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免疫增强剂CVC1302调控体细胞高频突变的机制研究

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华中农业大学学报 2025年第1期44卷 211-216页

作者：杜露平鲁海燕侯立婷于晓明程海卫张元鹏陈瑾郑其升侯继波江苏省农业科学院动物免疫工程研究所/国家兽用生物制品技术创新中心/江苏省食品质量安全重点实验室南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300

为探究CVC1302调控生发中心B细胞发生体细胞高频突变的免疫机制,本研究将4-羟基-3-硝基苯乙酰基耦联鸡卵白蛋白(NP-OVA)混合免疫增强剂CVC1302后,利用ISA206乳化获得疫苗。BALB/c小鼠分为2组,分别后腿肌肉注射NP-ISA206和NP-CVC1302-ISA... 详细信息

为探究CVC1302调控生发中心B细胞发生体细胞高频突变的免疫机制,本研究将4-羟基-3-硝基苯乙酰基耦联鸡卵白蛋白(NP-OVA)混合免疫增强剂CVC1302后,利用ISA206乳化获得疫苗。BALB/c小鼠分为2组,分别后腿肌肉注射NP-ISA206和NP-CVC1302-ISA206,每只50μg NP-OVA,免疫后14 d,利用流式分选获得生发中心B细胞,利用巢氏PCR扩增B细胞免疫球蛋白序列可变区VH_(186.2),Western blot检测诱导活化的胞苷脱氨酶(AID)、Pax5表达水平,β-actin作为内参,比较组间AID、Pax5表达差异;利用荧光定量PCR检测AID、Pax5基因转录水平。试验结果显示:CVC1302显著诱导生发中心B细胞免疫球蛋白序列VH186.2突变频率,试验组W33L突变频率为62.2%,而对照组仅为20.25%;CVC1302可提升AID蛋白、Pax5蛋白表达水平,其中试验组AID蛋白相对表达水平为0.72,对照组仅为0.16,试验组Pax5蛋白相对表达水平为0.62,对照组仅为0.26;CVC1302增强AID基因、Pax5基因转录水平,相较于对照组分别提高2.36、4.13倍。推断CVC1302依赖Pax5介导AID表达,调控生发中心B细胞发生体细胞高频突变。

关键词：免疫增强剂CVC1302 体细胞高频突变免疫机制生发中心B细胞胞苷脱氨酶 Pax5

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鞭毛蛋白的表达及其免疫增强效力评价

中国动物传染病学报 2025年

作者：侯立婷刘昆昆安俊星于晓明秦竹杜露平张元鹏陈瑾郑其升江苏省农业科学院动物免疫工程研究所江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心省部共建国家重点实验室培育基地—江苏省食品质量安全重点实验室南京农业大学动物医学院

本研究旨在研制安全高效的兽用疫苗免疫增强剂，为免疫增强剂的开发奠定基础。首先通过参考伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因序列，设计并构建了全长鞭毛蛋白FliC和删除D2和D3高变区的鞭毛蛋白FliC△D2D3的表达载体。然后利用原核表达系统表达... 详细信息

本研究旨在研制安全高效的兽用疫苗免疫增强剂，为免疫增强剂的开发奠定基础。首先通过参考伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因序列，设计并构建了全长鞭毛蛋白FliC和删除D2和D3高变区的鞭毛蛋白FliC△D2D3的表达载体。然后利用原核表达系统表达这两种蛋白，并进行纯化与鉴定。获得这两种蛋白后，进一步检测这两种蛋白体外对DC2.4细胞的TLR 5的激活和相关细胞因子的表达情况，并对其在PEDV疫苗上的免疫增强效力进行了评价。结果表明，1)两种蛋白在原核表达系统中均以可溶形式表达；2)添加鞭毛蛋白刺激后，DC 2.4细胞中TLR5及相关细胞因子的表达水平显著提高；3)FliC和FliC△D2D3均能显著提高小鼠和仔猪免疫后的PEDV特异性的IgG抗体水平，其中FliC△D2D3的免疫效果优于全长的FliC。该研究不仅有助于了解鞭毛蛋白FliC在免疫调节中的作用，也为基于鞭毛蛋白的免疫增强剂的开发提供了基础。

关键词：鞭毛蛋白FliC、FliC 免疫增强剂 PEDV

1株血清2型副猪嗜血杆菌的分离鉴定及致病性研究

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中国畜牧兽医 2025年第2期52卷 901-911页

作者：李倩文华涛常晨颜星宇李军星唐波江苏省农业科学院动物免疫工程研究所南京210014 国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所杭州310021

[目的]明确浙江地区某猪场副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)感染情况,明确分离株的血清型、生物学特性及致病性,为临床控制副猪嗜血杆菌提供理论参考。[方法]从发病猪的肺脏、心脏血液、关节液等病料中分离、纯化菌株,并对其进... 详细信息

[目的]明确浙江地区某猪场副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)感染情况,明确分离株的血清型、生物学特性及致病性,为临床控制副猪嗜血杆菌提供理论参考。[方法]从发病猪的肺脏、心脏血液、关节液等病料中分离、纯化菌株,并对其进行革兰染色镜检、16S rRNA基因PCR扩增及测序,明确分离株的血清型,检测分离株携带毒力基因情况、对常见抗菌药物的敏感性及对小鼠的致病性,使用饱和硫酸铵法提取菌株分泌蛋白,并通过电泳分析蛋白主要富集区域。[结果]分离株在TSA培养基上生长出圆形、光滑湿润、颜色灰白、边缘整齐的针尖大小的菌落;接种至TSB培养基后,1~3 h生长缓慢,3~4 h进入对数生长期,4~12 h进入生长稳定期;革兰染色镜检呈红色短杆状、长杆状,长度不等,疑似副猪嗜血杆菌。16S rRNA基因PCR扩增结果显示,出现680 bp的特异性条带,与预期相符。血清型鉴定结果显示,检测到2型血清型副猪嗜血杆菌特异性条带。BLAST比对显示该分离株为血清2型副猪嗜血杆菌。毒力基因检测结果显示,分离株携带cdtA、cdtB、cdtC、vtaA1、rfaD、rfaE、gnd、cpaD、espP2、vacJ、rfaF、vtaA2、htrA和ompP2基因。该菌株以1.0×10^(9) CFU/mL剂量感染BALB/c小鼠,在5~10 h出现死亡,并引起小鼠肝脏细胞核浓缩、坏死,肺泡腔内有大量浆液性渗出物,混有红细胞和菌体,脾脏组织炎性细胞浸润。药敏试验结果显示,分离株对头孢哌酮、头孢呋辛钠、哌拉西林、青霉素等药物耐药,对氯霉素表现中介,对环丙沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素等药物敏感。该菌株分泌蛋白大小主要集中在25~180 ku。[结论]本研究分离鉴定获得1株血清2型副猪嗜血杆菌,该分离株编码多种毒力基因,具有致病性,对多种常用抗菌药物有明显的耐药性,并分泌多种蛋白。试验结果提示该猪场可使用喹诺酮类、大环内酯类及氨基糖苷类药物进行防控。

关键词：副猪嗜血杆菌血清型分离鉴定致病性

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免疫增强剂CVC1302介导Tfh细胞分化机制分析

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中国农业大学学报 2025年第1期30卷 179-187页

作者：杜露平鲁海燕李明举侯立婷于晓明程海卫张元鹏秦竹李兰张浩明杨利王义伟陈瑾郑其升侯继波江苏省农业科学院动物免疫工程研究所/国家兽用生物制品技术创新中心/江苏省食品质量安全重点实验室南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心江苏泰州225300 烟台市动物疾病预防与控制中心山东烟台264033

为探究CVC1302调控滤泡辅助性T细胞(Tfh)分化的机制,本研究体外利用GM-CSF刺激培育小鼠骨髓树突状细胞(DC),CVC1302刺激后,分别检测IL-6、IL-21转录及表达水平;利用体外细胞共培养试验,检测Tfh、Th1、Th2和Th17分化关键转录因子Bcl-6、T... 详细信息

为探究CVC1302调控滤泡辅助性T细胞(Tfh)分化的机制,本研究体外利用GM-CSF刺激培育小鼠骨髓树突状细胞(DC),CVC1302刺激后,分别检测IL-6、IL-21转录及表达水平;利用体外细胞共培养试验,检测Tfh、Th1、Th2和Th17分化关键转录因子Bcl-6、T-bet、GATA3和RORγt的转录水平,STAT3信号通路活化水平,Tfh细胞占CD4^(+)T细胞比例及STAT3信号通路抑制后反向验证Tfh细胞占CD4^(+)T细胞比例。结果表明:1)免疫增强剂CVC1302极显著促进小鼠骨髓DC分泌IL-6和IL-21。2)细胞共培养试验显示,CVC1302可显著促进STAT3磷酸化水平,表明STAT3信号通路被激活。3)利用STAT3信号通路抑制剂后,CD4^(+)T细胞分化为Tfh细胞的水平显著降低,表明CVC1302依赖STAT3信号通路激活介导初始CD4+T细胞分化为Tfh细胞。综上,本研究推断CVC1302通过促进DC分泌IL-6和IL-12,并激活STAT3信号通路介导Tfh细胞的分化,旨在为后续免疫增强剂的开发提供思路。

关键词： CVC1302 DC STAT3 Tfh细胞

基因工程抗体功能修饰及其在农业食品安全中的应用策略

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中国农业科学 2025年第2期58.0卷 355-386页

作者：徐重新沈建兴金嘉凤何鑫谢雅晶张霄朱庆刘媛刘贤金江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所/省部共建国家重点实验室培育基地—江苏省食品质量安全重点实验室江苏大学食品与生物工程学院

基因工程抗体是抗体人工定向设计的巨大飞跃，其以重组抗原结合片段、单链抗体、纳米抗体等形式，广泛渗透应用到农业和食品安全中的各个领域；相关创新探索研究还在竞先推进，发展极为迅速。本文总结了当前基因工程抗体主要衍生形式及... 详细信息

基因工程抗体是抗体人工定向设计的巨大飞跃，其以重组抗原结合片段、单链抗体、纳米抗体等形式，广泛渗透应用到农业和食品安全中的各个领域；相关创新探索研究还在竞先推进，发展极为迅速。本文总结了当前基因工程抗体主要衍生形式及其依托的噬菌体、酵母、细菌、核糖体、哺乳动物细胞等抗体库搭载展示平台和相应配套的抗原特异性抗体靶向筛选体系；分析它们借助定点突变、链置换、易错PCR、DNA改组以及同源或异源抗体功能片段甚至与其他功能蛋白融合等策略，在体外开展亲和力成熟乃至提升环境胁迫稳定性等特性功能修饰的关键技术特点；概述它们采用昆虫和动物细胞、植物组织、酵母、大肠杆菌以及其他微生物等表达体系制备相应抗体蛋白状况和潜在优化策略。着重梳理基因工程抗体在产地环境危害物、农兽药投入品、真菌毒素、食源性致病微生物及其有毒代谢物、食源性过敏原等农业食品安全危害物免疫分析上的应用研究现状；同时结合笔者团队近年以Ab2β抗独特型抗体具备模拟抗原结构乃至生物活性功能的特性为理论依据，在模拟Bt Cry毒素结构及抗虫功能的Ab2β抗独特型基因工程抗体和模拟万古霉素抗金黄色葡萄球菌功能的Ab2β抗独特型基因工程抗体等方面创新研发的系列最新成果和相关研究经验，进一步探讨了基因工程抗体在农业食品安全危害物绿色检测和绿色防控创新应用策略研究上的未来发展动向和可行捷径，为基因工程抗体在农业食品安全乃至营养品质评估等领域相关应用研究提供最新最全面的具有参考价值的文献资料和潜在启发思路。

关键词：基因工程抗体抗体亲和成熟抗体蛋白表达免疫检测抗独特型抗体杀虫抗体杀菌抗体

囊素肽接枝透明质酸聚合物的制备及其免疫增强活性研究

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中国农业大学学报 2025年第1期30卷 172-178页

作者：李兰杜露平李明举陈瑾张元鹏侯立婷秦竹郑其升江苏省农业科学院动物免疫工程研究所南京210014 江苏省食品质量安全重点实验室国家重点实验室培育基地南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心江苏泰州225300 烟台市动物疾病预防控制中心山东烟台264033

为使囊素肽(Bursin,BS)更好地发挥免疫增强作用,本研究采用EDC/NHS反应,使透明质酸(Hyaluronic acid,HA)的羧基与囊素肽的氨基发生酰胺化反应,合成囊素肽接枝透明质酸聚合物(BS@HA),进一步通过傅里叶变换红外光谱鉴定聚合物的结构,通过... 详细信息

为使囊素肽(Bursin,BS)更好地发挥免疫增强作用,本研究采用EDC/NHS反应,使透明质酸(Hyaluronic acid,HA)的羧基与囊素肽的氨基发生酰胺化反应,合成囊素肽接枝透明质酸聚合物(BS@HA),进一步通过傅里叶变换红外光谱鉴定聚合物的结构,通过紫外分光光度计进行定量分析,然后以卵清蛋白OVA为模式抗原,BS@HA作为免疫增强剂添加至铝胶做成疫苗,免疫小鼠,利用ELISA和流式细胞仪评价BS@HA的免疫增强作用。结果表明:1)当透明质酸、EDC、NHS和囊素肽的反应摩尔比为1∶4∶6∶0.4,加入EDC后的反应时间为2~4 h,加入NHS后的反应时间为16 h时,合成聚合物的产率可以达到95%,透明质酸的傅里叶红外光谱特征峰从1605 cm^(-1)红移到1632 cm^(-1),囊素肽成功接枝透明质酸。2)当透明质酸羧基取代率为35%左右时,囊素肽接枝透明质酸聚合物可以诱导小鼠产生更高水平的OVA特异性抗体。3)囊素肽接枝透明质酸聚合物能够诱导小鼠产生更高水平的滤泡辅助性T细胞(TFH)和生发中心B细胞(GC B细胞)。综上,囊素肽接枝透明质酸聚合物可以使囊素肽更高效地进入引流淋巴结,诱导活化更高水平的TFH和GC B细胞,促进特异性Ig G抗体的产生。本研究将丰富透明质酸在动物疫苗领域的理论研究,拓展透明质酸在动物疫苗领域的实际应用,同时为新型免疫增强剂的研制奠定基础。

关键词：透明质酸囊素肽免疫增强酰胺反应

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海藻糖在猪瘟病毒冻干过程中的保护作用研究

中国兽医科学 2025年

作者：左晓昕尹文竹吕芳赵艳红揭红英卢宇江苏省农业科学院动物免疫工程研究所兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心兽用疫苗分子设计与制剂农业农村部公共研发平台河北农业大学动物医学院

研究旨在探索不同浓度（0、5%、10%、15%和20%）的海藻糖(trehalose)对猪瘟病毒(CSFV)冻干的保护效果和作用机制，通过间接免疫荧光法检测猪瘟冻干制品的效价损失，偏光显微镜观察冰晶形貌，X射线衍射仪、差示量热扫描仪和傅里叶变换红... 详细信息

研究旨在探索不同浓度（0、5%、10%、15%和20%）的海藻糖(trehalose)对猪瘟病毒(CSFV)冻干的保护效果和作用机制，通过间接免疫荧光法检测猪瘟冻干制品的效价损失，偏光显微镜观察冰晶形貌，X射线衍射仪、差示量热扫描仪和傅里叶变换红外光谱仪器对制品结构进行表征。结果显示，添加海藻糖后能降低猪瘟病毒的冻干损失，其中15%的海藻糖保护效果最佳，残水率小于4%。作为冻干保护剂，海藻糖主要通过以下方式保护猪瘟病毒：调节冰晶尺寸与分布，减少冰晶对病毒颗粒的机械损伤，在干燥时其高玻璃化转变温度让制品形成无定形态糖玻璃结构，还能与亲水基团结合，起到替代部分水分子的作用，维持病毒结构的稳定性。

关键词：海藻糖猪瘟病毒真空冷冻干燥玻璃转变温度水合作用

疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶LipA在毕赤酵母中的重组表达及产量优化

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动物营养学报 2025年第02期 1365-1375页

作者：郑毅恒侯颖赵仕达成莉凤李炳坤李丁河南科技大学食品与生物工程学院江苏省农业科学院动物免疫工程研究所中国农业科学院麻类研究所江西农业大学生物科学与工程学院

本研究将来源于疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶LipA在毕赤酵母中进行高效表达，并通过多拷贝构建、共表达分子伴侣、高密度发酵等策略对其产量进行优化。首先，在毕赤酵母中对疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶LipA进行异源表达，并对表达产物进行纯化... 详细信息

本研究将来源于疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶LipA在毕赤酵母中进行高效表达，并通过多拷贝构建、共表达分子伴侣、高密度发酵等策略对其产量进行优化。首先，在毕赤酵母中对疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶LipA进行异源表达，并对表达产物进行纯化和酶学性质分析；接着，通过构建多拷贝酵母菌株提高目的基因的转录水平，通过共表达分子伴侣改善蛋白的折叠与运输，通过高密度发酵进一步挖掘酵母菌株的生产潜能。结果显示：LipA的最适pH为9，最适温度为50℃。LipA在温度和pH方面都具有良好的稳定性，非常适合作为饲料添加剂使用。含有2个拷贝菌株的2-α-LipA具有最高的LipA产量，酶活力可达2 453.63 U/mL，与单拷贝菌株1-α-LipA的1 753.69 U/mL相比提高了39.9%(P所述，本研究成功利用毕赤酵母对疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶LipA进行了异源表达，通过综合进行基因剂量优化、共表达分子伴侣和高密度发酵，LipA的最终产量相较于初始产量增加了16.49倍。

关键词：疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因剂量分子伴侣

江苏某牛场犊牛呼吸道病病原检测与牛支原体的分离鉴定

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中国动物传染病学报 2025年

作者：张洪菊程子龙韦艳娜毛立刘茂军牛家强冯志新李文良西藏农牧学院动物科学学院农业农村部西藏包虫病防治重点实验室西藏高原动物疫病研究自治区高校重点实验室江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心

为查明江苏某奶牛场一起犊牛呼吸道疾病的病因，采集发病牛鼻拭子30份，采用RT-PCR/PCR方法对主要病原进行检测。对病毒检测阳性样品进行测序和遗传进化分析。对牛支原体（M. bovis）阳性样本进行分离培养，进而进行生化实验、生长曲线... 详细信息

为查明江苏某奶牛场一起犊牛呼吸道疾病的病因，采集发病牛鼻拭子30份，采用RT-PCR/PCR方法对主要病原进行检测。对病毒检测阳性样品进行测序和遗传进化分析。对牛支原体（M. bovis）阳性样本进行分离培养，进而进行生化实验、生长曲线测定、药敏试验和遗传进化分析。结果表明，***（18份）、溶血性曼氏杆菌（1份）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）（2份）、牛冠状病毒（BCoV）（6份）为阳性，其他病原均为阴性。3株M. bovis生长曲线一致，不发酵葡萄糖、甘露醇，不水解明胶、七叶苷，不分解尿素。3株M. bovis均对泰妙菌素、林可霉素和泰万菌素敏感。序列分析表明3株牛支原体oppF基因序列与各参考株的同源性为98.6%-100%，与国内菌株亲缘关系近；该牛场流行BVDV毒株为BVDV-1a亚型，BCoV毒株属于GIIb亚型。因此，该病例主要由M. bovis引起，伴发BCoV和BVDV，可优先选用泰妙菌素、林可霉素、泰万菌素进行防控，同时应加强病毒性病原的监测与防控。

关键词：牛呼吸道病牛支原体分离鉴定药敏试验进化分析