中国生物工程杂志 2019年第8期39卷 59-65页

作者：胡艳红龚雪梅丁柳柳高嵩李婷婷淮海工学院江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室连云港222005 淮海工学院江苏省海洋生物产业技术协同创新中心连云港222005

酮还原酶CgKR2能够一步还原前手性羰基化合物生成高附加值的手性醇,有望解决手性醇传统制备方法的步骤烦琐和高成本问题,具有很高的经济效益。研究表明,CgKR2催化底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)生成普利类降压药的重要中间体(R)-2-羟... 详细信息

酮还原酶CgKR2能够一步还原前手性羰基化合物生成高附加值的手性醇,有望解决手性醇传统制备方法的步骤烦琐和高成本问题,具有很高的经济效益。研究表明,CgKR2催化底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)生成普利类降压药的重要中间体(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯[(R)-HPBE]具有良好效果。但CgKR2的生产成本高昂、过程烦琐。利用短短芽孢杆菌胞外分泌表达酮还原酶CgKR2,获得该酶的高效表达,并经简便的一步镍亲和层析纯化,即获得高纯度酮还原酶CgKR2,产率高达每升发酵7. 8mg纯酶。以酶标板法测定其比活力、温度稳定性以及动力学参数等基本酶学性质,结果显示,CgKR2的比活力为(78. 32±7. 62) U/mg、Km为(0. 2±0. 02) mmol/L、Vmax为(117. 64±3. 6)μmol/(min·mg)、Kcat为73s^-1,与以往报道的数据一致,并且获得的CgKR2纯酶在30℃下孵育72h依然保持80%的活性,酶活的稳定性远好于以往的制备方法。开发出的一套简便高效的酮还原酶CgKR2表达纯化工艺,降低了生产成本、简化了生产工艺,可推进手性醇生物催化制备的普及,对其他生物催化工程酶的制备方法研究也有借鉴作用。

关键词：酮还原酶CgKR2 短短芽孢杆菌分泌表达生物催化

半滑舌鳎乙酰辅酶A羧化酶α基因全长cDNA分子克隆及饲料脂肪水平对其在肝脏中表达的影响

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动物营养学报 2016年第2期28卷 485-497页

作者：张夏青许建和潘茜易乐飞彭永兴申欣阎斌伦高焕王雯祥程汉良淮海工学院连云港222005 江苏省海洋生物产业技术协同创新中心连云港222005 浙江省淡水水产研究所湖州313001

本试验采用反转录PCR(RT-PCR)和c DNA末端快速扩增(RACE)技术从半滑舌鳎肝脏中克隆了乙酰辅酶A羧化酶α(ACC1)基因全长c DNA,并采用实时荧光定量PCR方法对半滑舌鳎ACC1基因在肠道、肝脏、肌肉、卵巢、脾脏、全脑、肾脏、心脏、肠系膜脂... 详细信息

本试验采用反转录PCR(RT-PCR)和c DNA末端快速扩增(RACE)技术从半滑舌鳎肝脏中克隆了乙酰辅酶A羧化酶α(ACC1)基因全长c DNA,并采用实时荧光定量PCR方法对半滑舌鳎ACC1基因在肠道、肝脏、肌肉、卵巢、脾脏、全脑、肾脏、心脏、肠系膜脂肪等组织中的表达进行了研究;此外,还研究了饲料脂肪水平对半滑舌鳎肝脏中ACC1基因表达的影响。结果表明:1)半滑舌鳎ACC1基因c DNA全长7 811 bp,含1个7 074 bp的开放阅读框,编码2 357个氨基酸,ACC1蛋白计算分子质量为266 ku,等电点为6.42。半滑舌鳎ACC1氨基酸序列保守位点包括1个ATP结合位点(Gly^(316)~Gly^(321))、1个生物素结合位点(Val^(785)-Met^(786)-Lys^(787)-Met^(788))、1个辅酶A结合位点(Ser^(1969)~Val^(1995))。此外,半滑舌鳎ACC1基因存在可变剪接,形成另外2个同工型(isoforms),与分子质量为266 ku的ACC1相比,分别少8和15个氨基酸。2)半滑舌鳎所有组织中均检测到ACC1基因的表达,肝脏和全脑中ACC1 mRNA相对表达量显著高于其他组织(P0.05)。综上,本试验克隆出了半滑舌鳎ACC1基因的全长c DNA,并得出半滑舌鳎ACC1蛋白的主要功能位点为ATP结合位点、生物素结合位点、辅酶A结合位点,与其他脊椎动物相比基本保守。半滑舌鳎ACC1基因主要在肝脏和全脑等生脂组织中表达,饲料中添加鱼油显著抑制其肝脏中ACC1基因的表达,且抑制作用与鱼油添加量呈正相关。

关键词：半滑舌鳎乙酰辅酶A羧化酶α 分子克隆营养调控组织表达

限制性内切酶Bsa I的分离纯化与结晶及其硒代衍生物的制备

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食品工业科技 2023年第22期44卷 110-116页

作者：朱海郑梦泽贾玮玮周倩谈帅刘子昂张传志王伟玲李婷婷江苏海洋大学江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室江苏连云港222005 江苏省海洋生物产业技术协同创新中心江苏连云港222005 正大天晴药业集团股份有限公司江苏连云港222005

目的:筛选并优化限制性内切酶Bsa I的三维结构样品制备的方法。方法:本课题采用大肠杆菌表达系统表达Bsa I蛋白及其硒代衍生物。首先构建重组表达载体pBAD-Bsa I,转化到大肠杆菌(***)ER2566中进行表达,并采用亲和层析和阴离子交换层析... 详细信息

目的:筛选并优化限制性内切酶Bsa I的三维结构样品制备的方法。方法:本课题采用大肠杆菌表达系统表达Bsa I蛋白及其硒代衍生物。首先构建重组表达载体pBAD-Bsa I,转化到大肠杆菌(***)ER2566中进行表达,并采用亲和层析和阴离子交换层析进行纯化。然后利用质谱、圆二色谱的方法测试硒代蛋白衍生情况,并对其进行酶活测定。最后采用坐滴法进行初步的晶体生长研究。结果:通过两步纯化方法获得了纯度大于90%的重组Bsa I和Se-Bsa I硒代蛋白;经质谱检测发现重组Se-Bsa I蛋白中的11个甲硫氨酸全部硒代,圆二色谱检测和酶活测试确定了硒代对Bsa I蛋白的结构和活性无明显影响。结晶实验显示重组Bsa I蛋白不仅可以在0.2 mol/L酸镁四水合物、pH6.5的0.1 mol/L二甲胂酸钠三水合物、20%聚乙二醇8000的条件下生长出颗粒状结晶,而且可以在pH4.6的0.1 mol/L三水醋酸钠、2 mol/L硫酸铵的条件下生长出球状结构晶体。结论:本研究成功实现了BsaI蛋白及其硒代蛋白的重组表达,并对蛋白晶体条件进行初筛,旨为解析BsaI蛋白三维结构提供一定的参考。

关键词：限制性内切酶表达纯化硒代结晶

海洋细菌Catenovulum ***03两个右旋糖酐酶差异分析

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食品与生物技术学报 2021年第10期40卷 72-81页

作者：田小鹏邓甜董冬雪祖航天吕明生王淑军江苏海洋大学江苏省海洋生物资源与环境重点实验室江苏连云港222005 江苏海洋大学江苏省海洋生物技术重点实验室江苏连云港222005 江苏海洋大学江苏省海洋生物产业技术协同创新中心江苏连云港222005

右旋糖酐酶是一类能够专一性水解右旋糖酐α-(1,6)糖苷键的糖苷水解酶,在食品工业以及龋齿的防治方面都有着重要的应用,其主要来源于微生物。提取海洋细菌Catenovulum ***03的基因组并测序,从中挖掘编码右旋糖酐酶的基因,在大肠杆菌中... 详细信息

右旋糖酐酶是一类能够专一性水解右旋糖酐α-(1,6)糖苷键的糖苷水解酶,在食品工业以及龋齿的防治方面都有着重要的应用,其主要来源于微生物。提取海洋细菌Catenovulum ***03的基因组并测序,从中挖掘编码右旋糖酐酶的基因,在大肠杆菌中进行异源表达,并对重组右旋糖酐酶性质进行比较分析。海洋细菌Catenovulum ***03中含有两个编码右旋糖酐酶的基因GL002870与GL002872,其大小分别为2511 bp和2805 bp;编码的蛋白质Cadex2870与Cadex2872的3D结构与AoDex的结构相似,AoDex的催化区域Q418-D440分别对应Cadex2870的Q431-D453以及Cadex2872的Q425-D447。Cadex2870与Cadex2872的比酶活分别16.2 U/mg和4 U/mg,最适催化温度分别为45℃与30℃,最适催化pH分别为7和8;Cadex2870水解右旋糖酐的产物为异麦芽七糖、异麦芽五糖、异麦芽四糖以及少量异麦芽糖;Cadex2872水解右旋糖酐的产物为异麦芽七糖、异麦芽五糖以及异麦芽四糖。证实海洋细菌Catenovulum ***03中含有两个编码右旋糖酐酶的基因,这两个右旋糖酐酶的蛋白质结构以及酶学性质均有差异。

关键词： Catenovulum sp.DP03 右旋糖酐酶克隆表达